Summary
乳がんのマウス ・ モデルにおける腫瘍微小環境における重要な生理学的パラメーターの評価のため水溶性次亜硝酸、トリチル プローブを用いた低磁場 (L バンド、1.2 GHz) 電子常磁性共鳴を示した。
Abstract
このプロトコルは、低磁場電子スピン共鳴 (EPR) の機能を示します-化学がん微小環境 (TME) の定量的な情報を提供するために機能の常磁性プローブとの組み合わせで技術をベースを含むpO2pH、酸化還元状態、間質性無機リン酸 (Pi) および細胞内グルタチオン (GSH) の濃度。特に、最近開発された水溶性多機能トリチル プローブのアプリケーションを提供比類のない機会を生体内での pH pO2 P同時測定Eでxtracellular スペース (希望プローブ)。プローブの分布と測定の時間の独立した相関分析の単一のプローブを使用して 3 つのパラメーターの測定を許可します。
Introduction
がんの進行と治療における TME の重要な役割はますます高く評価1です。固形腫瘍、組織低酸素症2アシドーシス3,4、高還元能力5高濃度の細胞内 GSH6、7TME の重要な生理学的パラメーターの間で間質性 Pi8はよく記載されています。非侵襲体内 pO2pH、Pi、GSH、レドックス評価は TME、生物学的過程のユニークな洞察を提供し、抗がん剤と TME をターゲットとした治療戦略の前臨床スクリーニングのための事前のツールを助けます。磁気共鳴画像 (MRI) や低磁場 EPR ベース テクニックによる組織の合理的な高周波溶込み深さはこれらの TME パラメーターの非侵襲的評価への最も適切なアプローチとなります。MRI 画像水プロトンに頼ってと解剖学的解像度を提供するために臨床の現場で広く、機能解像度を欠いています。細胞外の Pi 濃度と内因性リン酸からの信号に基づいて pH のリン 31 磁気共鳴 (31P NMR) 測定は TME 特性評価の可能性がある魅力的なが、通常数回によってマスクされ高い細胞内 Pi 濃度9,10。対照をなして、EPR 測定分光法に依存し、常磁性プローブ機能解像度を提供するために設計された特別のイメージングします。外因性の EPR プローブは外因性優位 NMR プローブ EPR の多くの高い固有の感度と内因性背景 EPR 信号の不在のため。11プローブのデュアル機能 pH および酸化還元 nitroxyl の最近の開発と、多機能トリチル プローブ12 TME のいくつかのパラメーターの同時測定体内の比類のない機会を提供します、相関解析プローブ分布と測定の時間に依存しません。私たちの知る限り、体内 pO2pHePi、還元グルタチオンなど、被験者の生活で生理学的に重要な化学 TME パラメーターを同時に評価するために使用できる他の方法がないです。
用プローブ生体内で機能の測定:
常磁性プローブ粒子および溶性プローブ TME のパラメーターにアクセスするために使用の化学構造を図 1に示します。高感度機能、安定性、生体組織と最小限の毒性は、EPR パルスオキシメータ体内の水溶性プローブ優先粒子状のプローブを作るいくつかの利点です。たとえば、粒子プローブでは、数週間にわたって組織pO2の縦断的測定を可能にする可溶性のプローブと比較して組織インプラントのサイトで保持時間を増加しています。その一方で、可溶性プローブ EPR ベース イメージングできるよう複数の機能から併用解析を用いた空間分解測定を提供することにより粒子状のプローブをアウトパ フォームする (pO2pH、Pi、酸化還元とGSH)。
図 1。TME 評価分析を組み立てる常磁性プローブの化学構造。粒子pO2プローブ、LiNc BuO 含まれます (R = O (2CH) の3CH3)、および可溶性プローブ: デュアル機能 pH および酸化還元プローブ、NR;グルタチオン (gsh) 敏感なプローブ、RSSR;多機能pO2, pH, および細胞外微小環境、希望プローブ.の Pi プローブこれらのプローブの合成は、提供された参照11,12に記載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Protocol
WVU IACUC 承認プロトコルに従ってすべての動物の仕事を行った。
1. プローブの合成と校正
- 粒子pO2-敏感な LiNc BuO プローブ
注:LiNc BuO 微結晶を合成して、参照13で説明されています。彼らは非常に安定して、年室温で保管することができます。LiNc BuO 粒子プローブの EPR 線幅はpO2-機密性の高いパラメーター。LiNc BuO 微結晶はpO2分圧13、不在で本質的な線幅の値 760 mmHg まで無酸素状態から酸素濃度範囲に線幅の理想的な線形依存性を示す酸素・酸素依存性 (単位 mG/mmHg) 若干スロープの微調製の異なるバッチの変化。したがって、校正は、特定のバッチごとに必要です。- LiNc BuO 微結晶の 60 mg の重量を量る。
- 酸素感度校正用 3 ml ダルベッコ変更イーグル メディア (DMEM) 中 (20 mg/mL の濃度) の微結晶を中断し、5 mL ガラス丸底チューブで 7 W の電力を使用して 20 の kHz でプローブ超音波発生装置で氷の上 5 分の超音波。
- ガラスの超音波破砕した微結晶の場所 1 mL L バンド (1.2 GHz) EPR 分光計の表面コイルの共振器のチューブし、0、1、2、4、8 の 37 ° C と酸素濃度の生理学的温連続波 (CW) EPR スペクトルを取得、と 20.9%。ガス混合ガスのコント ローラーから配信ソリューションをバブリングによって酸素濃度を維持し、サーモスタットに接続されている水浴を使用して温度を維持します。次の EPR 分光器集録パラメーターを使用: 変調振幅、100 mG。100 kHz の変調周波数スイープ幅、5 G;掃引時間、60 s。
