Summary
Det här protokollet beskriver en inverterad vertikala invasion analysmetod som kunde användas för att kvantifiera migration och invasion funktionerna i celler i en tredimensionell miljö samtidigt bevara den cell mikromiljö. Denna analys är lämplig för sällsynta och/eller känsliga celler.
Abstract
Även om 3D invasionen analyser har utvecklats, återstår utmaningen studera celler utan att påverka integriteten hos deras mikromiljö. Traditionella 3D analyser såsom Boyden kammare kräver att celler är fördrivna från den ursprungliga kultur platsen och flyttade till en ny miljö. Inte bara stör detta cellulära processer som är inneboende i närmiljön, men det resulterar ofta i en förlust av celler. Dessa problem är särskilt utmanande när man arbetar med celler som är sällsynta eller mycket känslig för sin mikromiljö. Här beskriver vi utvecklingen av en 3D invasionen-analysen som undviker både oro. I denna analys, celler är klädd i en liten väl och en ECM matris som innehåller ett korrektiv läggs ovanpå cellerna. Detta kräver ingen förskjutning av cellen, och cellerna att invadera uppåt in i matrisen. I denna analys, kan cell invasion samt cellmorfologi bedömas inom kollagen gelen. Med denna analys, karakterisera vi invasiv kapacitet av sällsynta och känsliga celler; hybrid cellerna resulterar från fusion mellan bröstcancerceller MCF7 och mesenkymala/multipotenta celler stamceller/stroma (MSCs).
Introduction
Cell motilitet är en normal utveckling och fysiologiska process av celler. Förändringar i mönstret och förmågan hos celler att migrera och invadera associeras dock med sjukdomstillstånd inklusive inflammatoriska sjukdomar och cancer metastaser1,2,3. Metastaser är utan tvekan den mest dåligt förstådd aspekten i cancer. För att metastasera, måste cancerceller förnedra extracellulära matrix (ECM), invadera den lokala vävnaden och intravasate. En gång i omlopp, kommer cancercellerna sprida till den avlägsna platsen, extravasate och bilda sekundära tumörer. Därför möjligheten av celler att försämra ECM, att migrera och att invadera är relaterad till deras metastatisk potential. Olika metoder har utvecklats för att analysera och kvantifiera migration och invasion funktionerna i celler. De mest använda metoderna inkluderar de sårläkning assay, time-lapse mikroskopi och Boyden kammare analysen. Såret helande assay4 och time lapse microscopyen är enkel och bekväm analyser som skulle ge preliminära inblick i cellmigration. Båda är dock 2D analyser som inte återspeglar 3D-miljö där det finns celler i vivo. Studier har visat att celler reagerar olika på en 3D-miljö jämfört med en 2D en5,6. Dessutom är sår helande analyserna svåra att återskapa och ge kvantitativa resultat7,8,9. Cell säkerhetszon analysen, som är en 3D ändring av såret läka assay, är en mer fysiologiskt relevanta analys men det passar inte för celler låg i antal som hybrid celler som härrör från cell fusion händelser10,11 .
Boyden kammare analysen är en 3-dimensionell som ger relevanta mikromiljö för cellulära studier. Det kräver dock celler tas bort från deras ursprungliga närmiljön och deponeras i den övre kammaren Boyden assay systemet att migrera och invadera nedåt mot korrektiv innehållande medium. Denna 3D strategi är inte lämpligt i analysera cellerna sårbara för deras närmiljön eller begränsade i nummer10,11,12migration och invasion förmåga. En nyare metod att analysera cellmigration och invasion är mikroflödessystem gradient kammare assay13. Även om lämplig och tillförlitlig i migration och invasion studier, denna analys är dyrare och kunde vara tekniskt utmanande för en typisk laboratorium. Vi beskriver här en enkel inverterade vertikal invasion analysmetod som är kompatibel med många celltyper inklusive celler som är känsliga för sin mikromiljö och/eller begränsade i antal. Denna analys anpassades från protokollet föreslås av Hooper et al. 14. i denna analys, cellerna kvar i sin ursprungliga närmiljön och deras flyttning och invasion övervakas när de flyttar uppåt i kollagen gel som innehåller en korrektiv11. Denna analys är reproducerbara och har optimerad och godkänts i 35-mm kultur skålen. Det kan anpassas till olika assay villkor inklusive olika cell kultur storlekar, olika matriser eller styrka vidhäftning, och olika chemoattractants. Denna analys skulle kunna tjäna som en in vitro- plattform för inledande bedömning i den drug discovery-processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Detta protokoll beskrivs i McArdle o.a. 11. en tidslinje ges i figur 1.
