Modelagem de infecção de vírus Zika do desenvolvimento cérebro humano In Vitro usando células-tronco derivadas de Organoids Cerebral

Summary

Este protocolo descreve uma técnica usada para modelar a infecção de vírus Zika do cérebro humano em desenvolvimento. Usando sua ou linhas de células-tronco projetado, pesquisadores podem usar essa técnica para descobrir os vários mecanismos ou tratamentos que podem afetar o início infecção cerebral e microcefalia resultante em embriões de Zika infectado por vírus.

Abstract

O recente surgimento de vírus Zika (ZIKV) em populações suscetíveis tem levado a um aumento abrupto na microcefalia e outras condições de desenvolvimento neurológico em recém-nascidos. Enquanto os mosquitos são a principal via de transmissão viral, também verificou a espalhar através do contato sexual e transmissão vertical de mãe-para-feto. Neste último caso de transmissão, devido ao tropismo viral exclusivo de ZIKV, o vírus é acredita-se que alvo predominantemente as células progenitoras neurais (NPCs) do cérebro em desenvolvimento.

Aqui um método para modelagem de infecção ZIKV e a resultante microcefalia, que ocorrem quando organoids cerebrais humanos são expostos viver ZIKV é descrito. Os organoids exibir altos níveis de vírus dentro de sua população de progenitoras neurais e morte celular grave e microcefalia para exposições ao longo do tempo. Este modelo de organoides cerebral tridimensional permite que os pesquisadores realizar experimentos de espécie de correspondência para observar e potencialmente intervir com infecção ZIKV do cérebro humano em desenvolvimento. O modelo fornece maior relevância sobre métodos padrão bidimensionais e contém a arquitetura celular humanos específicos e expressão de proteínas que não são possíveis em modelos animais.

Introduction

Vírus Zika (ZIKV) espalhou-se rapidamente na Micronésia, Polinésia francesa e nas Américas e recentemente tem sido mostrado para atravessar a barreira placentária^1,2 para infectar o cérebro fetal em desenvolvimento, levando a doenças neurológico tais como microcefalia^3,4,5,6 . O impacto a longo prazo na vida destes pacientes e a actual falta de tratamento, tem levado pesquisadores e clínicos a embaralhar para uma melhor compreensão dos mecanismos por trás ZIKV infecção e replicação. Estudos anteriores têm examinado a infecção ZIKV em vitro sistemas em uma variedade de tipos de célula fisiologicamente relevantes a^7,8,9, bem como na vivo¹⁰ com camundongos imunocompetentes e imunodeprimidos^11,12,13 e primatas não-humanos^14,15,16. Além destas técnicas mais convencionais, vários grupos têm implementado células-tronco derivadas de organoids cerebral para entender mais sobre infecção ZIKV do cérebro humano em desenvolvimento. Estes grupos têm utilizado a organoids cerebral humano para confirmar o fenótipo de microcefalia^17,18, receptores ligados à entrada de vírus¹⁹de investigar, examinar as respostas fisiológicas a infecção^{20 , 21}e potencialmente tela para droga candidatos²². Aqui é descrita uma técnica para rapidamente produzindo e infectar células-tronco derivadas de organoids cerebral, conforme mostrado anteriormente,¹⁹, para melhorar o entendimento da infecção ZIKV do cérebro humano em desenvolvimento.

Desde que o organoids são formados a partir de culturas de células-tronco (PSC) padrão pluripotentes, esta técnica permite uma variedade de questões científicas a serem respondidas em relação a infecção viral do cérebro em desenvolvimento. Por exemplo, engenharia CRISPR pode ser usada para modificar estas linhas PSC antes da infecção de organoides em um ritmo mais rápido do que a maioria na vivo genética estuda¹⁹. Além disso, ao contrário no padrão duas culturas dimensional (2D) diferenciação, organoids expor a arquitetura celular complexa que é essencial para o corticogenesis, e estudos recentes têm mostrado que esta arquitetura pode ser interrompida após infecção ²¹. Finalmente, o custo relativamente baixo de gerar organoids permite maior experimentação de taxa de transferência e triagem quando comparado aos modelos na vivo . Por outro lado, existem algumas desvantagens para a utilização de organoids para estudar ZIKV. Enquanto organoids são biologicamente muito mais relevante do que culturas 2D, existem desafios adicionais na avaliação do organoids devido à sua natureza (3D) tridimensional. Imagem latente e dissociação de organoids tende a envolver mais equipamentos e um maior investimento de recursos do que em culturas 2D padrão. Além disso, organoids falta a vasculatura e componentes imunológicos que estão presentes em modelos na vivo , para que pesquisadores interessados aqueles aspectos da infecção viral são aconselhados a procurar um protocolo alternativo.

Há um número de técnicas para a formação de organoids humana e neurospheres na cultura, e normalmente caem dentro das categorias unpatterned ou estampados . Modelado métodos implementam fatores para regular a Wnt, BMP, TGFβ e outras vias de sinalização para empurrar a diferenciação na direção de linhagens específicas²³. Unpatterned métodos, como o descrito aqui, aproveite a propensão para as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e células estaminais embrionárias humanas (hESCs) para diferenciar-se em direção a uma linhagem neuroectodérmico por padrão²⁴. Após cerca de três semanas de diferenciação, as resultantes organoids consistem em grande, biomimetic neuroepithelial estruturas que contêm vários tipos de células que são observados no cérebro em desenvolvimento precoce.

A técnica para produzir organoids de culturas PSC padrão, livre de alimentador e infectando esses organoids com ZIKV é apresentada na íntegra. Para orientação sobre os métodos de cultivo necessários para EPS alimentador-livre, por favor consulte métodos anteriores Publicações^25,26. Além disso, para aplicar quantidades consistentes de vírus para múltiplas experiências, é importante calcular o MOI antes do tempo. Isto é feito através da realização de uma infecção de células Vero, seguido de um tratamento com meio de sobreposição, incubação e imunocoloração. Descrições e métodos dessa técnica têm sido descritas anteriormente^19,,²⁷.

Uma vez que a cultura do PSC alcança a confluência da meta de 50% - 70%, as células são então dissociadas e agregadas em placas de 96 poços de fixação ultra baixo. As células são mantidas durante 3 dias nos meios de manutenção de células-tronco xeno-livre (SCMM) e então convertidas em uma mídia de indução neural para o restante da cultura. Uma vez que o organoids ter diferenciado para 3 semanas, a infecção pode ser realizada. Rotineiramente tirando fotos durante a semana seguinte, infecção, os pesquisadores observarão morte celular progressiva e o rompimento de organoides. Pesquisadores também podem dissociar a organoids este tempo para conduzir transcricional ou proteomic perfilação no. Cryosectioning e lightsheet métodos são recomendados para a imagem latente, e os pesquisadores podem esperar ver altos níveis de infecção e replicação viral particularmente dentro das populações de célula (NPC) progenitoras neurais no organoids. Em última análise, esta técnica permite que pesquisadores examinar rapidamente os mecanismos de infecção viral do cérebro humano com equipamento de baixo custo e limitado.

Protocol

1. Organoids Cerebral criação de iPSC / hESC cultura 2D (dia 0)

Nota: este protocolo assume que a manutenção de células-tronco (SC) é praticada num meio SCMM com um vitronectina ou Geltrex substrato. Se usar uma célula-tronco alternativa, alta proteína meios de cultivo, é aconselhável a culturas de SC de transição para SCMM pelo menos duas passagens antes de iniciar a formação de organoides. O protocolo não foi testado com alimentador com base em métodos de cultura de SC.

