Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga

Resumo

Este protocolo descreve o uso de centrífuga elutriation para separar as células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular.

Resumo

A capacidade de sincronizar as células tem sido fundamental para fazer avançar a nossa compreensão da regulação do ciclo celular. Técnicas comuns empregadas incluem privação de soro; produtos químicos que prendam células em fases diferentes de ciclo celular; ou o uso de mitótica shake off-que explora sua aderência reduzida. No entanto, todos estes têm desvantagens. Por exemplo, a fome de soro funciona bem para as células normais, mas menos bem para células tumorais, com pontos de verificação ciclo de celular comprometida devido à perda de supressor de ativação ou tumor do oncogene. Da mesma forma, populações de células quimicamente tratada podem abrigar dano induzido e mostrar alterações relacionadas ao estresse. Uma técnica que contorna esses problemas é elutriation centrífuga de contracorrente (CCE), onde as células estão sujeitos a duas forças opostas, a força centrífuga e a velocidade do fluido, que resulta na separação de células com base no tamanho e densidade. Desde células avançando através do ciclo normalmente ampliar, CCE pode ser usado para separar as células em fases diferentes de ciclo celular. Aqui podemos aplicar esta técnica para as células de leucemia linfoblástica aguda primária. Sob condições ideais, uma população essencialmente pura de células na fase G1 e uma população altamente enriquecida de células em G2/M fases podem ser obtidas em excelente rendimento. Estas populações de células são ideais para estudar mecanismos de ciclo celular dependente da ação de drogas anticâncer e para outras aplicações. Podemos também mostrar como modificações para o procedimento padrão pode resultam em desempenho suboptimal e discutir as limitações da técnica. A metodologia detalhada apresentada deve facilitar a aplicação e exploração da técnica para outros tipos de células.

Introdução

Células cultivadas geralmente crescem de forma assíncrona e células individuais estão presentes em diferentes fases do ciclo celular. Alguns organismos apresentam ciclos de célula naturalmente síncronos ou podem ser sincronizados por estímulos fisiológicos específicos. Por exemplo, núcleos dentro plasmódios gigantes do slime molde Physarum polycephalum dividem em uma forma altamente síncrona¹e as células das algas verdes que desmodesmus quadricauda podem ser sincronizados por alternadas claras e escuras períodos². Embora esses organismos oferecem atributos únicos experimentais, são modelos inadequadamente as complexidades de células de mamíferos. A capacidade de sincronizar artificialmente as populações de células de mamíferos tem sido fundamental para fazer avançar a nossa compreensão da regulação do ciclo celular e a base molecular dos postos de controlo do ciclo celular. Métodos comuns incluem privação de soro, bloco de químico e liberação ou explorando características físicas^3,4. Retirada do soro, muitas vezes, faz com que células entrar quiescência, e a re-adição de soro promove ciclo celular reentrada para o G1 fase⁵. Inibidores químicos incluem agentes como timidina excesso hidroxiureia que bloqueiam as células no limite do G1/S ou inibidores de microtúbulos que tipicamente prendam células na fase M^3,4. Abordagens que exploram características físicas incluem mitótica shake off-que pode ser usado para enriquecer para células mitóticas desde que eles são menos aderentes que interfase células⁶. No entanto, todas essas técnicas têm desvantagens potenciais. Por exemplo, nem todos os tipos de célula mantêm viabilidade na ausência de soro ou a presença de inibidores químicos e o rendimento das células após agitar-off mitótica é limitado sem prévia sincronização com inibidores mitóticos.