1. beredning av kultur plattan
- Tvätta den 35 mm kultur maträtt som innehåller en 10 mm glas-botten väl med 1 mL 1 M saltsyra (HCl) för 15 min till sänka den vattenavvisande egenskaper av glas-botten.
- Tvätta kultur plattan två gånger med 1 mL av fosfat buffert saltlösning (PBS) för att bli av alla i HCl.
- Tvätta kultur plattan två gånger med 1 mL 70% etanol.
- Skölj kultur plattan med 1 mL av den specifika cellodlingsmedium (här, Använd α-MEM kompletteras med 10% värme inaktiverat FBS och 1% icke-essentiella aminosyror).
Obs: Behandlade kultur plattan som innehåller odlingsmediet kan lagras i CO2 inkubator med en luftfuktare vid 37 ° C tills nästa dag. - Växa cellerna (MSCs och MCF-7 samarbete kultur) i behandlat glas-botten väl av 35mm kultur skålen till 100% konfluens. Samarbete kultur 35.000 MSC celler och 75.000 av MCF7 celler för 24 h.
2. beredning av kollagen gel
- Lagra mikropipett tips används för pipettering kollagen gelen i frysen för att förhindra polymerisation av kollagen vid kontakt.
Obs: Detta är det mest kritiska steget. - Bestämning av en volym av rat tail kollagen I användas baserat på koncentrationen av kollagen beståndet. Förbereda 100 µL av kollagen gel för denna analys.
Obs: Hög koncentration av rat tail kollagen jag lagerför fungerar bättre. Bestäm volymen av 10 x Dulbeccos modifierade örnens Medium som skall användas att späda kollagen med detta. - Kombinera på isen rat tail kollagen I (3,8 µg/mL lager), 10 x Dulbeccos modifierade örnens Medium och 1 x cellodlingsmedium kompletteras med 2% fetalt bovint serum och den lämpliga korrektiv till en slutlig koncentration av kollagen 2,4 mg/ml.
- Lägg till i den blandningen 4,5% av natriumbikarbonatlösning att neutralisera kollagen gelen.
Obs: Volymen av natriumbikarbonatlösning lagt till kan variera beroende på den exakta pH andra reagenser. Det är bäst att testa blandningen med pH-remsor för neutral lösning eller Använd en pH-indikator i odlingssubstratet. - Lägg 80 µL av kollagen blandningen över cellerna inom glas-undersida väl kultur skålen.
- Tillåta kollagen gelen att polymerisera i 30 min i en CO2 inkubator med en luftfuktare vid 37 ° C.
- Täcka kollagen gelen med 2 mL cell medium med lägre serum (2%) och inkubera cellerna vid 37 ° C i en CO2 inkubator med en luftfuktare för 24, 48 eller 72 h.
Varning: Plattan ska hanteras med omsorg för att förhindra kollagen gelen från lossa från glas botten.
3. exempel på beredning av kollagen gel med rat tail kollagen lager 3,8 µg/ml
- På isen, kombinera 114,5 µL av rat tail kollagen, 16,6 µL 10 x DMEM och 33,1 µL av odlingsmedium som innehåller korrektiv.
- Neutralisera kollagen blandningen med 14,0 µL av natriumbikarbonat.
- Fortsätt som i steg 2.5.
4. imaging av celler
- Ta försiktigt bort mediet från skålen.
- Skölj försiktigt gelen med 1 mL PBS.
- Fixa cellerna med 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD i 15 min.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 mL PBS.
- Färga celler med DAPI lösning (100 ng/mL) i 20 min i rumstemperatur.