1. Usando regular SC manutenção métodos ^{25 , 26}, trazer culturas de confluência de 50% - 70%. Isto é tipicamente 3-4 dias após a passagem, embora isto pode depender da cultura método e célula linha.
   Nota: Aproximadamente 2 poços de uma placa de 6 são necessários para produzir um prato completo 96 poços de organoids.
2. Inspecionar culturas através de microscopia brightfield na ampliação de 10x X-20 para garantir a morfologia de colônia saudável, com nenhuma diferenciação detectável.
3. SCMM trazer a 37 ° C em um banho de água quente e descongelar um frasco de 50 µ l de 50 mM Y-27632 (inibidor de Rock) e 2 mL de reagente enzimático desapego à temperatura ambiente.
4. Preparar um prato bem fundo U 96 de fixação ultra baixo (ULA), uma pipeta multicanal de P200 e um reservatório de reagente de 25 mL.
5. Alíquota 45 mL de SCMM num tubo cónico de 50 mL e adicionar 45 µ l de 50 mM Y-27632. Mix completamente por moer.
6. Vácuo aspirar os dois poços contendo SCs e rapidamente, adicionar 1 mL do reagente de enzima livre desprendimento para cada poço usando uma pipeta P1000. Incubar a placa em uma incubadora de 37 ° C por 4 min.
7. Vácuo Aspire poços de tratados e adiciona 1 mL de reagente enzimático desprendimento para cada poço usando uma pipeta P1000.
   1. Incubar a placa em uma incubadora de 37 ° C um adicional 5 min.
   2. Remover a placa e examinar os tratados poços. Bata levemente sobre a placa para quebrar células agregadas. Se os clusters de células grandes são ainda visíveis, incubar a placa por 2 min adicionais em 37 ° C. Repita este passo até clusters já não são visíveis a olho nu.
8. Uma vez que as células são devidamente dissociadas, adicione 1 mL de SCMM a cada poço para desativar as enzimas de dissociação. Piscina de 4 mL de suspensão de células em um tubo cónico de 50 mL e levar uma pequena alíquota para a contagem de células.
   1. Retornar qualquer poços restantes, não tratados na placa de manutenção para a incubadora de 37 ° C.
9. Contando, centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g por 5 min.
10. Determinar o número total de células e calcular a quantidade de SCMM + Y-27632 solução que serão necessários para conseguir uma suspensão de 60.000 células/mL.
11. Vácuo cuidadosamente Aspire o sobrenadante e adicionar o volume calculado de SCMM + Y-27632 solução. 5 - 10 vezes se misturam com uma pipeta de 5 mL, garantindo uma suspensão uniforme de células.
12. Imediatamente a suspensão de células de transferência em um reservatório de reagente e pipetar 150 µ l em cada poço da placa de fundo-ULA U 96 poços utilizando uma pipeta multicanal de P200. Isto produz 96 organoids individuais, cada um inicialmente consistindo de 9.000 células.
13. Centrifugar a placa a 150 x g por 1 min.
14. Colocar a placa em uma incubadora de 37 ° C e não perturbe a placa por 48 h.

2. Manutenção de organoides cerebral (dia 2)

1. preparar 17 mL de SCMM com 17 µ l de Y-27643 de 50 milímetros em um tubo cónico de 50 mL. Aquecer a SCMM + Y-27632 solução a 37 ° C em banho de água quente.
2. Levar o prato de organoides da incubadora e usando uma pipeta multicanal de P200 definida como 75 µ l, lentamente elaborar médio da borda do poço na primeira linha. Uma vez que o meio foi sorteado, expulse rapidamente a média volta para o poço de levantar organoids e células soltas. Repita isto para cada linha.
   Nota: Esta técnica, doravante referida como um " dispersão, " elevadores restos celulares e os organoides em suspensão. Os organoides rapidamente afunda até o fundo do poço, enquanto os detritos menores permanece em suspensão, permitindo que ele deve ser removido com uma mudança de mídia. Isso ajuda a impedir que os organoides descansando em restos celulares durante a cultura.
   1. Depois de tem sido dispersados todos os poços, aguarde por 15 s para garantir que o organoids ter afundado no fundo de cada poço.
3. Lenta e cuidadosamente Aspire 75 µ l do meio de cada poço usando a pipeta multicanal de P200 e dispense em um reservatório de resíduos.
   Nota: A maioria dos usuários, ocasionalmente, Aspire uma organoides durante alimentações regulares. Isso pode ocorrer aproximadamente 1% do tempo. Por favor, plano para assegurar que organoids suficiente para sobreviver aos pontos experimentais tempo.
4. Transferência SCMM + solução de Y-27632 em um reservatório de reagente e dispense a 150 µ l em cada organoides bem usando a pipeta multicanal de P200.
5. Coloque a placa de volta para uma incubadora de 37 ° C.