Com excepção dos primeiros ciclos de celular embrionários, onde células progressivamente diminuem de tamanho, como eles dividem⁷, a maioria das células, avançando através do ciclo passam por fases de crescimento e se tornam maiores. Esta propriedade é explorada na técnica de elutriation centrífuga contrafluxo (CCE), que pode ser usado para separar as células diferindo em tamanho e, portanto, no ciclo celular fase^8,9. Durante CCE, as células estão sob a influência de duas forças opostas: a força centrífuga, que leva as células longe do eixo de rotação e a velocidade do fluido (contrafluxo), que leva as células para o eixo de rotação (Figura 1). Células na câmara elutriation alcançar uma posição de equilíbrio onde estas forças são iguais. Os principais fatores que ditam a posição de equilíbrio são a densidade e diâmetro da célula. Como o fluxo taxa da solução-tampão é aumentada e a força de arrasto de contrafluxo supera a força centrífuga, é estabelecido um novo equilíbrio, causando uma mudança na posição de células dentro da câmara. Todas as células são deslocadas na direção de saída da câmara, resultando em menores deixando a câmara, em primeiro lugar, Considerando que as maiores células permanecer dentro da câmara até que a taxa de contrafluxo é aumentada suficientemente para promover sua saída. As células escapar da câmara de elutriation com aumentos consecutivos na taxa de contrafluxo podem ser coletadas em frações específicas e cada fração contém células de tamanhos que aumentam sequencialmente. Em vez de realizar elutriation com aumentos incrementais em taxa de contrafluxo, sequencial diminui em força centrífuga, diminuindo a velocidade de centrifugação irá realizar o mesmo resultado. O processo de elutriation exige otimização dependendo do tipo de célula, buffer de elutriation empregado e o aparelho específico utilizado. A taxa de sedimentação de células nestas condições é melhor descrita pela lei de Stokes: SV = [d²(ρ_p- ρ_m) / 18η] .ω²r, onde SV = velocidade de sedimentação; d = diâmetro da partícula; Ρ,_p = densidade da partícula; Ρ_m = densidade do buffer; Η = viscosidade do buffer; Ω = velocidade angular do rotor; e r = posição radial da partícula. Assim, o SV é proporcional à densidade e diâmetro da célula, e desde que o diâmetro é elevado à segunda potência, contribui mais significativamente do que a densidade que é geralmente constante ao longo do ciclo celular.

Uma vantagem importante da CCE é que as células não estão sujeitos a condições adversas de tratamento químico ou privação nutricional e podem ser recuperadas em excelente rendimento essencialmente imperturbável. Um requisito é que as células em questão se submeter a um aumento significativo de diâmetro, pelo menos 30%, como eles atravessam o ciclo celular. A principal desvantagem é o custo do centrifugador especializado, rotor e acessórios. No entanto, a capacidade de preparar células enriquecidas nas fases do ciclo celular específico por CCE tem facilitada pesquisa do ciclo celular em organismos do fermento para células de mamíferos^9,10. Além disso, os avanços recentes estão expandindo usos para a separação das células de saudável contra o tecido canceroso, a separação dos diferentes tipos de células em misturas heterogêneas e a produção de tipos de células específicas para imunoterapia⁹.

Nosso interesse principal tem sido na compreensão do mecanismo de ação do microtubule direcionamento MTAs (agentes) tais como alcaloides da vinca e taxanos. Estas drogas foram pensadas para atuar exclusivamente na mitose, bloqueando os microtúbulos do fuso função^11,12, mas a evidência recente sugere que eles também podem direcionar interfase microtúbulos^13,14. Recentemente, informou que as células de leucemia linfoblástica aguda primária (todos) sofrem a morte em qualquer fase G1 ou no M fase quando tratados com vincristina e outros MTAs em uma maneira dependente do ciclo celular¹⁵. A habilidade de separar todas as células em fases diferentes de ciclo celular por CCE foi fundamental para chegar a esta conclusão. Neste artigo, descrevemos os detalhes técnicos e oferecer dicas práticas para a aplicação da CCE para a preparação da escola primária de todas as células nas fases do ciclo celular diferente.

Protocolo

Nota: Este protocolo foi otimizado para primário B-todas as células que variam em diâmetro de aproximadamente 8 µm (fase G1) a 13 µm (fases G2/M). Assim, as velocidades de centrifugação específicos e taxas de fluxo da bomba podem não ser aplicáveis às pilhas com intervalos de tamanho diferente. Não obstante, parâmetros de elutriation apropriado podem ser estimados usando a equação de taxa de sedimentação. As células são cultivadas em meio livre de soro definido como descrito ¹⁶ em uma densidade ideal de 1-3 x 10 ⁶ células/mL. Com exceção da coleção de frações que é conduzida a 4 ° C, utilizando tubos de resfriado, todas as etapas são conduzidas a temperatura e o centrifugador definido a 20 ° C, com um máximo de 24 ° C.