- Bild cellerna med confocal Mikroskop på olika platser och tar 400 µm z-stack bilder av varje plats i 16 µm-steg. Mikroskopet används har en disk skanna enhet som möjliggör confocal bildåtergivning med ett vitt ljus, arc exciteringskälla. Använd en 20 X lins utnyttjas med numeriska bländaröppningen på 0,75.
- Beredes bilder.
- Öppna bilder för en viss gel (cirka 25 bilder) och skapa en bildstapel genom att klicka på image → stackar → bilder att stapla. Den första bilden motsvarade till botten av gelen (z = 0 µm), den andra bilden motsvarade det första steget i z riktning (z = 16 µm), tredje bilden motsvarade det andra steget i z riktning (z = 32 µm). Bedöma varje kärna på varje bilddjup och utse djupet på som var kärnan i skarpaste fokus som invasionen djup för att viss cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har använt en 35 mm kultur maträtt med ett glas botten och rat tail kollagen I till utveckla och optimera en in vitro- 3D invasion assay protokoll. Med denna analys, visade vi att bröstcancer cancerceller MCF7 och MSC celler kunde invadera i kollagen gelen till ett genomsnittligt avstånd av 0,04 ± 1,8 µm och 41,3 ± 76,0 µm respektive efter 48 h när IGF1 (18,6 ng/mL) användes som korrektiv (figur 2). Viktigare, visade vi att fusion produkter från MSC och MCF7 celler, som är sällsynta celler, kunde invadera in i kollagen-gel samt. Deras genomsnittliga avstånd av invasion i 48 h var 10,7 ± 12,4 µm när IGF I på 18,6 ng/mL användes som korrektiv (figur 2). Skillnaden i invasion kapacitet mellan MCF7 och MSCs var statistiskt signifikant (P < 0,01)11. Skillnaden mellan invasion förmåga av fusion produkter och en av MCF7 eller nyckelkraven var inte statistiskt signifikant. Denna analys visade dock konsekvent att cancer cell fusion produkterna hade en större flyttande och invasiv kapacitet än föräldrarnas cancercellerna, MCF7.
Cellerna var fortsatt god under hela experiment som framgår av deras morfologi och kvantitet 48 h post gel polymerisation (figur 3en). Med inverterade vertikal invasion assay design, kineticsen av cellmigration och invasion kan vara analyserade (figur 3b, 4) och cellmorfologi kan bedömas (figur 4).
Figur 1 : Tidslinje av inverterade vertikal invasion assay design Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Invasion anlagen av cancer cell fusion produkter. Invasion kapacitet cancer cell fusion produkter kunde fastställas med inverterade vertikal invasion-analys. Siffrorna representerar den genomsnittliga invasion kapaciteten av fyra oberoende fusion produkter från tre separata samtidig kulturer och deras föräldrars cellinjer som analyseras från åtta olika områden inom varje analys. Detta experiment utfördes i tre exemplar. ANOVA med Tukey's HSD post hoc-test. ** P < 0,01. Felstaplar representera standardavvikelsen (SD). Denna siffra har anpassats från 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Cell livskraft och Z serien inverterade vertikal invasion analysens.
(a) 20 X ljusa fält bilder visar morfologi av celler under kollagen gel efter två dagar. Från vänster till höger MCF7 och MSC samtidig kultur, MCF7 och MSC; (b) representation av z-serien visar två platser (i och ii) inom en maträtt från botten till toppen. Bildföljden är 16 µm apart. 3,8% FBS användes som ett korrektiv. Gröna cirklar på båda paneler visar invaderande celler; Obs, ur fokus på botten av gel och i fokus i top gel, invaderar i gelen. Röda cirklar på båda paneler visar celler kvar på nedre lagret av z-serien (icke-invaderar celler). Skalstapeln (a): 15 µm; Skala bar (b): 10 µm. Denna siffra har anpassats från 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Cell morfologi i inverterade vertikal invasion analysen. Morfologi av MSCs i kollagen gel på en plats från botten (Z = 0 µm) till Z = 20 µm. 3,8% FBS användes som ett korrektiv. Den långa pilen anger bihang till en MSC invaderande in i gelen. Pilspetsen visar en magisterexamen, som arrangera i rak linje längs botten av gelen, och inte invaderande. Blå visar nukleära DAPI fläcken medan röda visar phalloidin målat aktin filament. Denna siffra har anpassats från 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett enkelt inverterade vertikal invasion-test som är bekvämt för olika celltyper inklusive celler som är sällsynta och/eller beroende av sin mikromiljö. I denna 3D invasionen analys, celler kvar i sin ursprungliga mikromiljö och omfattas av kollagen gel som innehåller en korrektiv. Cellerna sedan migrera och invadera i kollagen. I denna analys, kan cellerna färgas och enkelt övervakas inom gelen. Enkelheten och reproducerbarhet av denna analys gör det till ett praktiskt verktyg för att studera cancer cellmigration och invasion i en 3D-system. Stark chemoattractants verkar emellertid krävas att bryta cell affinitet till botten av skålen kultur.