3. Manutenção de organoides cerebral (dia 3)

1. aquecer 17 mL de SCMM a 37 ° C, desta vez sem Y-27643.
2. Com a pipeta multicanal P200 definida como 100 µ l, dispersar todos os poços da placa de organoides (consulte a etapa 2.2). Espere 15 s para garantir que organoids ter afundado no fundo de seus poços.
3. Preparar um reservatório de resíduos e transferir SCMM aquecido em um reservatório fonte.
4. Cuidadosamente Aspire 125 µ l do meio de cada poço e substituir com 150 µ l de fresco SCMM usando a pipeta multicanal de P200.
5. Coloque a placa de volta para uma incubadora de 37 ° C.

4. Manutenção de organoides cerebral (dia) 4 +

Nota: realizar esta manutenção regular todos os dias até infecção.

1. Antes de iniciar a alimentação no dia 4, prepare o suporte de indução Neural (NI).
   1. Degelo uma alíquota de 250 µ l de heparina de 2 mg/mL, juntamente com um frasco de 5 mL de suplemento de N-2 X 100. Adicione a 250 µ l de heparina, 5 mL de N-2 de X 100 e 5 mL de 100 X MEM-timina a 500 mL de DMEM / GlutaMAX + F12. Estéril filtrar a solução mista em um filtro de 500 mL.
      Nota: Manter NI a 4 ° C, quando não estiver em uso; NI dura até duas semanas antes de meio fresco deve estar preparado.
2. Aquecer 17 mL de meio de NI a 37 ° C.
3. Com a pipeta multicanal P200 definida como 100 µ l, dispersar todos os poços da placa de organoides (consulte a etapa 2.2). Espere 15 s para garantir que organoids ter afundado no fundo de seus poços.
4. Preparar um reservatório de resíduos e transferir NI aquecido em um reservatório fonte.
5. Cuidadosamente Aspire 125 µ l do meio de cada poço e substituir com 125 µ l de NI fresco usando a pipeta multicanal de P200.
6. Coloque a placa de volta para uma incubadora de 37 ° C.

5. Infecção de organoides com ZIKV (~ dia 24)

Nota: depois de aproximadamente 3 semanas de diferenciação, há will ser neuroepithelial grandes estruturas e rosetas visíveis dentro os organoides que serão altamente suscetíveis à infecção ZIKV.

1. Trazer Earle ' s 1 X equilibrado sal solução (EBSS), 1X PBS e NI a 37 ° C em banho de água quente.
Multiplicidade de
2. dilua ZIKV de concentração conhecida em 1 X EBSS à infecção alvo de infecção (MOI).
   Nota: Titulações de MOIs diferentes são recomendadas para alcançar uma resposta de dose viral. Pode variar por estirpe do vírus; para ATCC VR-1838 e ATCC VR-1843, MOI típico valores variam entre 0,1 e 10).
3. Retire cuidadosamente todos os meio de organoides bem usando uma pipeta de P200 de canal único. Adicione rapidamente 200 µ l de 1X PBS a cada poço usando uma pipeta multicanal P200 para lavar o organoids.
4. Retire cuidadosamente todos os meio de organoides bem usando uma pipeta de P200 de canal único. Adicione 50 µ l de 1 X somente EBSS (simulada infecção) ou solução de vírus ZIKV bem e garantir que os organoides está completamente submersa. Repita para cada organoides que deve estar infectado para o estudo.
5. Coloque a placa de volta para uma incubadora de 37 ° C por 2 h.
   Nota: Incubando organoids infectados por simulação para esta duração não deve impacto significativamente seu crescimento em comparação com imperturbável organoids.
6. Cerca de 30 min antes de incubação viral é concluída, alíquota 25ml de NI em um tubo cónico de 50 mL e trazer a 37 ° C em banho de água quente.
7. Após exposição viral é concluída, lavar o organoids com 200 µ l de 1X PBS para cada poço, permite organoids de se contentar em 15 s e em seguida remover 1 X PBS usando uma pipeta monocanal P200.
8. Adicionar 200 µ l de NI fresco a cada bem e coloque de volta para a incubadora.
   1. Opcional: para um dia de tempo 0 ponto, organoids pode ser fotografada uma hora após a infecção.
9. Continuar a cultura através da substituição de 125 µ l NI todos os dias usando o método de dispersão (ver passo 4). Não se esqueça de descartar adequadamente mídia irradiada e dicas, como contém partículas infecciosas ZIKV.

