Desenvolvimento de ensaio para quantificação de conteúdo elevado de Sod1 proteína mutante formação agregada em células vivas

Resumo

Nós descrevemos um método para quantificar a agregação de misfolded proteínas. Nossos detalhes de protocolo Lentivirus induzida por geração de linha celular estável, imagem latente confocal automatizada e análise de imagens de agregados de proteínas. Como uma aplicação ilustrativa, estudamos o efeito de pequenas moléculas na promoção da SOD1 agregação de maneira tempo e dose-dependente.

Resumo

Esclerose lateral amiotrófica (ela) é uma doença neurodegenerativa fatal que pode ser causada por mutações herdadas no gene codificação cobre-zinco superóxido dismutase 1 (SOD1). A instabilidade estrutural da SOD1 e a detecção de inclusões de SOD1-positivo em pacientes familiar-ALS suporta um potencial papel causal para SOD1 misfolded e/ou agregados em patologia de ALS. Neste estudo, descrevemos o desenvolvimento de um ensaio de baseada em célula projetado para quantificar a dinâmica da agregação de SOD1 em células vivas pelo alto teor de abordagens de triagem. Usando vetores Lentivirus, geramos linha celular estável expressam o tipo selvagem e mutante SOD1 A4V marcados com proteína fluorescente amarela e achei que ambas as proteínas foram expressos no citosol sem qualquer sinal de agregação. Curiosamente, apenas SOD1 A4V expressa estàvel em HEK-293, mas não em linhas de células U2OS ou SH-SY5Y, formaram agregados tratamento inibidor de proteossomo. Mostramos que é possível quantificar a agregação com base na análise de dose-resposta de vários inibidores do Proteassoma e para rastrear agregado-formação cinética por microscopia de lapso de tempo. Nossa abordagem introduz a possibilidade de quantificar o efeito das mutações ALS sobre o papel da SOD1 na formação de agregados, bem como a triagem para pequenas moléculas que impedem a agregação de SOD1 A4V.

Introdução

A agregação de proteínas é um processo biológico pelo qual misfolded grupo de proteínas acima e pode atuar como agentes causadores de doenças neurodegenerativas (amiloidose). Caracterizando a agregação da proteína é essencial compreender o papel dos agregados na disfunção celular, bem como facilitar a descoberta de novos fatores que influenciam o aparecimento da patologia. A visualização de proteínas fluorescência-etiquetadas em células vivas é um método poderoso que pode ajudar no desenvolvimento dos ensaios aplicáveis ao alto teor de triagem (HCS)^1,2,3,4.

Esclerose lateral amiotrófica (ela) é considerada uma doença proteopathic causada pela presença de misfolded proteínas com a propensão para agregar e se acumulam nos neurônios motor tanto familiar ALS (fALS) e esporádicos ALS (Vanessa)^5,6 . Um subconjunto de ~ 20% dos casos de fALS estão associados com mutações dominantes no gene que codifica a enzima antioxidante citosólica cobre-zinco superóxido dismutase tipo 1 (SOD1)^7,8. Foram propostas várias possíveis causas para essa disfunção geneticamente derivada, incluindo alterações na estrutura e função da SOD1 variantes, tais como a estabilidade aberrante, desdobrando-se aumento da taxa e propensão a agregação^{9, 10}. Notavelmente, a única propriedade verificada e potencialmente tóxica compartilhado por ambas as variantes ALS-lig SOD1 e selvagem-tipo (WT) SOD1 é uma maior propensão para formar agregados de proteína compartimentada ou inclusões proteicas^11,12 . Misfolded mutante SOD1, persistentemente é polyubiquitinated e degradados pelo sistema ubiquitina-Proteassoma. Como resultado, um baixo nível de inibição da atividade do proteossomo leva ao acúmulo de mutante que SOD1 agrega^13,14, quais estruturas de forma amorfa composta de componentes solúveis que podem trocar com solúvel mutante SOD1 no citosol¹⁵. Em particular, SOD1 mutante A4V (alanina no códon 4 mudada para valina) é a mutação mais comum causando o ALS e leva a neurodegeneração rápida com um tempo médio de sobrevivência de menos de 2 anos após o aparecimento de doença¹⁶. Bioquimicamente, A4V SOD1 tem uma tendência crescente para monomerizar, agregar e formar poros amiloides; seus agregados pore-como são semelhantes aos poros amiloides de outras formas de mutante ligado a doença, tais como synuclein-α e β-amiloide proteína¹⁷. Para estudar a dinâmica da acumulação de SOD1-agregado, métodos para monitoramento solúveis e insolúveis SOD1 formas agregadas continuam a ser desenvolvidos.

