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Este artigo descreve a utilização de uma plataforma baseada em chip (fig. 1) para o cultivo tridimensional de linhagens celulares, bem como células primárias. Uma vez que muitas células não expressam funções organotípicas somente em um ambiente 3D, temos desenvolvido um chip de polímero que fornece uma plataforma para que as células podem aderir em todas as direções espaciais, e que pode ser montado em uma carcaça de biorreatores para o controle de fluxo de fluido , etc tensão de oxigênio Dependendo do projeto experimental, a superfície do polímero pode ser modificado por várias técnicas, por exemplo, radiação UV, PECVD, γ-enxertia ou química úmida convencional.
Figura 01
1. Desaeração e hydrophilisation do chip
Antes do uso, o chip tem de ser purgada e hydrophilized. Para isso, uma série de álcool é realizada. Soluções de isopropanol composto de 100%, 70%, 50%, 30% isopropanol em DMPC-água tratada estão preparados eo chip é mergulhado em cada concentração, começando com a solução de 100%, para até 30 anos. A etapa final da série é composta por pyrocarbonate Dimetil puro (DMPC) tratados com água. A partir deste ponto, é importante manter o chip molhado.
2. Colágeno I revestimento
Após a série de álcool, o chip é geralmente revestido com uma solução de colágeno I, a partir da cauda de rato. A partir da solução estoque de colágeno de 2 mg / ml em 0,2% de ácido acético uma alíquota correspondente a 30 mg de proteína de colágeno é diluída com água tratada DMPC-a um volume final de 150 mL. Isso resulta em uma camada de colágeno da superfície do chip com uma densidade de 10 de colágeno I mg por cm 2 de superfície.
3. Inoculação de células de carcinoma hepatocelular
Células de carcinoma hepatocelular linha Hep G2 são tripsinizados e contadas. Para experimentos de curta duração (1-6 dias) 5 * 10 6 células são inoculadas em cada chip eo correspondente controle de seis centímetros de tecido placas de cultura de petri. Para inoculte, o chip de 5 * 10 6 células são ressuspendidas em 150 mL meio de cultura e colocado em cima da área do micro-chip (fig. 2). Depois, ele é colocado em uma incubadora por 2-3 horas. Durante este período de incubação do sedimento das células para o micro-recipientes e aderir ao colágeno I-revestido andaime.
Figura 2
4. Inserção do chip dentro do alojamento biorreator
Após o período de incubação, o chip é retirado da incubadora e montado no alojamento biorreator. Para isso, sob a bancada limpa, o biorreator preassembled é removido da embalagem estéril e desmontada em um grau que permite a inserção do chip. O chip é cuidadosamente tratada com pinças esterilizadas e colocado na ranhura que contém a gaxeta que veda o chip e que resulta na geração de um compartimento superior e inferior no biorreator. Então, o biorreator é montado novamente e transferido para a incubadora, onde ele está conectado à bomba, o fornecimento de gás eo analisador de oxigênio.
5. Enchimento do sistema
Assim que o biorreator é conectada ao reservatório de meio, bomba e de fornecimento de gás do loop circulação fechada é preenchida com o meio. Isto é feito posicionando o 3-way-conectores de tal forma que superfusão, que é definido como o fluxo de meio por cima do chip, é alcançado. Isto leva a uma descarga de ar fechado da circulação biorreator sem remover as células do andaime. Depois que o sistema é completamente preenchida com o meio, o 3-way-conectores estão ligados de tal forma que a perfusão, que é definido como o fluxo de baixo para o chip através do tecido, seja alcançado. Na configuração do fluxo de perfusão é ajustado às necessidades da célula, que geralmente varia de hepatócitos 6-50 mL / min.
6. Amostragem
Durante o experimento amostras médio pode ser desenhado. Para isso, seringas são ligados às portas estéril em cima do reservatório de médio porte. Após a amostragem, as portas são esterilizados com isopropanol 70%.
7. Isolamento de células intactas do chip para aplicações downstream
No final do experimento, os biorreatores estão desconectados da fonte de gás ea bomba de rolete, transferido para a bancada limpa e desmontado conforme descrito anteriormente. Com uma pinça estéril, o chip é removido da habitação biorreator, colocadoem um prato de 3,5 centímetros de Petri e lavados com PBS. Depois, o chip é incubada com tripsina / EDTA (0,25% / 0.53mM) por 5-15 min em uma incubadora para separar as células da área microestruturada. A suspensão de células coletadas é centrifugada por 5 min a 600 g. As células podem então ser utilizados para aplicações convencionais de downstream, por exemplo, RNA total ou isolamento de proteínas. Rotineiramente, isolamos RNA total (kit PARIS, Ambion Inc., Austin, Texas, EUA) para análise de microarray e em tempo real de RT-PCR. Expressão da proteína é analisado após a coloração imuno-histoquímica das células dentro do chip com um microscópio de varredura a laser, mas também pode ser analisado de outra forma, por exemplo, por citometria de fluxo.