Results

Durante o dia de formação de organoides, culturas de SC devem ser na fase de crescimento de log, em que são 50% - 70% de confluencia, conforme mostrado na Figura 1(A-C). Culturas devem formar colônias arredondadas com bordas distintas, e os poços devem ser claros de diferenciação Figura 1(D-E). Se está ocorrendo a diferenciação, é aconselhável realizar um picareta de remover para limpar as áreas afetadas dentro as placas pelo menos um dia antes para criar organoids. Se uma grande parte da cultura é diferenciada, pode ser necessário realizar uma passagem extra, descongelar um frasco novo ou alterar as técnicas de cultura de células-tronco para garantir que os organoids estão sendo formadas por culturas de células-tronco puro.

A dissociação por uma combinação de tratamento de reagentes de desprendimento de enzima livre e enzimática deve conduzir a principalmente células únicas, embora ainda possa haver pequenos agregados de células observadas durante a contagem. A presença de pequenos agregados não aparece interromper a formação de organoides, embora ele pode afetar a precisão de contagem. Recomenda-se que várias acusações são feitas por amostra, e se as contagens variam por mais de 20%, pode ser necessário aumentar o tempo de dissociação para singularizar as células ainda mais.

Uma vez que as células são semeadas e giradas para baixo em um prato fundo-ULA U 96 poços (Figura 2A), eles aparecerão como uma folha plana, densa de células na parte inferior de cada poço. As células agregará lentamente durante os próximos dois dias. É melhor não incomodar a placa durante estas 48 horas, como forças mecânicas podem perturbar a agregação vagamente-formado. Para os primeiros 10 dias, os organoides permanecerão na maior parte esférica e crescerão de ~ 300 µm até 600-800 µm (Figura 2B). Mais estruturas observáveis começam a aparecer nos organoides entre dia 10 e dia 20 (Figura 2C-E). No dia 24, pesquisadores devem ser capazes de observar a roseta-como estruturas através de microscopia brightfield (Figura 2-F). Continuando a cultura, estas estruturas neuroepithelial podem aumentar em tamanho e quantidade durante vários dias (Figura 2G). Durante as alimentações, o pesquisador vai notar uma quantidade considerável de detritos coletando no fundo de cada poço, particularmente durante as primeiras 2 semanas de cultura. A técnica de dispersão descrita no passo 2.2 remove a maioria dos detritos celulares para impedir que os detritos de apoptotic acumulando ao longo de vários feeds(Figura 3). Este detritos podem interferir com a imagem, pode ser mais desafiante para observar e quantificar a morte celular induzida por infecção e pode fornecer sinalização assimétrica para a vizinha organoides que poderiam afetar a diferenciação. Se a técnica de dispersão é realizada corretamente, este deve ser reduzido (Figura 3B-C, 3D-E).

É recomendável realizar cryosections ou lightsheet de imagens para inspecionar a estrutura cortical, formando-se dentro do organoids. No dia 25 organoids, as estruturas de Roseta e zonas ventriculares são claramente visíveis em DAPI(Figura 4)e coloração phospho-vimentina (Figura 4B). A presença de TBR2 (Figura 4C) indica que progenitores intermediários estão se formando, com uma morfologia que sugere a migração para o exterior. Map2 + (Figura 4D) neurônios preenchem as regiões exteriores da cada Roseta. Partir destas proteínas, se pode visualizar a zona ventricular (VZ), zona subventricular (SVZ), zona intermédia (IZ) e placa cortical (CP) dentro de cada roseta (Figura 4E, 4E'). Um pode continuar a cultura destes organoids a fim de respeitar os estágios posteriores de desenvolvimento. Enquanto camadas corticais não é tão proeminente neste tipo de organoides, a opção natural para gliogenesis ocorrer muito, como acontece na vivo. Isto pode ser observado no dia 108 organoids, em que uma grande parte das células express MAP2 ou GFAP (Figura 4F-eu).