1. preparação de Buffer Elutriation e materiais

1. , a fim de reduzir a aglutinação de células, preparar um buffer elutriation de Hank ' s equilibrada solução salina (HBSS) com vermelho de fenol, suplementado com 2% de soro fetal bovino ( FBS), para proteger as células do estresse mecânico durante o processo de elutriation e 1,6 g/L de sal de 2-naftol-6,8-disulfonic acid dipotassium (NDA), que torna o exterior da célula carregado negativamente e reduz a aglutinação.
   1. Adicionar 1,6 g de NDA para um tubo cónico de 50 mL.
   2. Sob condições estéreis, adicionar 35 mL de HBSS de uma garrafa de 1 L para o tubo cónico de 50 mL contendo NDA. Agite o tubo até dissolver a NDA.
   3. Usando um filtro de 0,2 µm, transferir a NDA dissolvida em um novo tubo cônico estéril 50 mL. Em seguida, adicione o restante 1L de HBSS NDA.
   4. Finalmente, adicione 21 mL FBS o HBSS para obter uma concentração final de 2% (v/v).
      Nota: O buffer de elutriation pode ser preparado e armazenado a 4 ° C até a data de validade sobre o HBSS, ou até que haja uma grande mudança de pH, conforme indicado por um amarelinho do corante indicador.
2. Etiqueta 50ml cónicos tubos para coleta de frações que existem tubos rotulados lavagem 1 e 2 (W1 e W2), frações (F1 - F20) 1-20 e parem.
   1. Pre-chill esses tubos no gelo antes de coletar frações.

2. Montagem do sistema Elutriation

1. em primeiro lugar, instalar o conjunto de strobe para a centrífuga para que o cabo de alimentação é alimentado fora da câmara através da porta do lado esquerdo. Certifique-se que a lâmpada de flash estroboscópio na frente da câmara vai alinhar com a janela de visualização quando o centrifugador é fechado.
   1. Fixar o conjunto no lugar primeiro apertando dois parafusos Phillips nos dois furos na parte superior de cada suporte e depois de apertar os parafusos na parte inferior de cada suporte.
   2. Conecte o cabo de porta de alimentação do estroboscópio na parte de trás da centrifuga.
2. Em seguida, defina o rotor direto para baixo para o hub de unidade centrífuga e seguro com uma chave hexagonal de T-handle.
   Nota: Se a centrífuga não é necessário para fins de não-elutriation, a montagem do estroboscópio e do rotor podem ser mantidos na centrífuga entre execuções.
3. , Uma vez que o rotor é fixado, coloque o conjunto de liberação rápida que contém a câmara de elutriation, balanço de contador, montagem de selo e uma placa de montagem de giro no rotor.
   1. Pressione uniformemente com uma mão a câmara de elutriation e a outra mão sobre o equilíbrio do contador até os parafusos no rotor encaixem nos orifícios da placa de montagem.
   2. Finalmente, conecte o cabo de ancoragem colocando o pino em um lado do cabo no orifício na Assembleia de vedação rotativa e fixando o olho do outro lado do cabo com um dos parafusos Phillips-cabeça (mencionados em 2.1.1) do suporte sobre o lado esquerdo o f a câmara de.
4. Em seguida, montar o sistema de fluxo usando uma bomba de velocidade variável e tubo para buffer de bomba para o elutriation câmara e recolher o tampão que flui fora da câmara de elutriation.
   1. Inserir o tubo de entrada de tamanho 16 proveniente da bomba de velocidade variável através da porta na parte superior saiu da câmara de centrifugação para que ele entra na câmara de.
   2. Anexar um encaixe a extremidade livre do tubo de entrada e insira o encaixe no orifício entrado na lateral da Assembleia de vedação rotativa.
   3. Inserir o tamanho 16 tubos através da porta de saída e anexá-lo para o tubo de transferência no topo o rotativo de vedação montagem.
      Nota: O sistema de fluxo pode permanecer montado entre as execuções de elutriation.
5. Por último, ligue o centrifugador e definir as especificações necessárias para o experimento.
   1. Alterar o rotor ID.
   2. Se o centrifugador requer uma entrada de tempo, definido por 2 h, que é mais do que suficiente para completar um elutriation executar.
   3. Definir a temperatura a 20 ° C, com uma temperatura máxima de 24 ° C.
   4. Definir a aceleração para o max e a desaceleração para lento.
   5. Finalmente, definir a velocidade de 867 g. x