Vi har optimerat inverterade vertikal invasion analysen i 35-mm kultur skålen. Denna kultur maträtt har en 10 mm glas-botten väl som är väl utrustad för imaging. En begränsning av denna kultur maträtt är den betydande mängden kollagen gel krävs för att utföra ett test. Att hitta mindre kultur rätter med en design som är kompatibel med imaging skulle vara mer ekonomiskt. Lagrets gel lämplig för 35 mm maträtt design är mycket känslig på grund av dess styrka och kan enkelt loss från botten av plattan om inte hanteras försiktigt. En annan cell kultur design kan förbättra stabiliteten av lagrets kollagen gel men kompatibiliteten mellan kollagen gel styrka och cell livskraft bör optimeras.
Trots dessa begränsningar presenteras den inverterade vertikal invasion analysen många fördelar jämfört med andra 3D invasionen assay format. Den största fördelen är att celler kvar i sin ursprungliga kultur miljö, vilket inte är fallet i Boyden kammare analysen. Detta protokoll bevarar den cell närmiljön som är fördelaktigt för celler strikt kontrolleras av deras närmiljön som stamceller15. Denna analys också förhindrar cellskador eller cellförlust särskilt för celler som är känsliga eller sällsynta10,11. Dessutom med denna analys, kunde i cellmorfologi och associerade kinetik bedömas inom i gel, vilket inte är möjligt med Boyden kammare analys. Dessutom används inte den icke-fysiologisk polykarbonat eller polypropylen filter Boyden kammare assay systemet i inverterade vertikal invasion-analysen. Den inverterade vertikal invasion-analysen är en statisk design, det efterlikna inte den i vivo dynamisk miljö som mikroflödessystem invasion assay design erbjuder men det ger en enklare, mindre utmanande och kostnadseffektiva 3D miljö att kvantifiera migration och invasionen av en mängd olika celltyper i en bevarad och kontrollerad mikromiljö.
Inverterade vertikal invasion analysen har många potentiella tillämpningar i patofysiologiska studier. Detta synsätt skulle kunna fungera som en plattform för in vitro- att studera cell motilitet under fosterutvecklingen, sår läkning, och/eller inflammatoriska svar3. Cell interaktioner med ECM och andra celltyper under migration och invasion kan också undersökas med hjälp av detta protokoll. Denna analys kan också utgöra ett användbart verktyg för inledande drogkontroll av anti metastaserande droger. Modellsystem för organ-specifika cancer metastaser skulle kunna utvecklas med inverterade vertikal invasion analys samt.
Inverterade vertikal invasion analysen utvecklades för att kringgå den utmaning som förskjutningen av vissa celler från deras ursprungliga mikromiljö presenterar i Boyden kammare assay systemet. Denna analys är lätt, tillförlitliga och reproducerbara; Det är flexibelt och kan användas för att kvantifiera den invasiva potentialen hos en mängd olika celltyper inklusive känsliga och sällsynta celltyper. Denna analys kan användas för att upptäcka den flyttande aktivitet som är associerad med matrix nedbrytning och kan också anpassas till studera den selektiva förnedrande aktiviteten på olika matrix substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har förklarat att det inte finns något konkurrerande intresse.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) genom RCMI-centrum för miljö och hälsa vid Jackson State University och den amerikanska avdelningen av försvar, Idea Award 11-1-0205.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
- Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
- Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
- Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
- McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
- Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).