Os usuários podem esperar para ver as diferenças no tamanho de organoides por aproximadamente 3 dias após a infecção ZIKV, dependendo o MOI viral aplicada para o organoids (Figura 5A-B). Após estes 3 dias, também haverá um aumento em restos celulares em poços de infectados, comparados aos poços trocistas. Esta diferença no tamanho de organoides aumentará na semana seguinte, até que o organoids infectadas começam a quebrar distante (Figura 5C-D). Uma variedade de ensaios pode ser utilizada neste momento para investigar os mecanismos de infecção, incluindo a extração de RNA viral e cryosectioning (recomendado anticorpos relatados na tabela de materiais). Sobre cryosectioning, os usuários observarão uma grande presença de vírus na região apical das estruturas neuroepithelial, sugerindo uma susceptibilidade de células progenitoras neurais (NPCs) para infecção ZIKV (Figura 6). Imunofluorescência de seccionado organoids também irá mostrar um aumento na expressão de caspase-3 clivada no organoids infectadas (Figura 7).

Figura 1 : Morfologia de colônia de células-tronco antes da formação de organoides.
Colônias devem ser 50% - 70% de confluencia aquando da dissociação para produzir um grande número de organoids consistente. (A) Sparse, culturas semeadas recentemente ainda não alcançou crescimento de log de fase e não produzirá muitos organoids. (B) uma vez que as células alcança a confluência adequada, eles estão prontos para dissociação. Também é importante que estas colônias são inspecionadas para garantir que eles são claros de diferenciação. (C) colônias que são levadas longe demais vão chegar a confluência de excesso e não são recomendadas para formação de organoides. Culturas neste estado são mais propensos a conter a diferenciação de células. (D) colônia bordas devem ser distintas, com morfologia celular consistente de células arredondadas no centro e ligeiramente alongada células em direção as bordas. (E) a diferenciação mínima deve estar presente nas culturas. Se células achatadas, maiores são observadas nos centros ou bordas das colônias (setas brancas) e compõem mais de cerca de 1% da cultura, é recomendável que escolha de remover ou adicionais passagens são conduzidas para formar uma população uniforme de células estaminais.e.Jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig1large.jpg"target = blank" > clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Crescimento de organoides cerebral ao longo do tempo.
(A) um diagrama para a produção de organoids cerebral de 2D PSCs mantiveram em meio de xeno-livre, sem alimentador. (B) para os primeiros 8 dias, organoids permanecerá na maior parte esférica com poucas características detectáveis. O diâmetro da organoides variam de aproximadamente 300 µm a 500 µm. (C-E) no dia 10, regiões mais claras vão começar a ser detectável em torno da periferia do organoids, e perdem sua forma esférica. Eles continuarão a aumentar em tamanho de aproximadamente 1 mm de diâmetro, dependendo em grande parte a linha de celular, sendo usada para produzir o organoids. (F) depois de aproximadamente 20 dias de diferenciação, usuários irão observar a formação de estruturas neuroepithelial (setas pretas) em regiões claras periféricas da maioria dos organoids. Estes têm uma morfologia de anel, com estruturas apicais e basais, imitando os do córtex em desenvolvimento. (G) estas estruturas neuroepithelial continuará a crescer e a aumentar de tamanho para aproximadamente 20-30 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Limpeza de restos celulares através de dispersão alimenta técnica.
Durante o crescimento de organoides, uma grande quantidade de morte celular é de se esperar e pode levar ao acúmulo de restos celulares que rodeiam a base dos organoides. (A) a técnica de dispersão retratados permite que os pesquisadores remover a maioria destes detritos durante cada feed. Para fazer isso, usando uma pipeta multicanal de P200, lentamente, elaborar o meio utilizado e rapidamente expulsá-lo para levantar os detritos organoides e células em suspensão. Os organoides rapidamente irão cair para o fundo do poço, momento no qual pode efectuar-se uma alimentação regular. Exemplos de um dia 6 organoides antes (B) e depois (C) alimentação de dispersão mostra redução considerável de detritos. Isto continua durante várias semanas, como mostrado por um dia 18 organoides antes (D) e após a alimentação de dispersão de (E) . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Caracterização de organoids cerebral através de imuno-histoquímica.