Temos mostrado anteriormente, usando a imagem latente da viver-pilha e células HEK-293 transitoriamente transfected com fluorescente com tag proteína SOD1, que mutações associadas ALS prejudicam SOD1 dimerização e agregação¹¹. Embora a expressão transiente sistemas podem fornecer informações úteis sobre o resultado biológico de curto prazo superexpressão do gene, métodos proporcionando integração estável de genes desejados podem ser preferenciais para o desenvolvimento do ensaio. Como tal, vetores de Lentivirus oferecem a capacidade de conferir a expressão do gene a longo prazo e regulamentado em células de mamíferos ¹⁸. Neste estudo, enfocamos a geração de linhas de células estáveis transfectadas com recombinante lentivirus rolamento WT e mutante SOD1 marcou com proteína fluorescente amarela (YFP). Usando microscopia da imagem latente de viver-pilha e quantificação automatizada de agregação de SOD1, desencadeada e quantificada eventos de agregação SOD1 mediante inibição da Proteassoma.

Protocolo

1. produção de lentivirus

Nota: A produção e manipulação de vetores Lentivirus foi realizado de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) para pesquisas envolvendo recombinante DNA. A codificação de plasmídeo o selvagem-tipo e A4V mutante SOD1 marcados com YFP reforçada (YFP-SOD1WT e SOD1A4V-YFP) são descritos em Kim et al. ¹¹ ambos os produtos de fusão do gene foram amplificados usando o par de primer PCR 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ e 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ e inserido o CMV de U3 pTRIP-delta plasmídeo ¹⁹ usando sites de restrição XhoI e BsrGI. Em experimentos anteriores, as células HEK-293T foram divididas em uma proporção de 1:4 a 1:6 em dois dias. Evasão de mais de 20 passagens e manutenção de células em menos de 60% confluencia ajuda para garantir a eficiência de transfeccao bom.

1. No dia 1, dividir células HEK-293T na confluência de 30-40% em uma placa de cultura de tecido de 10 cm de diâmetro (3 x 10 ⁶ células/prato) em 10 mL de meio de cultura celular (alta-glicose DMEM com 10% FBS e 4 mM L-glutamina) para a produção de vírus.
2. Manter a cultura de tecido de 10 cm de diâmetro da placa numa incubadora de CO ₂ (37 ° C, 5% CO ₂) durante a noite.
3. No dia 2, preparar uma solução de Transfeccao de DNA contendo 10 µ g de Lentivirus vetores (pTRIP-delta U3 CMV - YFP-SOD1WT ou - SOD1A4V-YFP) juntamente com as Particulas de Lentivirus de empacotamento (plasmídeos (5 µ g de pVSVg; 10 µ g de pCMV-dR8.71) Figura 2A) ²⁰. Adicionar 125 µ l de 1 M CaCl ₂ e ajustar o volume para 500 µ l com água destilada. Acrescente 500 µ l de 0,05 M de HEPES na mistura e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
4. Substituir HEK-293T médio com 10 mL pré-aquecido cultura meio fresco sem antibióticos misturado com 1 mL de solução de transfeccao DNA de células e incubar durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO ₂.
5. No dia 3, substituir a célula sobrenadante com meio de cultura fresco.
6. No dia 4, recolher o sobrenadante em um tubo de 15 mL e centrifugar durante 5 min à 500g x para remover as células mortas e detritos. Purifica ainda mais o sobrenadante por passagem através de um filtro de 0,45 µm, utilizando uma seringa de 60ml grande. Imediatamente dispensar em alíquotas de uso único (300 µ l) e armazenar a-80 ° C. Para manter a atividade máxima do produto, evitar um ciclo de congelamento-descongelamento.