- 良い信号対雑音比 (sn 比) を達成するために、線の幅の 60% の変調振幅値を使用 (例えば、変調振幅 0.6 G を使用して、1 G の線幅のため)。
- 代替校正手順を簡素化: 空気バブル、無酸素ソリューション14の EPR スペクトルを記録。後者の場合、10 mM グルコースと参照14によると 1 mL プローブに 100 U/mL のブドウ糖酸化酵素の添加によるサンプルで無酸素状態を維持します。
- 線幅、LW を検索するローレンツ関数を用いた EPR スペクトルに合います。PO2LW の (LW空気−LW無酸素) の値としてすなわち依存性斜面としてpO2微結晶の感度を評価/pO2air、どこ LW空気LW無酸素空気と無酸素条件でスペクトル線幅はそれぞれ;pO2air = 152 mmHg。
- デュアル機能の pH および酸化還元のプローブ、NR
注:NR プローブは、参照11で説明するように合成されています。固体および水溶液中で室温で安定しています。合成の NR プローブは 4 ° C に保たれて窒素の超微細分裂、N、および信号振幅の減衰率は、pH に敏感な NR プローブのスペクトルパラ メーター (pK、プローブ = 6.6 7.6 5.6 から pH 感受性の範囲、37 ° C で) およびプローブの還元能力に微小環境、それぞれ。- 冷凍庫から NR を削除でき、常温 (10-15 分) にするコンテナー。NR の 6.34 mg を量り、食塩液 1 mL に溶解し、塩酸または水酸化ナトリウム pH メーターを使用しての小さい因数で 7.2 pH を調整します。保存溶液として調製した NR 溶液 (10 mM) を使用します。
- (参照11参照) NR プローブの pH 校正をとおり実行します。まず、2 mM Na リン酸バッファー、150 mM の NaCl の 0.9 mL に NR の原液を 0.1 mL を追加します。塩酸または水酸化ナトリウムの pH メーターを使用して必要な ph の因数で得られた 1 ミリメートル NR のソリューションを滴定しなさい。サーモスタットに接続されている水浴を使用して温度を制御します。
- L-band EPR 分光器を用いた 1.5 mL 遠心チューブにサンプルの EPR スペクトルを記録します。次の EPR 分光器集録パラメーターを使用: 変調振幅、2.5 G;100 kHz の変調周波数スイープ幅、60 G掃引時間、20 s。
- EPR スペクトルの低と高フィールド コンポーネント間の距離の半分として超微細分裂定数 (N) を測定し、pH の L バンド EPR 測定の校正曲線を提供する pH とプロットします。
- グルタチオン (gsh) 敏感な RSSR プローブ
注:RSSR プローブは、参照15で説明したように合成されています。4 ° C で合成 NR プローブを格納します。脂溶性 RSSR 二硫化ビラジカル化合物が細胞膜と細胞内 GSH 反応グルタチオン (gsh)生体内でEPR16,17を使用して決定するため信頼性の高い方法を提供するの間で拡散しやすい。このメソッドは、RSSR プローブを用いたグルタチオン (gsh) のチオール基の優勢な細胞内プールの高反応速度に基づいています。グルタチオン (gsh) 分割、ジスルフィド結合 (方式 1参照) RSSR ビラジカルの反応 2 つの根本的なフラグメントとけんしょうビラジカルのスペクトル成分の減少と対応するスピン交換のキャンセルの結果monoradical コンポーネントの増加。ビラジカル RSSR プローブ用の monoradical 成分の振幅増加率は GSH 濃度に比例して、便利なグルタチオン (gsh) 敏感な EPR スペクトル パラメーター。生体内でEPR 測定から GSH 濃度を評価するには、と対応する温度と pH で GSH RSSR 反応の速度の上記の校正は次のように実行します。- 冷凍庫から、RSSR を外し、常温 (10-15 分) にコンテナーを許可します。NR の 4.05 mg を量り、DMSO 溶液 1 mL に溶かします。保存溶液として調製した RSSR 溶液 (10 mM) を使用します。
- とおり、速度定数、kobsと望ましい温度と pH で GSH RSSR の反応の値を確認します。
- まず、0.98 mL の 1 mM Na リン酸バッファーに RSSR 原液 (10 mM) の 20 μ L を追加、pH 7.2, 150 mM の NaCl、0.2 mM RSSR を取得するプローブ ・ ソリューション。
- 0.1 M リン酸 Na pH 7.2 buffer 内グルタチオン (gsh) の 1、2、および 5 mM の濃度の溶液を準備します。体内測定から標的器官の細胞内 GSH 濃度を正確に評価するため生体外で校正が細胞内の ph 値に近い pH で実行します。
- 0.2 mM RSSR ソリューション、1.3.4 の手順で準備するグルタチオン (gsh) ソリューションの 1 つの平等なボリュームをミックスします。0.5、1、または 2.5 mM で最終濃度 0.1 mm プローブ ・ グルタチオン (gsh)。
- 混合 RSSR とグルタチオン (gsh) のソリューション後すぐにサンプル EPR 共振器にし 10 分 12 秒ごと EPR スペクトルを記録します。Monoradical スペクトルの振幅の増加の速度を計算します。次の EPR 分光器集録パラメーターを使用: 変調振幅、1 G;100 kHz の変調周波数スイープ幅、60 Gスイープ時間、10-60 秒。