Imagens de Lightsheet de organoids cerebral são mostradas para fornecer um exemplo da arquitetura celular que se forma. No dia 25, DAPI (A) e de fósforo-vimentina (B) indicar rosetas individuais e as zonas ventriculares, respectivamente. (C) TBR2 rotula progenitores intermediários que estão migrando para o exterior e MAP2 (D) rotula os neurônios que se formaram na placa cortical. (E, E') A combinação destas proteínas mostra claramente a recapitulação do desenvolvimento cortical nos modelos organoides cerebral. (F-eu) Por dia 108, gliogenesis ocorreu, com uma mistura de GFAP + e células MAP2 + preenchendo grande parte os organoides. VZ = zona ventricular, SVZ = zona subventricular, IZ = zona intermédia, CP = placa cortical. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Degradação dos infectados organoids.
Imagens de campo claro (A) de Mock e infectados com ZIKV organoids cerebral em MOI = 0,1 e 10. Imagens foram tomadas imediatamente após a infecção (dia 0), bem como 3 e 6 dias após a infecção. (B-C) Brightfield imagens dos estilhaços da célula em torno de simulação (B) e (C) ZIKV-infectados ao MOI = 10 pós-infecção 3 dias de organoids cerebral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Cryosection e imunofluorescência de infectados organoids.
Organoids dia 24 foram expostos ao ZIKV em MOI = 0.1 e cryosectioned 6 dias depois. Nesta fase, há uma clara presença do vírus nas zonas ventriculares, subventricular e intermediárias dos organoides, onde células progenitoras neurais e glia radial residem. (A) através de coloração nuclear, nestas regiões neuroepithelial são claramente visíveis devido (setas brancas) à alta densidade de núcleos que formam estruturas semelhantes a anel ao redor da superfície apical. (B) pela coloração para o envelope viral, pode-se observar uma presença relativamente alta de vírus dentro destas estruturas de roseta (setas brancas). Observe que há uma pequena quantidade de vírus presente em várias células periféricas não identificadas. (C-D) Map2 ou outro neurônio-específico manchas de mostrar que existem neurônios presentes nas culturas que parecem não ser infectado pelo vírus quando sobrepostos com a mancha viral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 : Clivada caspase-3 imunofluorescência de organoides infectados.
Após a infecção, um pode usar apoptotic indicadores para investigar os mecanismos de morte celular que ocorrem dentro do organoids. Neste exemplo, o dia 24 organoids foram expostos ao ZIKV em MOI = 0.1 e cryosectioned 6 dias depois. (A) organoids não infectados não mostrar nenhum envelope viral (4 2 proteína) e uma quantidade mínima de caspase-3 clivada devido a apoptose homeostático ocorrendo no tecido. (B) Infected rosetas começam a mostrar o aumento dos níveis de apoptose. (C) rosetas que estão mostrando infecção grave através de 2 4 coloração também tendem a exposição a níveis elevados de caspase-3 clivada nestas regiões. Há uma correlação direta entre a severidade da infecção e expressão de caspase-3 clivada dentro os rosettes infectados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Existem várias advertências para considerar quando utilizando organoids cerebral humano para investigar infecção ZIKV. Uma consideração importante é a formação de organoides e estrutura é altamente dependente da linha de células-tronco do qual são formados. Tome cuidado ao comparar entre linhas celulares, incluindo linhas isogénicas de engenharia; é melhor fazer conclusões usando vários subclones e idealmente, várias linhas de células-tronco. Além disso devido a esta diferença de linhas celulares, recomenda-se experiências piloto para garantir que a diferenciação adequada está ocorrendo no organoids. Enquanto as estruturas neuroepithelial são visíveis pela microscopia brightfield, também é aconselhável para realizar experimentos qRT-PCR ou cryosectioning para procurar marcadores de diferenciação neural como PAX6 ou fosfo-vimentina.