2. Transdução de Lentivirus

1. dividir a linha celular infectada, na confluência de 60% (células HEK-293 e SH-SY5Y; 5 x 10 ⁵ células por bem e U2OS; 1 x 10 ⁵ células por poço) em uma placa de cultura de tecidos de 6-poços em 2 mL de mídia DMEM suplementada com 10% FBS.
2. Manter a placa de cultura de tecidos de 6-poços em uma incubadora de 37 ° C em 5% CO ₂ durante a noite.
3. Retire os lentivirus congelados do freezer-80 ° C e descongelar uma alíquota no gelo antes de cada utilização; não recongelar.
4. Enquanto o vírus está descongelando, aquecer o meio de cultura celular contendo o soro compatível com a linha de células de interesse. Uma vez que o vírus é totalmente descongelado, preparar uma série de diluições (1:3, 01:10, 01:30 e 1: 100) em DMEM em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
5. Trazer o volume nos tubos de 1 mL com mídia de soro reduzida.
6. Adicionar 2 µ l de Polybrene (em um estoque de 4 µ g / µ l) a 1 mL de vírus/mídia. Misture bem por pipetagem e adicione 1 mL da mistura para as células. Incubar as células com o vírus por 24 h.
7. Remover a mídia de vírus e substituir com mídia DMEM normal suplementada com 10% FBS. Manter as células a 37 ° C, 5% de CO ₂.
8. Monitorar o crescimento das células e alterar os meios de cultura em dois dias. Na confluência, expandir o prato 6-poços em uma placa de cultura de tecido de 10 cm de diâmetro.
9. , Uma vez que as células têm sido suficientemente expandidas, células de ⁴ sementes 1.5 x 10 por bem em 50 µ l de mídia DMEM em placas de ensaio 384-bem para verificar o nível de expressão da YFP etiquetado proteína por microscopia. Se a YFP tagged proteína celular expressão mostra uma relação sinal-ruído ≥ 3, preparar o estoque de célula para a correspondente linha de celular.

3. Tempo de efeito dependente do inibidor de proteossomo na agregação da proteína

Nota: realizar a aquisição de imagens usando um microscópio automatizado (ver materiais).

1. Dispensar 0,25 µ l de DMSO ou Proteassoma inibidor dissolvido em 100% DMSO (fixador, 2mm) em placas de fundo plano 384-bem.
Mídia
2. manualmente semente 1.5 x 10 ⁴ células por poço em 50 µ l de DMEM no mesmo ensaio de placa. A concentração final de proteossomo inibidor (fixador) deve ser de 10 µM.
3. Configurar a unidade de controle ambiental do sistema de microscópio a 37 ° C e 5% de CO ₂. Uma imagem da instalação experimental é mostrada na Figura 3.
4. Operar o microscópio em modo de fluorescência de campo largo, usando o software com as seguintes configurações: LWD 20 X objetivo, modo non-confocal, 4 campos/bem, com um intervalo de captura de uma hora. No final de cada corrida, as imagens capturadas são automaticamente enviadas para o servidor.

4. Tempo de imagem lapso para expressão YFP em células vivas e análise (canal único) da imagem

Nota: as etapas a seguir descrevem a aplicação do software (por exemplo, Colombo).

Algoritmo de

1. selecionar o apropriado para segmentar os objetos primários (citosol e agregados). Se necessário, ajustar parâmetros limite e o contraste de fundo ( Figura 4).
2. Contagem de células usando ' encontrar células ' com um limiar individual de 0,1 para o canal de intensidade YFP. Determinar agregados usando uma ' encontrar pontos ' algoritmo com uma intensidade relativa de ponto YFP > 0.2 e um coeficiente de divisão de 1.0.

5. Efeito de resposta de inibidores do Proteassoma na agregação de proteínas em células vivas coradas para seus núcleos (dois canais) de dose

Nota: realizar a aquisição de imagens usando um microscópio automatizado. Determinar o intervalo de concentração de inibidores do Proteassoma (fixador, Epoxomicin e MG132) baseado no IC ₅₀ valor esperado para garantir um ajuste de curva ideal.