- Monoexponents に測定された EPR 動態をフィットし、指数関数的速度論、τ の時定数を計算します。線形回帰 (1/τ = kobs × [GSH]) グルタチオン (gsh) と RSSR 反応の観測率の定数値を提供します (例えば、34 ° C で pH 7.2 kobs = 2.8 ± 0.2 M-1の-1)11。
- PO2, pH, および Pi 評価用多機能希望プローブ
注:説明したように希望プローブを合成 monophosphonated トリチル12を参照され 4 ° C でPH << pKを(-酸フォーム) と pH >> pKは(B - 基本的なフォーム) で希望の CW EPR スペクトルは、分割、Pリン超微細のためダブレットで表されます。典型的な器械の設定は次のとおりです: 変調振幅、37.5 mG;100 kHz の変調周波数スイープ幅、0.9 G;スイープ時間、20-60 秒。中間 ph (5 < pH < 8) 希望プローブの EPR スペクトルはカルテットによって特徴付けられるとき両方の A と B の状態が存在。希望の個々 の EPR の線幅はpO2マーカー (精度、≈ 1 mmHg;pO2の範囲、1-100 mmHg)。プロトン化希望 (フォーム) の割合は、6 から 8.0 (精度、± 0.05) の範囲で pH マーカーです。スペクトルのシミュレーションによって抽出された Pi とのプロトン為替レート (mG 単位) の値は、Pi マーカー (精度、± 0.1 mM、0.1 〜 20 ミリメートルの範囲) です。校正は生理的温度 (37 ° C)、ソリューション イオン強度 (NaCl、150 mM)、および希望プローブ濃度 0.2 mM、参照12,18で記述されているし、下記のように実行されます。- 冷凍庫から希望プローブを削除でき、常温 (10-15 分) にするコンテナー。
- 10.7 mg 希望プローブの重量を量り、食塩液 1 mL に溶かして、pH 7.4 に調整。追加 20 μ L 0.2 mM 希望を取得する 0.98 mL の生理食塩水の溶液に希望 (10 mM) の準備の原液のプローブ ソリューション。
- PH のプローブ校正、サンプルの 1% 未満の最終希釈で少量の水酸化ナトリウムや塩酸の添加による希望プローブ溶液 0.2 mM 滴定しなさい。37 ° c で国立局の規格 (米国) をお勧めします参照ソリューションの pH 値を使って校正 pH 電極を pH を測定します。慎重に pH 測定中に参照および滴定されたソリューションの温度を維持するためにサーキュレータに接続されているジャケット反応ビーカーを使用します。10 mM グルコースの添加による無酸素状態と 100 U/mL グルコースオキシダーゼ プローブ ソリューションを維持します。
- リン酸のない無酸素状態でそれぞれ pH ≦ 5 で pH ≥ 8、A と B の形態の EPR スペクトルを取得します。
- 対応するスペクトルを使用して、組み込みのスペクトルパラ メーターを取得します。すなわち、ローレンツ関数の希望プローブの未解決超超微細構造に近づけるガウス関数の畳み込みとしてスペクトル線をシミュレートします。実験スペクトルを計算された EPR スペクトルのフィットが得られます横緩和率 1/T2のPとローレンツ幅 (ΔLpp) の値 (ここ 1/T2 = (√3/2) LppCW EPR の RF の吸収線の測定された派生物のため)、G. ガウス分布の幅
注:1.4.2 の手順で指定した条件で測定したスペクトルから得られたパラメーターを次に示します:P(A) = 3.63 G、P(B) = 3.37 G;1/T2(A) = 23.6 mG;1/T2(B) = 9 mG。G(A) = 40 mG。G(B) = 45 mG (文献8を参照)。 - 希望の EPR スペクトルを取得中間 ph (5 < < pH 8).前述18として参照19から適応非結合または疎結合システムの複数サイト間交流の理論を使用して取得した EPR スペクトルの高提出コンポーネントをシミュレートします。A の得られた本質的なパラメーターの使用と (手順 1.4.5 参照) B 状態変数の数を少なくします。(PA) の分数の値を検索する実験的に計算されたスペクトルに合うし、p 値の pH 依存性をプロットします。さらに pH の pH 校正曲線として pAの依存性を使用します。
注:解離定数、pK、 (希望) の値を提供標準的な滴定曲線で pAの pH 依存性をフィッティング = 6.98。生体内での研究で希望プローブにおける EPR スペクトルを取得実用的ではありません EPR スペクトル分割リン超微細の低と高フィールド コンポーネント間の間隔を取得するために必要な追加の時間のため。したがって、さらに代表される研究の EPR スペクトルの高提出のコンポーネントのみ測定、分析します。 - PO2のプローブ較正、酸素濃度で希望プローブの EPR スペクトルを取得します。
- 混合ガスをバブリングによってソリューションのコントロールpO2値はガスのコント ローラーから配信されます。サーモスタットに接続されている水浴を用いた溶液温度 (37 ° C) を制御します。
- EPR スペクトルをシミュレートし、1.4.6 酸素誘起緩和率の値を決定するための手順の説明に従って実験的にそれらに合います。
注:酸素誘起緩和率の値 0.49 mG/mmHg 両方 a と B フォーム希望のプローブ 37 ° C8にて測定。 - [Pi] のプローブの較正、種々 のリン酸濃度希望プローブの EPR スペクトルを取得します。PK、近く pH 値を希望の根本的な解決を使用して (pK、 37 ° C で 6.9 を =)18リン酸濃度を滴定。上記の手順で説明するように、温度、ガス組成を維持します。