3. Preparação do sistema Elutriation

1. primeiro a fim de esterilizar o sistema elutriation, coloque o tubo de reservatório em um frasco plástico de 500 mL, contendo 5% de alvejante e coloque o tubo de saída em um frasco de resíduos plásticos de vazio 1 L.
   1. Ligar a bomba e definir a velocidade de 25 mL/min e permitir que a lixívia de 5% a correr todo o caminho através do sistema de elutriation até é bombeada fora do tubo de saída para o frasco de resíduos.
   2. Ligar o centrifugador e permitir que chegasse ao máximo designado velocidade (867 x g) para soltar as bolhas e contrapressão.
   3. Parar o centrifugador. Uma vez que o rotor parou de girar, abra a tampa e inspecionar a câmara para qualquer vazamento.
   4. Se não existem fugas, deixe a solução de lixívia fluxo através do sistema de pelo menos 5 min.
2. Em seguida, limpe o sistema com água esterilizada como lixívia pode levar à formação de precipitados de buffer de elutriation, que pode levar a aglutinação das células, bem como causar danos às células.
   1. Lugar da tubulação do reservatório dentro de uma garrafa de 1L de autoclavado de água e deixe-o liberar através de pelo menos 10 min.
3. Após o enxaguamento com água, introduzir o tampão elutriation no sistema. Use um frasco de vidro de 150 mL que tem sido esterilizado para criar um reservatório para o buffer de elutriation e células.
   1. Adicionar 100 mL de tampão de elutriation para a garrafa e mover o tubo de reservatório para o frasco de vidro para que o tubo está na parte inferior.
   2. Começar o centrifugador e permitir que o buffer para o fluxo através do sistema de expulsar a água.
   3. Uma vez que o frasco reservatório está quase vazio e a água é liberada completamente fora do sistema, mova a saída tubo do frasco resíduos para o reservatório para que o buffer está sendo reciclado através do sistema.
4. Finalmente, ajustar a janela de visualização para que a câmara de elutriation pode ser vista na velocidade atual. Lâmpada
   1. imprensa strobe o botão do lado de fora do centrifugador de energia para que a lâmpada acende. Vire o k elutriationNob, também do lado de fora do centrifugador todo o caminho para a esquerda.
   Curva de
   2. enquanto olhando através da janela de visualização, lentamente o botão para a direita até a câmara de elutriation entra em modo de exibição e a luz estroboscópica é no tempo com a rotação do rotor.
      Observação: O sistema elutriation pode ficar neste estado até que as células estão preparadas.

4. Preparação da amostra celular

1. contagem de células e a alíquota média de 300 a 400 milhões em crescimento em vários tubos de 50ml cónico. Gire para baixo as células a 1210 x g, durante 3 min.
2. Aspirado de células de mídia e ressuspender crescimento em 25 mL de tampão de elutriation pipetando para cima e para baixo suavemente.
Aglutinação de células
3. para reduzir, células passe duas vezes a um 25 medidor de agulha.
   1. Utilizando uma seringa de 10 mL elaborar as células e, em seguida, conecte a agulha de calibre 25 e passe as células através no interior parede de um tubo cônico estéril 50 mL. Repita isto até que todos os 25 mL tenham passado através da agulha.
   2. Obter uma nova agulha e seringa e repita o processo acima quando.
      Atenção: As agulhas de seringa devem ser colocadas em recipientes para objectos cortantes.
      Nota: É fundamental que as células são empurradas através da agulha, imediatamente antes de apresentá-los ao sistema elutriation para manter a célula aglutinação ao mínimo.

