Estabelecer modelos de Mouse para doenças neurológicas induzida por vírus Zika usando estratégias de injeção Intracerebral: embrionárias, Neonatal e adulto

Resumo

Aqui nós descrevemos um método para estabelecer um modelo de Zika a microcefalia induzida por vírus no mouse. Este protocolo inclui métodos para inoculação intracerebral embrionária, neonatal e adulto-fase do vírus Zika.

Resumo

O vírus Zika (ZIKV) é um flavivirus atualmente endêmica na América do Sul, Central e do Norte. Agora está estabelecido que o ZIKV pode causar microcefalia e anormalidades cerebrais adicionais. No entanto, o mecanismo subjacente a patogênese da ZIKV no cérebro em desenvolvimento permanece obscuro. Intracerebrais métodos cirúrgicos são frequentemente usados em pesquisas de neurociência para responder a perguntas sobre o desenvolvimento normal e anormal do cérebro e a função cerebral. Este protocolo utiliza técnicas cirúrgicas clássicas e descreve os métodos que permitem que um modelo associado a ZIKV humana doença neurológica no sistema nervoso do rato. Enquanto inoculação direta do cérebro não modelar o modo normal de transmissão do vírus, o método permite que os investigadores perguntas específicas relativas a consequência após infecção ZIKV do cérebro em desenvolvimento. Este protocolo descreve estágios embrionários, Neonatais e adultos de inoculação intraventricular de ZIKV. Uma vez dominado, este método pode tornar-se uma técnica simples e reprodutível que leva apenas algumas horas para executar.

Introdução

Microcefalia é uma condição resultante do desenvolvimento do cérebro defeituoso caracterizado por menor do que o tamanho médio da cabeça em recém-nascidos. Crianças com microcefalia apresentam uma gama de sintomas que podem incluir atraso de desenvolvimento, convulsões, deficiência intelectual, perda de audição, problemas de visão e problemas com movimento e equilíbrio, entre outros, dependendo da gravidade da doença e causa a^1,2,3. Esta condição é multifatorial na natureza, com o agente infeccioso, genética e fatores ambientais relacionados ao causar microcefalia

Protocolo

Todo animal usar protocolos siga as orientações de cuidados com animais da Universidade do Sul da Califórnia e da Universidade da Geórgia. Métodos de eutanásia para barragens grávidas e adultos são executados de acordo com protocolos aprovados: asfixia de dióxido de carbono, seguida por deslocamento cervical como um método secundário para garantir a eutanásia. Filhotes neonatais são sacrificados por decapitação.

Atenção: O seguinte protocolo envolve lidar com um vírus patogênico. Precaução adequada deve ser tomada durante a manipulação do vírus. Todos os protocolos devem ser aprovados por prévia Comissão institucional adequado para usar.

Resultados

Imagens representativas de nossos métodos de injeção para a inoculação de ZIKV do cérebro embrionário são mostradas em diagramas com injeções intracerebrais (figura 1A) e intra-uterina e injeções de intraplacental (figura 1B), ilustrando a maneira a barragem grávida e embriões devem ser vistos e orientados para a cirurgia (protocolo de inoculação embrionárias). Figura 2A apresenta infecção ZIKV (MEX1.......

Discussão

Descrito aqui é um método de inoculação intracerebral do ZIKV em fases embrionárias, Neonatais e adultos para a investigação de danos ZIKV-induzida no desenvolvimento do cérebro. Embora simples, há algumas considerações que os investigadores devem tomar para garantir a qualidade do estudo e a segurança dos envolvidos.

DENV está intimamente relacionado com a ZIKV do gênero flavivirus. DENV não tem sido associada causalmente com desordens cerebrais pediátricos nos seres humanos. DENV2 com êxito .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Eixo de transmissão flexível Broca Suspensão Motor	Leica	39416001
Mouse Stereotax	Kopf	04557R
Micro4 Microsseringa Controlador de bomba	WPI	SYS-MICRO4
UMP3 UltraMicroPump	WPI	UMP3
Modulamp Tubulação
(calibre 19)	Hamilton	90619
Ponto de fusão capilar	Kimble	34500-99	Agulha de vidro
Fluoro-Max: Microesferas fluorescentes vermelhas	Thermo Scientific	R25	Sem diluição; Use para prática de injeções
10 µ L, Modelo 1701 LT SYR	Hamilton	80001	para inoculação embrionária
10 µ L, Modelo 1701 RN SYR, Pequeno NDL Removível, 26s ga, 2 pol, estilo de ponta 2	Hamilton	80030	para recém-nascido/adulto
4-0 Suturas de Nylon		Etônico-Óleo
Mineral	VWR	de
micropipetas	Sutter Instruments	P-1000
Micropipeta Grinder	Narishige	EG-44
Fastgreen FCF Dye	Sigma	F7252	injeta com 0,5% < anticorpos > corante
anticorpo de antígeno do grupo Flavivirus	Millipore	MAB10216	ms IgG2a 1:400 (Figura 2, Figura 3)
Pax6	DBHB	Pax6-s	ms IgG1 1:20

Schott-Luer-lock Extrator