- EPR スペクトルをシミュレートし、Pi による為替レートの値を決定する手順 1.4.6 で実験的にそれらに合います。
注:[Pi] Pi による為替レートの依存性は、さらなる研究の校正として使用されます。
2. 乳房癌のマウスモデル
- MMTV PyMT 自発腫瘍モデル
- 4-8 週を使用して-EPR 研究生体内で自発的に形作られる乳腺腫瘍の女性友人ウイルス ウイルス プロモーター (MMTV) polyoma 中間 T B 型感受性/NIH (FVB/N) マウス乳腺腫瘍抗原 (支払 +) マウスは古い。
- 正常の乳腺の腫瘍組織微小環境の比較、littermate の年齢をマッチさせた女性 PyMT 遺伝子 (PyMT−,「野生型」)20欠乏を使用します。
- イソフルラン麻酔中 4 週間週 1 回 l-band epr のマウスを対象 (プローブ配信の以下を参照してください)。
- 空気イソフルラン混合 (3% イソフルラン) を用いてマウスの麻酔し、表面コイルの共振に近い腫瘍 (乳腺) の右、横位置で調節可能なテーブルの上にマウスを置きます。
- マウス配置後に、intratissual (i.t.) の注入によってプローブを管理、EPR 分光計を調整 5-10 分の EPR スペクトルを取得します。
- 2-3 乳腺腫瘍を測定 (MMTV から-支払 + マウス) や非腫瘍性が同じの EPR セッション中に (PyMT− マウス) から乳腺を軸受します。
- 同所性同種メット 1 腫瘍モデル
- 37 ° C、5% CO210% 牛胎児血清 (FBS)、10 μ g/mL インスリン、5 ng/mL rhEGF および 1% を含む DMEM で 95% の相対湿度で FVB/N 背景メット 1 マウス乳癌細胞の成長に PSA (ペニシリン G ナトリウム、ストレプトマイシン硫酸塩およびアムホテリシン B)~ T175 フラスコの 80% 合流。
- メディアを吸引し、10 mL の PBS で付着性のセルをすすいでください (1.54 mM KH2PO 2.71 mM、155 mM の NaCl、4Na2HPO4-7 H2O 塩化カルシウムや塩化マグネシウム、pH 7.4 を =)。
- フラスコを揺動を 0.25% トリプシン-EDTA 溶液の 5 mL を追加してセルをデタッチします。10 mL 10% を含む DMEM を追加しセルを取り外したら、フラスコに FBS し細胞を収集します。
- 4 ° C で 10 分間 132 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。診断を使用してセルを数えるし、100 μ L あたり 1 x 10 の6セルに再懸濁します最小限 DMEM。
- 8 週齢雌 FVB/N 野生型マウスの数 4 乳腺の脂肪パッドに腫瘍細胞懸濁液を 100 μ l 添加を注入インスリン注射器 (29 1/2 針) を使用して、ゆっくりと。
- 触診による腫瘍の開始を監視 (約 2-3 週間後表示されます) (ビジュアル) の成長とマウス ヒース (視覚) 他の毎日。
- ノギスを使用して週に 1 回の腫瘍の大きさを測定し、腫瘍体積の式を使用してを決定します。
3.体内機能測定の配信をプローブします。
- 使用粒子 LiNc BuO プローブ (議定書 I) 内面 LiNc BuO で腫瘍細胞を植え付けることによって同所性同種腫瘍モデルにおける pO2測定の微結晶は前述説明14,21と以下に詳述します。
- メット 1 MET 1 セルにバイオス BuO 微結晶の内部の腫瘍モデルの場合 20 mg/mL の濃度に DMEM で LiNc BuO 微結晶を中断し、5 mL ガラス丸底チューブで 7 W の電力を使用して 20 の kHz でプローブ超音波発生装置と超音波氷の上の 5 分。
- T75 フラスコにメット 1 セル (約 30% 合流) を含む 10 mL の培地に懸濁液の 100 μ L (LiNc BuO の 2 mg) を追加します。すべてのプロシージャは安全キャビネットの場所を取る、ペニシリンとストレプトマイシン感染の可能性を最小限に抑えるためにメディアが含まれます。
- 37 ° c 72 h またはになるまで細胞をインキュベート ~ 80% の confluency。
- メディアを吸い出しなさい。5 倍を 10 mL の PBS セルを洗浄します。5 mL のトリプシン-EDTA と細胞を切り離します。細胞を収集します。2.2.4 の手順で上記のように遠心分離します。除外染付細胞生存率及び数量を決定する細胞のサンプルを染色します。
- 1 x 106ごとに 100 μ L の濃度で細胞を中断最小限 DMEM。
- 2.2.5 の手順に記載されている 8 週齢雌 FVB/N 野生型マウスの数 4 乳腺脂肪パッドに内面のバイオス BuO 微結晶を含む細胞懸濁液を 100 μ l 添加を注入するインスリン注射器を使用して、ゆっくりと。
- 2.2.6、2.2.7 の手順で説明するよう、腫瘍の発生・進展を監視します。
- 使用粒子 LiNc BuO プローブ (プロトコル II) いずれかの自発的なまたは直交異方性モデル。通常乳腺や乳腺腫瘍、インスリン注射器を使用して、例えば興味のあるサイトでリンク大府微結晶を注入します。
- 水溶性プローブ
- 空気イソフルラン混合物 (1.0 L/分配信とイソフルランの 2-3%) の吸入によるマウスを麻酔を麻酔を使用して機械、EPR 分光計のギャップにそれらを置きます。
- 、楽器をチューニングし、NR (10-30 μ L、10 mM)、希望プローブを注入 (10−30 μ L、0.5-2 mM) (10 μ L、10 mM) DMSO 溶液 (i.t.) RSSR プローブや pH 7.2, 生理食塩水に。