Um deve também antecipar considerável variabilidade entre organoids dentro da mesma linha de celular. Devido à natureza unpatterned do protocolo, o número e tamanho das estruturas neuroepithelial podem variar entre organoids individuais. Normalmente, pode-se esperar pelo menos dois grandes (> 200 µm de diâmetro por D24) rosetas neurais por organoides. Por esta razão, estudos longitudinais, como a observação da mudança no tamanho de organoides ao ser infectado, são particularmente esclarecedoras. Variabilidade entre lotes também pode ocorrer, com a causa mais provável para isso ser imprecisa célula contando ou semeadura. É recomendável realizar várias acusações e ter certeza de que a suspensão celular é bem misturada antes da semeadura nas chapas de fundo-ULA U 96 poços.

Quando o cultivo organoids em placas de fundo-ULA U 96 poços, planeja ver efeitos de evaporação considerável em torno das bordas das placas. O ideal é preencher esses poços com PBS e trabalhar apenas com os poços de 60 centro. Devido a evaporação, organoids em poços do exteriores será exposto a condições diferentes do que aqueles no centro, o que provavelmente vai afetar seu crescimento e diferenciação. Por favor, considere isso ao planejar o número de organoids que serão necessários para as experiências. Além disso, o organoids vai começar a overgrow o formato de 96 poços após cerca de 30 dias, que será visíveis devido a descoloração do meio de cultura. Se planejando tomar o organoids passado os 30 dias, é aconselhável transferir o organoids para uma placa de 24 ULA. Para realizar a transferência, use tesouras para cortar uma ponta P1000 para que a abertura é muito maior do que o organoids se e transferir o organoids por pipetagem.

Organoids cerebrais humanos mantenha grande potencial em fazer avançar a compreensão do campo de neurodesenvolvimento e doença. Os pesquisadores são encorajados a modificar o protocolo conforme necessário. Por exemplo, um pode implementar fatores de padronização para melhorar a eficiência de diferenciação para tipos específicos de célula, permitindo-lhes explorar os impactos virais em determinadas regiões anatômicas. Os efeitos do desenvolvimento neurológico do ZIKV são ainda mal compreendidos, mas esta nova abordagem dará pesquisadores de uma forma acessível, rápida e alta produtividade de investigar os mecanismos de infecção.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente de desprendimento sem enzimas, ReLeSR	StemCell Technologies	5873
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML
DMEM/F12 suplementado com glutamato (1X)	Gibco	10565-018	)2.438 g/L bicarbonato de sódio, (+)piruvato de sódio
N-2 Suplemento (100X)	Gibco	17502-048
MEM Aminoácidos Não Essenciais (MEM-NEAA)	Gibco	11140-050
Solução Salina Balanceada de Earle (EBSS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30029.02
Filtro Stericup (500mL)	Millipore	220009-140
, 96-Well, Fundo Redondo	Reservatório de Reagente de Baixo Volume Residual Corning	7007
(25mL)	Integra	4312
Pipet-Lite Multi Pipeta L12-200XLS+	Rainin	17013810
Centrífuga Grande, Placa de Cultura Compatível com Placa de	Thermo Scientific	75007210
Placa de Cultura Rotor Centrífuga	Thermo Scientific	75005706
Vero Cells	ATCC	CCL-81	Para expansão de vírus, se necessário
Zika Vírus ( Cepa Uganda)	ATCC	VR-1838	Outras cepas podem ser usadas
Zika Vírus (Cepa de Porto Rico)	ATCC	VR-1843	Outras cepas podem ser usadas
fosfo-vimentina	MBL	D076-3	camundongo policlonal,  diluição 1:250
TBR2	Abcam	ab23345	coelho policlonal, diluição 1:300
MAP2	Novus	NB300-213	frango policlonal, diluição 1:1500
GFAP	Cell Signaling Technologies	CST12389S	coelho policlonal, diluição 1:200
D1-4G2 proteína do envelope de flavivírus	EMD Millipore	MAB10216	monoclonal de camundongo, diluição 1:500
caspase-3 clivada	Cell Signaling Technologies	9661	coelho policlonal, diluição 1:200
488 anti-camundongo IgG	Thermo Fisher	A-11001	policlonal de cabra, 1:1000
594 IgG anti-coelho	Thermo Fisher	A-11037	policlonal de cabra, diluição 1:1000
647 anti-frango IgY	Thermo Fisher	A-21449	policlonal de cabra, 1:1000 diluição