5. Introdução da amostra de célula no sistema Elutriation e coleção de frações

1. introduzir a amostra de células no sistema derramando a amostra de células no tanque de reservatório, que tem o buffer de elutriation restantes reciclagem através de elutriation .
   1. Deixa as células introduzir no sistema e atingir o equilíbrio dentro da câmara de elutriation.
      Nota: Este processo levará cerca de 5 min e progresso pode ser rastreado, observando as células como eles entram na câmara através da janela de visualização. Para garantir que todas as células se encontram nesta sala, pegue uma gota de eluente, coloque sobre uma lâmina de vidro e ver os sob um microscópio. Se a amostra está livre de células intactas, isto confirma sua retenção na câmara.
2. Começar a coletar frações, uma vez que todas as células entraram na câmara e não há um limite distinto na parte mais larga da câmara na qual as células estão em equilíbrio.
   1. Begin, movendo-se o tubo de saída para o tubo cônico 50ml rotulados W1. Coletar 50 mL de tampão de elutriation para esta fração, certificando-se de manter um olho sobre o tanque de reservatório e reabasteça com buffer elutriation quando necessário.
      Nota: A fim de certificar-se de que todas as células tenham entrado no sistema, permitir que o tanque reservatório tornar-se quase vazio antes de enchimento do reservatório pela primeira vez. Após a primeira recarga não será necessário esperar o reservatório tornar-se quase vazio. Além disso, não nunca permitir que o tanque se tornar vazio como isto irá criar bolhas e contrapressão no sistema de.
   2. Depois de 50 mL foram recolhidos por W1, simultaneamente mudar a velocidade para 821 x g e mover o tubo de saída para o tubo cônico rotulado W2 e recolher mais nessa velocidade 50 mL.
   3. Continuar alterando a velocidade e coletando frações, conforme indicado na tabela 1. Verifique se há meios de comunicação no reservatório do tanque e mantenham os tubos cónicos no gelo em todos os momentos. Finalmente, ajustar a janela de visualização, lentamente girando o botão para a direita quando a velocidade diminui.
   4. Uma vez que todos os 20 fracções foram recolhidas, parar o centrifugador e recolher 50 mL no tubo cónico rotulado STOP.

6. Flushing do sistema Elutriation

1. após a centrifugação parou completamente nivelado o sistema, colocando o tubo reservatório na garrafa 1 L de água esterilizada e o tubo de saída volta na garrafa resíduos.
   1. a velocidade da bomba até 50 mL/min e deixe a água correr através do sistema até que se esgote.
2. Virar a bomba, retire a mangueira de entrada e saída da Assembleia de liberação rápida e retire o pino do cabo de ancoragem.
   1. Remover o conjunto de liberação rápida do rotor.
      Nota: Dependendo do que a centrífuga será usada para, o sistema elutriation pode agora ser deixado como é. Caso contrário, todo o conjunto pode ser derrubado na ordem oposta como descrito acima. Câmara de elutriation pode ser removida do conjunto da liberação rápida e limpa entre execuções usando um banho ultra-sônico. Isto remove resíduos e contaminantes da parede da câmara que pode afetar negativamente as execuções posteriores.

7. Análise de coleção do G1 ou G2/M piscinas e fracções.

Nota: a fim de demonstrar a eficácia da elutriation, cada fração é analisada para contagem de células, diâmetro de célula e conteúdo de DNA, e piscinas são criadas de células na fase G1 ou G2/M para análises de immunoblot, conforme descrito no Resultados do representante. Esta secção de protocolo irá descrever como criar esses pools e prepará-los para uso experimental.

1. Girar cada fração a 2000 x g por 5 min a 4 ° C e aspirado de buffer de elutriation.
2. Combinar frações juntos a fim de obter uma piscina de fase G1 e G2/M piscina fases.
   1. Para o G1 fase piscina, resuspenda fracções que foram coletadas na faixa de velocidade de 788 x g a 661 x g (F1 - F5) em um total de 1 mL de solução salina-tampão fosfato (PBS) e transferir para um tubo cônico de 15 mL. Para o pool de fases G2/M, resuspenda fracções que foram coletadas na faixa de velocidade de 387 x g e 333 x g (F17 - F20).
   2. Spin para baixo as células a 2000 x g por 5 min a 4 ° C e aspirado fora PBS.
3. Ressuspender as células em 10 mL de mídia de crescimento e tomar uma contagem de células.
4. Tomar uma alíquota de cada grupo para ser analisado por DNA conteúdo através de coloração de iodeto de propidium e fluxo cytometric análise ¹⁵.
   Nota: O restante de cada pool pode ser usado para novas experiências.

Resultados

Primária todas as células (3-4 x 10⁸) foram submetidas a elutriation centrífuga e coletadas em duas fracções de lavagem e vinte principais frações, conforme descrito no protocolo. A tabela 1 mostra dados representativos, onde o número total de células em cada fração, bem como a velocidade do rotor correspondente é apresentado. Em geral rendimento era tipicamente mais de 80%. Medição do diâmetro da célula em frações individuais confirmou esse diâmetro celular aumentou com o avan...

Discussão

Descrevemos um método de obtenção primária todas as células em diferentes fases do ciclo celular usando o CCE. Sob condições ideais uma população essencialmente pura de células na fase G1 e uma população altamente enriquecida de células em G2/M fases prontamente poderiam ser obtidos em excelente rendimento, e células altamente enriquecidas em fase S também podem ser obtidas se desejado. Os resultados aqui apresentados foram obtidos usando um primário de que toda cultura (especificamente, ALL-5) e essencialmente idênticos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina balanceada Hanks	Lonza	10-508Q	Frasco de 1 L
Fetal Plus soro bovino	Atlas Biologicals	FP-0500-A	Frasco de 500 mL
Sal dipotássico de ácido 2-napthol-6,8-dissulfônico	Acros Organics	212-672-4	100 g em pó
50 mL tubos conciais	Denville Scientifics	C1062-P	500/caixa
Membrana PES 0.22 µ m unidade de filtro	Millipore	SLGP033RB	250/pacote
Avanti J-26S XPI c/ Elut. Não-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V	Centrífuga Beckman Coulter	B14544	compatível com o sistema de elutriação
JE 5.0 kit de rotor elutriador	Beckman Coulter	356900	que inclui o rotor, chave sextavada com alça em T, o conjunto de liberação rápida (sem a câmara de elutriação), cabo de ancoragem e a câmara de montagem estroboscópica
, padrão, 4 mL, "A"	Beckman Coulter	356943	câmara de elutriação padrão
Cabeça de bomba Masterflex L/S Easy-Load	Cole-Parmer	EW-07518-10
Masterflex L/S Variable-Speed Drive	Cole-Parmer	EW-07528-10
Tubo de bomba de silicone curado com platina Masterflex BioPharm, L/S 16	Cole-Parmer	EW-96420-16
Agulha Precision Glide 25 G x 1.5	BD	305127	agulhas estéreis de uso único
10 mL Luer-Lok seringa	BD	309604	seringas estéreis de uso único
Vi-Cell XR Beckman	Coulter	383556
tampão de coloração PI/RNase	BD Pharmingen	550825 Tampão	coloração de iodeto de propídio/RNase
ciclina B1 (GNS1) anticorpo IgG monoclonal de camundongo	Santa Cruz Biotecnologia	sc-245
ciclina D1 (DCS-6) anticorpo IgG monoclonal de camundongo	Papai Noel Cruz Biotechnology	sc-20044
P-Rb (S807 / 811) (D20B12) XPR anticorpo monoclonal de coelho	Tecnologia de sinalização celular	8516s
GAPDH (14C10) anticorpo monoclonal de coelho	Tecnologia de sinalização celular	2118s
IgG anti-rato de cabra (H + L) -HRP conjugado	BioRad	170-6516
IgG anti-coelho de cabra (H + L) -HRP conjugado	BioRad	170-6515