4.生体内機能測定
- EPR の分光学的測定手順 3.3.1 に記載された麻酔器を使用して空気イソフルラン混合物の吸入によるマウスを麻酔します。
- L バンド (1.2 GHz) EPR 分光計を使用して次のように機能の測定を実行します。
- 通常乳腺や乳腺腫瘍に表面コイルの共振器を置き、分光計を調整します。
- 5−10 分間注入粒子プローブから EPR スペクトルを取得すると、注入後数週間にわたって。水溶性プローブの場合に、5-10 分のプローブ注入後すぐに EPR スペクトルを取得します。
- 超微細分裂、N、および信号の振幅、I(t) を見つけよう NR プローブの EPR スペクトルを分析します。1.2.4 の手順で得られた検量線を使用して pH 値をNの値を変換します。初期振幅から相対的な変化として I(t) 信号振幅の減衰率の解析 I(t = 0)、毎秒 (s-1) 任意の単位で計算されます。
- GSH 濃度を計算する指数関数的速度論の時定数を取得する monoexponents に GSH 感応 RSSR プローブの EPR スペクトルの monoradical コンポーネントの増加に合わせて。
- PH、 pO2 Pi の値を生成する (ステップ 1.4.5) に記載されている実験的ものに多機能希望プローブの高電界成分の EPR スペクトルに合います。
5. 統計解析
- データ処理と統計分析を実行します。相関分析のピアソンの r 相関テスト (正規分布データセット向け) と (データ配布の拒否された正規性を持つデータセット) のスピアマンの順位相関を使用します。
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Representative Results
組織pO2プローブを用いた LiNc BuO 評価:
手順 1.1 で説明されている手順を使用して、作りたて LiNc BuO 微結晶懸濁液の校正を行った。図 2は、LiNc BuO プローブと測定バッファー懸濁液と細胞の注入によって腫瘍開始後成長して女性の c57bl/6 マウスの乳腺腫瘍その例示の EPR スペクトルの線幅の典型的な酸素依存性を示しています内面化された粒子 (ステップ 3.1)。線幅の調整を使用して組織pO2値の計算は、 (図 2に示すスペクトル (b) 7.5 mmHg に等しい)。
図 2.酸素粒状 LiNc BuO プローブの EPR スペクトル感度。代表的な酸素分圧に DMEM で LiNc BuO プローブ サスペンションの EPR スペクトルの線幅依存性を示します。EPR スペクトル (挿入する) を表しpO の2、37 ° C、0% で測定した、幅 Δ と純粋なローレンツ ラインHpp 113 mG を =。線幅はpO2 11.7 mG/mmHg の傾斜に比例して増加します。麻酔をかけられた女性 c57bl/6 マウス Δ を示す乳腺腫瘍組織における (挿入b) に示すようにスペクトルを測定したHpp = 204 mG、7.5 mmHg の組織pO2に対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
組織細胞外 pH や酸化還元は、NR を使用してプローブの評価:
ステップ 1.2 の下で説明されている手順を使用すると、NR pH および酸化還元プローブの校正を行った。図 3は、pH に根本的な観測の超微細定数依存性、NNR の分割を示します。PKすると標準的な滴定曲線による依存性を説明 = 37 ° C で 6.6この依存性N(pH) は、対応する生体内測定、0.05 pH 単位の精度で 5.6 から 7.6, の範囲で pH 測定を可能にするための校正曲線として機能します。
図 3.博士に可溶性の NR プローブの EPR スペクトル感度NR プローブ ソリューションの L バンド EPR スペクトルは ph、37 ° C で買収され、N、観測された超微細定数、分割の pH 依存性をプロットしました。実線は標準的な滴定曲線と実測のフィット
、pK、降伏 6.6,N(NR-H+) = = 14.24 G とN(R) = 15.27 G. 挿入: 取得 1 ミリメートル NR のソリューション (pH 6.4) の例示の EPR スペクトル次の分光器設定を使用して: 磁場掃引、80 G;変調振幅、2.5 G 取得時間、20 s。測定超微細分裂定数が参照23ジョンワイリー及び息子、株式会社の許可を得てから 14.63 G. 再現この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4は、3.3 (i.t. プローブ注入)、セクション 4 (スペクトルの取得とスペクトル解析) の手順で説明されているように実行、乳房腫瘍マウス モデルにおける pH および酸化還元測定を例示します。
図 4.容量削減組織の EPR 評価体内挿入: NR プローブの l-band EPR スペクトルは、麻酔をかけられた女性 FVB/N マウスの乳腺腫瘍組織での i.t. 投与 (10 μ L、10 mM) に生体内で測定。14.72 G, pHeの値に対応するに等しくなるように発見された超微細分裂、N= 6.52 腫瘍組織温度 34 ° C と pKすると仮定すると = 6.6。NR の削減率は、中央フィールドのスペクトル成分の減衰を次で評価されます。乳腺腫瘍 (○) で例示した動態を測定し、乳腺 (o) 対正常乳腺腫瘍組織の高い還元能力を示します。反応の最初の部分の分析利回り k赤、10-3/s x 2.5 として組織の細胞外のメディアに、EPR 信号低減率通常腺 10-3/s x 0.5 対腫瘍。ジョンワイリー及び息子、株式会社の許可を得て参照11から再現この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5は、腫瘍と正常乳腺腫瘍酸性細胞外微小環境と高還元能力を支える女性の FVB/N MMTV PyMT マウスのグループに対して実行される pHeと酸化還元測定をまとめたものです。
図 5.生体内で組織の酸性度と容量削減の EPR 評価します。細胞外組織 pH (充填バー) と還元率の正常乳腺の NR ニトロキシド (空バー) 値体内の EPR 測定女性の FVB/N マウスの乳腺腫瘍。エラーセルの東南再現参照11ジョンワイリー及び息子、株式会社の許可を得てからこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
同時組織 pHe、酸化還元、およびpO2NR とバイオス BuO プローブを組み合わせることによる評価:
PO2値の繰り返しの縦断的測定は興味のあらかじめ決められた組織で計画されたとき、粒子状 LiNc BuO、好みのプローブです。残念ながら、粒子状のプローブの主要な制限は、しますそれだけ酸素と、TME 内他の生理学的関連化学パラメーターの検出は、組織イメージングでは。したがって、イメージングの利点と複数の生理学的に関連する TME パラメーターの検出 EPR の可溶性のプローブの使用があります。この点で、注入のバイオス BuO 粒子を用いたpO2測定をデュアル機能 pH と組み合わせることし、レドックス NR プローブ NR EPR スペクトルの低と高磁場スペクトル成分の EPR 線と重複しないので、LiNc BuO プローブ。
女性 c57bl/6 マウスの乳房の腫瘍組織に i.t. 注射後すぐに NR プローブによる観測された典型的な EPR スペクトルを図 6に示します。腫瘍内に埋め込まれているリンク BuO 微結晶の EPR 一行と NR プローブのトリプレットは観測されたスペクトルを重ね (腫瘍の成長は、3.1 の手順で説明されているように内面化された粒子の細胞の注入によって開始されました。PH 値は、低と高フィールド コンポーネント間の距離としてN超微細分裂の測定および図 6に示すスペクトル図 3 (6.88 に等しい) に示すキャリブレーションを使用して計算されます。注pO2の評価が実行されることは、NR プローブの注入前にバイオス BuO 信号の線幅の測定に基づいています。NR 信号の減衰は、図 4に示すように容量を削減する組織の値を提供します。
図 6.LiNc BuO と NR を組み合わせた多機能 TME 評価プローブします。EPR スペクトル測定体内女性 c57bl/6 マウスの乳房の腫瘍組織に NR プローブの i.t. 注射後すぐに。NR のトリプレットは観測されたスペクトル、腫瘍内に埋め込まれたリンク BuO プローブの EPR 一行と重ね合わせられます。低と高フィールド コンポーネント間の分割から計算される pH 値は 6.88 です。NR 信号の減衰は、容量削減組織の値を提供します。pO2評価は NR プローブの注入前にバイオス BuO の線幅の測定値に基づいて実施されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
生体内で細胞内 GSH の評価:
RSSR プローブとグルタチオン (gsh) のチオール二硫化物交換に関する反応は、2 つ monoradicals22の形成および monoradical フラグメント間分子スピン交換の取り消しに終ってプローブのジスルフィド結合を分割します。図 7 aは、「ビラジカル」スペクトル成分の消失および monoradical コンポーネントの強度の対応する増加に終って EPR スペクトルと GSH RSSR プローブの反応の影響を示しています。グルタチオン (gsh) と RSSR 反応の観測速度定数: kobs = 2.8 ± 0.2 M-1の-1 (T = 34 ° C、pH 7.2)11。図 7B乳腺腫瘍 (●) で正常乳腺 (o) を用いた l-band EPR 測定 monoradical スペクトルのピーク強度変化の動態を例示しています。実線は kobsを使用して monoexponent で反応の最初の部分のフィット = 2.8 M-1の-1と降伏 [GSH] = 10.7 mM、腫瘍と正常乳腺の 3.3 mM それぞれ。
図 7.生体内で細胞内グルタチオン濃度の EPR 評価します。100 μ M の X バンド (A) EPR スペクトル RSSR 様々 な時点で 0.1 M Na リン酸バッファー、pH 7.2、34 ° C で 1 mM DTPA で 2.5 mM GSH と孵化後測定反応速度論解析 GSH と RSSR kobs (pH 7.2、34 ° C) 間の反応の観測率の定数値を提供します (2.8 ± 0.2) = M-1の-1。(B) RSSR i.t. 注入プローブ (手順 3.3.2 参照) 後、すぐに、monoradical スペクトルのピーク強度変化の動態は乳腺腫瘍 (●) 及び正常乳腺組織 (o) FVB/N マウスにおける EPR の L バンドで測定されます。実線は kobs (pH 7.2、34 ° C) を想定した、monoexponent による反応の最初の部分のフィット = 2.8 M-1の-1と降伏 [GSH] = 10.7 mM、腫瘍と正常乳腺の 3.3 mM それぞれ。ジョンワイリー及び息子、株式会社の許可を得て参照11から再現この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
多機能評価は組織の細胞の pHpO2、多機能希望プローブを用いた Pi と:
図 8は、校正手順セクション 1.4 の下を用いて希望プローブのスペクトルパラ メーターの感度を示します。
図 8.希望プローブを用いた化学物質の微小環境の多機能評価します。(、) のプローブの 2 つのイオン化状態の間の pH 依存性平衡方式。希望の (b) l-band EPR スペクトル。希望の (c) の EPR 線幅はpO2マーカー (精度、≈ 1 mmHg;pO2の範囲、1-100 mmHg)。(d) プロトン化希望の割合は、6 から 8.0 (精度、± 0.05) の範囲で pH マーカーです。(e) プロトンの交換速度 (単位 mG) スペクトル シミュレーション (精度、± 0.1 mM の範囲、0.1 20 mM) 12,18によって抽出された無機リン酸塩 (Pi) 濃度と希望の依存性。参照8性質の出版のグループの許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9は、自発的に乳癌を開発し、ひと腫瘍20をステージングをエミュレート MMTV TME PyMT トランスジェニック マウス、FVB/N 野生型乳腺の多機能測定を示しています。PO2 (50 ± 3 mmHg TME の正常組織で 58 ± 3 mmHg 対) および pHe (6.99 ± 0.03 TME で 7.1 ± 0.03 正常組織に対) の平均値は、腫瘍内低酸素および酸性領域の外観をサポートします。間質性 Pi 濃度の最も劇的な変化が観察された (1.8 ± 0.84 ± 0.07 mM、通常の組織対 TME で 0.2 mM) 腫瘍の進行の TME マーカーとしての間質性の Pi 濃度の潜在的な役割を示します。個々 の測定では、平均値の周りの大きな変化を示します。多機能プローブの重要な利点は、したがって、相関分析の独立した単一のプローブを使用してすべてのパラメーターを測定すること、プローブの分布および図 9 b- に示すように測定の時間 e。観測されたpO2と pHe正常乳腺腫瘍における相関の有無との相関をサポート腫瘍解糖系により、酸素濃度依存これは、我々 の意見 Warburg 効果を例示した生体内で実証。ターンでは、間質性 [Pi] とpO2両方正常および腫瘍組織における観測の負の相関関係が時に低酸素状態を生体エネルギーの変化高 [Pi] (および低 ATP/Pi 比) の協会供給。
図 9.生体内で組織pO2pHe、および Pi 評価希望プローブと EPR を使用しています。配置を示し、共振器の上の位置の右に挿入すると、EPR 分光の磁石間の麻酔下のマウスを示しています (、) EPR 測定体内の L バンドのセットアップの写真、測定された組織。希望プローブの間質性の細胞局在化に注意してください: それはかさばる充電構造による細胞に浸透していないと血漿アルブミン24 希望による信号を広げるため、EPR によって血液中から希望信号が検出されません。.(b-e)間質性 pO2pHePi 値との相関を測定 FVB/N 野生型マウスの正常乳腺と MMTV PyMT トランスジェニック マウスにおける乳癌の TME (n = 23)。酸素のバリエーションの範囲を拡張するには、間質性スペースで無酸素状態は/グルコース酸化酵素 (赤マル) の酸素消費酵素システムの i.t. 注入によって設立されました。青い線は、線形フィット データ セットの合計を表しています。正常組織のpO2と pH と正の相関関係 (b)e (r = 0.5、 p = 黒 0.014 シンボル; r = 0.64、 p = 1.8 × 10-4全データ セットに) (c) 対有意pO2と pHe TME の相関 (r = 0.01、 p = ブラックの 0.97 シンボル; r = 0.23、 p = データ セット全体の 0.3) が発見されました。正常組織pO2と両方の Pi の間 (d) 負の相関 (r = −0.51, p = 0.013 黒シンボル; r = −0.7, p = 2.3 × 10-5全データ セット) および (e) TME (bで下: r = 溶出、 p = 黒シンボルの 0.079r = −0.62, p = 0.001 データ セット全体の) 発見されました。性質の出版のグループのアクセス許可を参照8から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
提示方法すなわちpO2pH、酸化還元状態、および間質性 Pi および細胞内 GSH 濃度化学 TME の重要なパラメーターの生体内非侵襲的評価を可能にします。MRI や低磁場 EPR などの磁気共鳴技術は、非侵襲体内のこれらの TME パラメーターのプロファイルの選択の方法です。MRI は、解剖学的構造を可視化するが、機能の感度を欠いています。MRI とは対照的 EPR 技術は微小環境機能スピン プローブと組み合わせて使用されるときのローカル パラメーター機能の感度を提供します。私たちの知る限り、体内 pO2pHePi、還元グルタチオンなど、被験者の生活で生理学的に重要な化学 TME パラメーターを同時に評価するために使用できる他の方法がないです。
記述されていたプロトコルは低磁場 l-band EPR を使用してに基づいており、常磁性プローブに特別設計されています。図 1に示した 4 つのプローブのセットは効果的な体内TME 評価分析が考えられます。プローブの可用性は、記述されている体内の EPR 測定のための重要な前提条件です。パブリッシュされた手順11,12,13,15によるとプローブの合成有機合成化学の専門知識を必要としてメソッドの実装の重要なステップになることがあります。.
粒子状のプローブの応用は、移植14,21の後の週までの組織pO2の繰り返しで測定できます。溶性プローブは酸素濃度25を超えてパラメーター数が拡張感度を示すし、空間分解測定26のための機会を提供します。特に、多機能希望プローブの応用は、体内の pH、 pO2、および細胞外空間における Pi の同時測定のための比類のない機会を提供します。プローブの分布と測定8時間の独立した相関分析の単一のプローブを使用して 3 つのパラメーターの測定ができます。
プローブは、注入のバイオス BuO 粒子プローブは、図 6に示されているように、可溶性のプローブのいずれかとの組み合わせでに使用ことができますを除いて同時に使用できません。したがって、実験的なデザインが特定機能水溶性プローブの個別注射の個別の測定に基づく必要があります。できる親水性の細胞外 pH および酸化還元 NR プローブと i.t. 注入11,14,26を介して両方が配信され、全身配信27RSSR と希望、2 つ他可溶性のプローブ中 i.t. 配信だけを可能にします。8,11,12,16. RSSR と希望の未来の構造変更プローブ メモ可能性があります全身配信25より親水性と毒性の少ないプローブ類縁体の開発によってプローブ配信の後者の制限を克服します。
その分光学的 EPR モダリティを提供しばしばその高い不均一性によって特徴付けられる TME で測定するパラメーターの平均値に注意してください。これは部分的に潜在的なパラメーター違いのマスクまたは相関分析の意義を減少させます。画像診断で説明されているプローブは、空間分解機能情報26を得るため使用します。多機能の EPR イメージングの未来が急速なスキャン EPR イメージングとオーバーハウザー造影剤を用いた MRI (オムリ、プロトン電子二重共鳴イメージング、PEDRI とも呼ばれます) など比較的新しい方法論の発展に依存すると考えています。EPR プローブの機能の開発に新たな方向性と高度なイメージング技術は、対応する機能の記事25で最近議論されています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIH によって部分的に支持された CA194013、CA192064、U54GM104942 を付与します。VVK, ab 級, し、TDE の立ち上げのため、WVCTSI を認めた著者は、博士・ m ・ Gencheva、k. ・ シュタインバーガーを例示実験支援ありがちましょう。内容は著者の責任と NIH の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-band EPR spectrometer | Magnettech, Germany | L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules | |
| Temperature & Gas Controller | Noxygen, Germany | Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition | |
| Sonicator | Fisher Scientific | ||
| GSH (L-Glutathione reduced) | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| MMTV-PyMT mice | In house | ||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Met-1 murine breast cancer cells | In house | ||
| C57Bl/6 wild type mice | Jackson Laboratory | ||
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypan Blue Exclusion Dye | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Ohmeda Fluotec 3 | |||
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott Laboratories | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic | sigma-Aldrich | S07051 | |
| Sodium Chloride | sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric acid | sigma-Aldrich | 320331 | |
| Sodium Hydroxide | sigma-Aldrich | S8045 | |
| Glucose | sigma-Aldrich | ||
| Glucose oxydase | sigma-Aldrich | ||
| Lauda Circulator E100 | Lauda-Brikmann | ||
| pH meter Orion | Thermo Scientific | ||
| LiNc-BuO probe | In house | The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13 | |
| NR probe | In house | The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11 | |
| RSSR probe | In house | The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15 | |
| HOPE probe | In house | The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12 |
References
- Siemann, D. W. Tumor Microenvironment. , John Wiley & Sons Ltd.,. Chichester, UK; Hoboken, NJ, USA. (2011).
- Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
- Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
- Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
- Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
- Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
- Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
- Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233 (2017).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
- Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
- Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
- Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
- Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
- Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
- Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
- Hicks, R. Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , John Wiley & Sons, Ltd. 537-566 (2010).
- Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
- Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. Practical NMR spectroscopy. , Heyden. (1980).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
- Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
- Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
- Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
- Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
- Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
- Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).