1. Preparar diluições em série de compostos em polipropileno um armazenamento 384-poço da placa pela norma série de diluição de 1:3. Certifique-se de misturar as diluições compostas bem para garantir que as concentrações de compostos são precisas.
2. Dispensar 0,25 µ l de inibidores do Proteassoma em placas de ensaio vazio de 384-bem preto de fundo plano. Nós usamos um manipulador líquido equipado com uma cabeça de 384-capilar capaz de transferir volumes.
3. Sementes de 1,5 x 10 ⁴ células por poço em 50 µ l de DMEM Media em placas de ensaio. Incubar as placas de ensaio em 37 ° C e 5% CO ₂ por 24 h.
4. Adicionar 10 µ l de DMEM Media (pré aquecido a 37 ° C), com coloração de solução (Hoechst 33342 em um estoque de 10 mg/mL) e incubar a temperatura ambiente por 10 min.
5. Lançar a microslidar o software operacional. Uma imagem da instalação experimental é mostrada na Figura 6. Selecione o " configuração " guia e selecione 20 X objetivo e o tipo de placa correta. Certifique-se de " colar " é definido como o valor correto no objectivo permitindo foco adequado com tipos diferentes de placa.
6. Selecione o " microscópio " Tab. definir exposição 1 como YFP (488 laser) e exposição 2 como Hoechst (laser 405). Ativar o filtro em ambas as exposições e atribuir a exposição 1 a câmera 1 e 2 de exposição a câmera 2. Conjunto de tempos de exposição para ~ 800 ms para exposição 1 e ~ 40 ms para exposição 2.
Exposição de
7. select 1. Definir a altura de foco a 0 µm. Select " foco ". Uma vez focado, exponha a câmara 1. Ajustar a altura do foco para otimizar o avião de exposição e clique no " tomar altura ". Alterar os tempos de exposição e poder dar uma intensidade máxima de pixel de ~ 3.000 laser. Salve os parâmetros de exposição. Repita para exposição 2.
8. Select " definição de experimento " Tab criar um layout e sublayout. Arraste e solte o layout relevante, exposição, imagem de referência, o arquivo skewcrop e sublayout. Salvar o experimento.
9. Select " experimento automático " guia e adquirir imagens. No final de cada corrida, as imagens capturadas são automaticamente enviadas para o servidor.

6. Análise de duas imagens de canal de imagem

1. selecionar o algoritmo de software para segmentar os objetos primários (núcleos, citoplasma e agregados) ( Figura 7).
2. Selecione o método que segmentos núcleos com precisão por inspeção visual dos objetos segmentados. Objetos Hoechst-manchado no canal 1 (Ch1) serão usados para determinar o número de células. A coloração YFP de mutante SOD1-A4V no canal 2 (Ch2) será usado para determinar a quantidade de agregados.
3. Contagem de células usando o ' encontrar núcleos ' algoritmo como regiões Hoechst-coloração > 20 µm ², com um fator de divisão de 7.0, um limiar individual de 0,40 e um contraste > 0,10.
4. Criar a tabela de dados e determinar CE ₅₀ para cada um dos compostos usando a ' regressão não-linear ' equação no gráfico software.

Resultados

Gerar a linha de celular estável usando lentivirus: A estratégia global para o monitoramento de agregados de proteína SOD1 é ilustrada na Figura 1. Em uma primeira etapa, geramos um vetor de Lentivirus expressão para entrega de estável do gene SOD1 em linha de celular (etapa 1). Dois vetores Lentivirus codificação YFP-tag SOD1 WT e SOD1 A4V (YFP-SOD1WT e SOD1A4V-YFP, respectivamente) com embalagem e envelope plasmídeos foram preparados (

Discussão

Existem duas abordagens principais para a geração de linhas de células estáveis. A primeira leva várias semanas e requer seleção transitória do transfection e resistência dos vetores de DNA genômico de plasmídeo integrado. A segunda leva a uma questão de horas através do uso de lentivirus, tornando este protocolo favorável para a efetiva expressão da proteína do alvo em várias linhas de célula com esforço limitado. A viagem-CMV vector¹⁹ foi um vetor sustentado de usar, com eficiência de transdução...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ALLN (C20H37N3O4)	Millipore	208719
MG132 (C26H41N3O5)	Sigma-Aldrich	C2211
Epoxomicina (C 28H50N4O7)	Sigma-Aldrich	E3652
Hoechst 33342	Invitrogen	H-3570
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Opera EvoShell software	Perkin Elmer	Ver 1.8.1
Opereta	Perkin Elmer	OPRT1288
Software de imagem Harmony	Perkin Elmer	Ver 3.0.0
Software de análise de imagem Columbus	Perkin Elmer	Ver 2.3.2
CyBi Hummingwell manuseio de líquidos	CyBio AG	OL 3387 3 0110