Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Summary

Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.

Abstract

Zebrafish emergiram como um poderoso modelo de várias doenças humanas e uma ferramenta útil para uma gama crescente de estudos experimentais, abrangendo fundamentais da biologia do desenvolvimento através de telas em grande escala de genéticas e químicas. No entanto, muitas experiências, especialmente aqueles relacionados à infecção e modelos de enxerto heterólogo, dependem de microinjeção e imagem latente de embriões e larvas, que são técnicas laboriosas que exigem habilidade e experiência. Para melhorar a precisão e a taxa de transferência de técnicas de microinjeção atuais, desenvolvemos uma série de dispositivos microstructured orientar e estabilizar o zebrafish embriões na fertilização de post 2 dias (dpf) em orientação lateral, ventral ou dorsal, antes do procedimento. Para ajudar à imagem de embriões, criamos um dispositivo simples com canais que orientar 4 zebrafish lateralmente em paralelo contra uma lamela de vidro. Juntos, as ferramentas que apresentamos aqui demonstram a eficácia das abordagens fotolitográfica para gerar dispositivos úteis para a otimização das técnicas de zebrafish.

Introduction

Zebrafish emergiram como um poderoso modelo para muitos campos, a partir de estudos de fundamental biologia do desenvolvimento de grande escala genética e química telas^1,2. Rotina manipulações genéticas, tais como a superexpressão do gene, nocaute, CRISPR/Cas9 mutagênese e transgênese dependem de microinjeção de material genético para o zigoto unicelular, que levou ao desenvolvimento de simples, fácil de usar, comercialmente ferramentas disponíveis para orientar e estabilizar os ovos para injeção³. Outras abordagens, tais como transplante e infecção, muitas vezes exigem microinjection e....

Protocol

Microinjeção de larvas foi aprovada pelo Massachusetts General Hospital Subcomissão de pesquisa cuidado de Animal sob protocolo 2011N000127.

1. dispositivo fabricação

Nota: Todos os computador assistida (CAD) arquivos de desenho utilizados para a concepção de máscaras de fotolitografia descritas aqui (Figura 1) estão disponíveis para download. Consulte tabela de materiais para links.

1. Fabrica a bolacha de molde mestre em uma sala limpa de classe 1.000 usando técnicas padrão fotolitográfica⁷. Para os canais e matrizes de microestrutura, padrão o fotorr....

Results

A abordagem descrita aqui demonstra o projeto (Figura 1) e fabricação de dispositivos para uso com 2 dpf zebrafish, usando fotolitográfica (Figura 2) e técnicas de macio-litografia (Figura 3). Este método permite testes rápidos de muitas iterações de projeto e as modificações e alterações e otimização de dimensões de microestrutura para uso com zebrafish em outras fases do desenvolvimento podem esten.......

Discussion

Aqui, descrevemos o uso de dispositivos recentemente desenvolvemos para facilitar 2 dpf zebrafish microinjeção⁵e introduzir um dispositivo de montagem simples de agarose-livre para a imagem latente conveniente de embriões. Estas ferramentas destacam-se o utilitário de fotolitográfica técnicas para a fabricação de dispositivos úteis para as técnicas de zebrafish.

Encontramos dispositivos MSA particularmente útil para a injeção de células ou partículas propenso a agregaçã.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184 Polidimetilsiloxano (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0,5KG	Para fundir os dispositivos. O kit inclui monômero PDMS e iniciador
Agarose de baixa temperatura de gelificação	Sigma Aldrich	A9414-10G	Para dispositivos de fundição de agarose
PFDTS silano	Sigma Aldrich	448931-10G	Para fundição de moldes PDMS negativos
Tricaína (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	Para anestesiar peixe-zebra
Rodamina Dextran 70.000 Da	ThermoFisher	D1818	Para rastrear microinjeções
Leucotrieno B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Quimioatraente de neutrófilos
N-formilmetionina-leucil-fenilalanina (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Quimioatraente de neutrófilos
15 cm Placa	Petri Fisher scientific	08-757-148	Para fundição do wafer mestre
Placas de 6 poços com fundo de vidro	MatTek	P06G-0-20-F	Para dispositivos de imagem
Microcapilares de vidro borossilicato	Scientific Instruments	TW-100-4	Para agulhas de microinjeção
Pipetas de transferência	Sigma Aldrich	Z350796	Para transferência de embriões de peixe-zebra Pontas
microcarregador	Fisher scientific	E5242956003	Para carregar as agulhas de microinjeção
Harris Uni-Core 1,5 mm punch	Ted Pella Inc.	15111-15	Para perfurar portas em dispositivos de imagem PDMS
No. 11 Bisturi	Fine Science Tools	10011-00	Para cortar PDMS
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-10	Para descorionar embriões e quebrar pontas de agulhas de microinjeção
Marzhauser Micromanipulador	ASI	MM33-R	Para manipular agulha de microinjeção
Suporte	magnéticoMSC	SPI - 87242624	Para montagem de micromanipulador
MPPI-3 Controlador de picobomba	ASI	MPPI-3	Para controlar o volume e o tempo de microinjeção
Microscópio fluorescente invertido EVOS	ThermoFisher	EVOS FL	Para imagem de embriões injetados
Microscópio de dissecação	Nikon	SMZ745	Para visualizar microinjeção
Software AutoCAD	Autodesk		Faça o download dos arquivos do AutoCAD em: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 e na página wiki de protocolos da comunidade ZFIN: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki