Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/56624
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1In Vivo Multifunctional Magnetic Resonance center, Robert C. Byrd Health Sciences Center, West Virginia University, 2Department of Biochemistry, West Virginia University School of Medicine, 3Department of Microbiology, Immunology & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

Summary

Låg-fältet (L-band, 1,2 GHz) elektron paramagnetiska resonans med lösliga nitroxyl och trityl sonder demonstreras för bedömning av fysiologiskt viktiga parametrar i den tumör närmiljön i musmodeller av bröstcancer.

Abstract

Detta protokoll visar kapaciteten hos låg-fältet elektron paramagnetiska resonans (EPR)-baserade tekniker i kombination med funktionell paramagnetiska sonder för att ge kvantitativa uppgifter om de kemiska tumör närmiljön (TME), inklusive p O2, pH, redox status, koncentrationer av interstitiell oorganiskt fosfat (Pi) och intracellulära glutation (GSH). I synnerhet en ansökan av en nyligen utvecklad lösliga multifunktionella trityl sond ger oöverträffad möjlighet för in vivo samtidiga mätningar av pH, pO2 och Pi E xtracellular utrymme (hopp probe). Mätningar av tre parametrar med hjälp av en enda sond möjliggör deras korrelation analyser som är oberoende av sonden distribution och tiden för mätningarna.

Introduction

En nyckelroll i TME i cancer progression och terapi är alltmer uppskattad1. Bland viktiga fysiologiska parametrar av TME i vävnad hypoxi2, hög reducerande kapacitet5, acidos3,4, solida tumörer, förhöjda halter av intracellulära GSH6,7, och interstitiell Pi8 är väl dokumenterade. Noninvasiv invivo pO2, pH, Pi, GSH och redox bedömningar ger unika insikter i biologiska processer i TME och hjälpa förskott verktyg för pre-klinisk screening av läkemedel mot cancer och TME-riktade behandlingsstrategier. En rimlig radiofrekvent genomträngningsdjupet i vävnader av magnetisk resonanstomografi (MRT) och låg-fältet EPR-baserade tekniker gör dem de mest lämpliga metoderna för icke-invasiv bedömning av dessa TME-parametrar. MRI bygger till stor del på imaging vatten protoner och används ofta i kliniska inställningar för att tillhandahålla anatomisk upplösning men saknar funktionell upplösning. Fosfor-31 kärnmagnetisk resonans (31P-NMR) mätningarna extracellulära Pi koncentration och pH baserat på en signal från endogena fosfat är potentiellt attraktiva för TME karakterisering, men är vanligtvis maskerade av flera gånger högre intracellulära Pi koncentrationer9,10. I kontrast till detta, EPR mätningar lita på spektroskopi och avbildning av speciellt utformade paramagnetiska sonder att tillhandahålla funktionell upplösning. Observera att exogena EPR sonder har en fördel över exogena NMR sonder på grund av mycket högre inneboende känslighet EPR och avsaknad av endogena bakgrund EPR signaler. Den senaste utvecklingen av en dubbel funktion pH och redox nitroxyl probe11 och multifunktionella trityl sond12 ger oöverträffade möjligheter för i vivo samtidiga mätningar av flera TME parametrar och deras korrelation analyser oberoende på sonden distribution och tid för mätningen. Såvitt vi vet finns det inga andra metoder som är tillgängliga för att samtidigt bedöma i vivo fysiologiskt viktiga kemiska TME parametrar i levande ämnen, såsom pO2, pHe, Pi, redox och GSH.

Sonder för In Vivo Funktionella mått:

Figur 1 visar kemiska strukturer av de paramagnetiska sonder används för åtkomst till TME faktorer, som inbegriper partiklar och lösliga sonder. Hög funktionell känslighet, stabilitet i levande vävnad och minimal toxicitet är några fördelar som gör partiklar sonder föredrog över lösligt sonder för i vivo EPR pulsoximetri. Till exempel ökat partiklar sonder retentionstider på platsen för vävnad implantat jämfört med lösligt sonder möjliggör längsgående mätning av vävnad pO2 över flera veckor. Däremot, lösliga sonder överträffa partiklar sonder genom att ge rumsliga-löst mätningar med EPR-baserat imaging tekniker samt möjliggör samtidig analyser från flera funktioner (pO2, pH, Pi, redox, och GSH).

Figure 1
Figur 1. Kemiska strukturer i de paramagnetiska sonder som montera TME bedömning assay. Detta inkluderar partiklar pO2 sonden, LiNc-BuO (R = - O (CH2)3CH3), och lösliga sonder: dubbel funktion pH och redox probe, NR; GSH-känsliga probe, GFDFJH; och multifunktionell pO2, pH och Pi sonden av den extracellulära mikromiljö, hopp sonden. Syntesen av dessa sonder har beskrivits i den medföljande referenser 11,12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur arbetet utförs i enlighet med WVU IACUC godkända protokoll.

1. probe syntes och kalibrering

  1. Partikelformiga pO2-känsliga LiNc-BuO sond
    Obs: LiNc-BuO microcrystals är syntetiserade och beredda som beskrivs i referens13. De är mycket stabila och kan förvaras vid rumstemperatur i år. Den EPR linewidth LiNc-BuO partiklar sondens är en pO2-känslig parameter. LiNc-BuO microcrystals demonstrera perfekt linjärt beroende av linjebredd på syrekoncentrationen i intervallet från syrefria förhållanden upp till 760 mmHg pO2 partialtryck13, med värdena för inneboende linewidth saknas av syre och lutningen på syre beroendet (mätt i mG/mmHg) något olika för olika partier av microcrystal beredning. Därför krävs kalibrering för varje särskilt parti.
    1. Väga 60 mg LiNc-BuO microcrystals.
    2. För syre känslighet kalibrering, avbryta microcrystals 3 ml Dulbeccos modifierade Eagle Media (DMEM) medium (i en koncentration på 20 mg/mL) och Sonikera för 5 min på is med en sond någon sonikator vid 20 kHz med 7 W uteffekt i en 5 mL glasrör-runda-botten.
    3. Placera 1 mL av den sonicated microcrystals i ett glas röret i ytan spole resonator av L-bandet (1,2 GHz) EPR spektrometern och förvärva kontinuerliga vågor (CW) EPR spectra vid fysiologisk temperatur av 37 ° C och syre koncentrationer av 0, 1, 2, 4, 8 , och 20,9%. Upprätthålla syrekoncentrationen av bubblande lösningen med gasblandning som levereras från en gas controller och hålla temperaturen med hjälp av ett vattenbad som är kopplat till en termostat. Använd följande EPR spektrometer förvärv parametrar: modulering amplitud, 100 mG; modulationsfrekvensen, 100 kHz; sopa bredd, 5 G; sopa tid, 60 s.
    4. För att uppnå en bättre signal-brus-förhållande (SNR), använda en modulering amplitud värdet på 60% av linewidth (t.ex., använder en modulering amplitud 0,6 G för linewidth 1 g).
    5. Alternativ förenklad kalibreringen: registrera EPR spektra i luften-bubblade och anoxiska lösningar14. I det senare fallet, upprätthålla anoxi i proven genom tillsats av 10 mM glukos och 100 U/mL glukosoxidas till 1 mL sond lösningar enligt referens14.
    6. Passa EPR spektra med funktionen Lorentzian för att hitta linjebredd, LW. Utvärdera hur känslig mikrokristaller till pO2 som en lutning på beroendet av LW på pO2, nämligen som ett värde av (LWluft−LWanoxia) /pO2air, där LWluft och LWanoxia är spectra linewidth i luft och anoxi förhållanden, respektive; p O2air = 152 mmHg.
  2. Dubbel funktion pH och redox probe, NR
    Obs: NR sonden syntetiseras som beskrivs i referens11. Det är stabilt vid rumstemperatur både som en solid och i vattenlösningar. Syntetiserade NR sonden hålls vid 4 ° C. Uppdelningen av kväve hyperfine, enNoch andelen signalen amplituden förfall är de spektrala parametrar av NR sonden som är känsliga för pH (probe pKen = 6,6 vid 37 ° C, utbud av pH känslighet från 5,6 till 7,6) och för att minska kapaciteten i sonden närmiljön, respektive.
    1. Avlägsna NR ur frysen och låt behållaren värmas till rumstemperatur (10-15 min). Väg upp 6,34 mg för NR, Lös det i 1 mL koksaltlösning och justera pH till 7,2 med små delprover av HCl och NaOH med hjälp av en pH-mätare. Använd den beredda NR lösningen (10 mM) som en stamlösning.
    2. Utföra pH kalibrering av sonden NR enligt följande (se referens11). Först, tillsätt 0,1 mL stamlösning NR till 0,9 mL 2 mM Na-fosfat buffert, 150 mM NaCl. Titrera den erhållna 1 mM NR lösningen med portioner av HCl eller NaOH till krävs pH med pH-mätare. Kontrollera temperaturen med hjälp av ett vattenbad som är kopplat till en termostat.
    3. Spela in EPR spektra av proverna i 1,5 mL mikrocentrifugrör använder L-bandet EPR spektrometern. Använd följande EPR spektrometer förvärv parametrar: modulering amplitud, 2,5 G; modulationsfrekvensen, 100 kHz; sopa bredd, 60 G; sopa tid, 20 s.
    4. Mät det hyperfine dela konstant (enN) eftersom hälften av avståndet mellan låg - och hög-fältet komponenter av EPR spectrana och rita det kontra pH, att ge kalibreringskurvan för L-bandet EPR mätningar av pH.
  3. GSH-känsliga GFDFJH sond
    Obs: GFDFJH sonden syntetiseras som beskrivs i referens15. Lagra syntetiserade NR sonden vid 4 ° C. Den lipofila GFDFJH disulfid biradical sammansatta diffunderar lätt över cellmembranet att reagera med intracellulära GSH och tillhandahålla en tillförlitlig metod för att bestämma GSH i vivo som använder EPR16,17. Denna metod är baserad på de höga reaktion priserna av dominerande intracellulär av GSH tioler med GFDFJH sonden. Reaktionen av den GFDFJH biradical med GSH splittringar dess disulfide bond (se system 1) vilket resulterar i annullering av spin utbyte mellan två radikala fragment och manifesterar en minskning av biradical spektrala komponenter och motsvarande ökning av monoradical komponenter. För biradical GFDFJH sonden, andelen av ökningen av amplituden av komponenten monoradical är proportionell mot den GSH-koncentrationen och är en bekväm GSH-känsliga EPR spektrala parameter. Utvärdera GSH koncentration från mätningarna som i vivo EPR, har föregående kalibrering av den GFDFJH reaktionshastigheten med GSH vid motsvarande temperatur och pH ska utföras enligt följande.
    1. Avlägsna GFDFJH ur frysen och låt behållaren värmas till rumstemperatur (10-15 min). Väg upp 4,05 mg för NR och Lös det i 1 mL av DMSO lösning. Använd den beredda GFDFJH lösningen (10 mM) som en stamlösning.
    2. Fastställa värdet för de hastighet konstanta, kobs, GFDFJH med GSH vid önskvärd temperatur och pH reaktion enligt följande.
    3. Först, tillsätt 20 µL av GFDFJH stamlösning (10 mM) 0,98 ml av 1 mM Na-fosfat buffert, pH 7,2, 150 mM NaCl, att erhålla en 0,2 mM GFDFJH sond lösning.
    4. Bered lösningar av 1, 2 och 5 mM koncentrationer av GSH i 0,1 M Na-fosfat buffert vid pH 7,2. Noggrant utvärdera GSH-koncentrationen i cellerna av riktade orgeln från mätningarna i vivo , måste in vitro- kalibrering utföras vid ett pH nära värdet av intracellulära pH.
    5. Blanda lika stora volymer av 0,2 mM GFDFJH lösning och en av de GSH-lösningar som bereddes i steg 1.3.4. för en slutlig koncentration av sonden på 0,1 mM och GSH på 0,5, 1 eller 2,5 mM.
    6. Omedelbart efter GFDFJH och GSH lösning blandning, placera provet i EPR resonator och registrera EPR spektra varje 12 sekunder i 10 minuter. Sedan beräkna kineticsen av förhöjningen av monoradical spektrala amplituden. Använd följande EPR spektrometer förvärv parametrar: modulering amplitud, 1 G; modulationsfrekvensen, 100 kHz; sopa bredd, 60 G; sopa tid, 10-60 s.
    7. Passar den uppmätta EPR kineticsen till monoexponents och beräkna tidskonstanten av den exponentiella kineticsen, τ. Den linjära regressionen (1/τ = kobs × [GSH]) ger värdet observerad frekvens konstant reaktionen mellan GSH och GFDFJH (t.ex., 34 ° C och pH 7,2, kobs = 2,8 ± 0,2 M-1s-1)11.
  4. Multifunktionell hopp sond för pO2, pH och Pi bedömning
    Obs: Den monophosphonated trityl hopp sonden syntetiseras som beskrivs i referens12 och hålls vid 4 ° C. CW EPR spektra av hopp på pH << pKa (A - syra form) och pH >> pKen (B - grundläggande form) representeras av de midjekort jacka på grund av fosfor hyperfine splitting, enP. Typiska instrumentinställningarna är följande: modulering amplitud, 37,5 mG; modulationsfrekvensen, 100 kHz; sopa bredd, 0.9 G; sopa tid, 20-60 s. Vid mellanliggande pH (5 < pH < 8) EPR spectrumen av hopp sonden kännetecknas av en kvartett när både A och B staterna är närvarande. De enskilda EPR linewidth av HOPPET är en pO2 markör (noggrannhet, ≈ 1 mmHg; p O2 intervall 1-100 mmHg). Fraktionen av protonerade hopp (en form) är en pH markör i intervallet från 6 till 8,0 (noggrannhet, ± 0,05). Värdet av proton växelkursen (uttryckt i mG) med Pi utvinns av spectra simulering är en Pi-markör (noggrannhet, ± 0,1 mM, sortiment, 0,1-20 mM). Kalibreringsprocedurer utförs på fysiologisk temperatur (37 ° C), lösning jonstyrka (NaCl, 150 mM) och hopp sonden koncentration av 0,2 mM, som tidigare beskrivits i referenser12,18, och beskrivs nedan.
    1. Ta bort hopp sonden ur frysen och låt behållaren värmas till rumstemperatur (10-15 min).
    2. Väg upp 10,7 mg hopp sondens, Lös det i 1 mL koksaltlösning och justera pH till 7,4. Tillsätt 20 µL av beredda stamlösning av HOPPET (10 mM) till 0,98 mL saltlösning att erhålla en 0,2 mM hopp sond lösning.
    3. För sonden kalibrering av pH, titrera 0,2 mM av hopp sonden lösningen genom tillsats av en liten mängd NaOH eller HCl, med den slutliga utspädningen av provet mindre än 1%. Mät pH med en pH-elektrod kalibreras vid 37 ° C med hjälp av pH-värdena för referenslösningen rekommenderas av nationella presidiet av standarder (US). Använd en mantlade reaktion bägare bifogas en Cirkulator noga upprätthålla temperatur referens och titrerade lösningar under pH-mätningar. Upprätthålla syrefria förhållanden genom tillsats av 10 mM glukos och 100 U/mL glukosoxidas till sonden lösningar.
    4. Förvärva EPR spektra av A och B former på pH ≤ 5 och pH ≥ 8, respektive i syrefria förhållanden i avsaknad av fosfat.
    5. Använd motsvarande spektra för att få inneboende spektrala parametrar. Nämligen, simulera spectral linjen som faltningen av funktionen Lorentzian med Gaussisk funktion som approximerar olösta super hyperfine strukturera av hopp sonden. Montering av de beräknade EPR spectrana att experimentella spektra ger värdena för enP och Lorentzian linewidth (ΔLpp), bestäms av den tvärgående avkoppling frekvens 1/T2 (där 1/T2 = (√3/2) Lpp för uppmätta derivatan av raden RF absorption i CW EPR), och linewidth av Gaussisk fördelning, G.
      Obs: Följande är de parametrar som erhålls från spektra mätt på de villkor som anges i steg 1.4.2: ettP(A) = 3,63 G, enP(B) = 3,37 G; 1/T2(A) = 23,6 mG; 1/T2B = 9 mG; G(A) = 40 mG; G(B) = 45 mG (se referens8).
    6. Förvärva EPR spektra av HOPE vid mellanliggande pH (5 < pH < 8). Simulera hög-arkiverat komponenten av de förvärvade EPR spectra att teorin om utbyte mellan flera platser i icke-kopplade eller löst kopplade system anpassade från referens19 som tidigare beskrivits18. Användning inneboende parametrarna erhållits för A och B staterna (se steg 1.4.5) att minska antalet variabler. Passar de beräknade spectrana till de experimentella att hitta värdena i bråket som en (pA), och rita av pA värde beroende av pH. Använd beroendet av pA på pH i fortsatta studier som pH kalibreringskurvan.
      Obs: Passande pH beroendet av pA med en standard Titrerkurvan ger värdet av dissociation konstant, pKen (hoppas) = 6,98. In-vivo studier är förvärva full EPR spektra av hopp sonden opraktiskt på grund av ytterligare tid krävs för att förvärva klyftan mellan låg - och hög-fältet komponenter av den fosfor hyperfine uppdelning i EPR spektrumet. Därför, i ytterligare exemplifieras studier endast hög-arkiverat komponenten av EPR spektrumet har varit mätt och analyserat.
    7. För sonden kalibrering av pO2, förvärva EPR spektra av hopp sonden på olika syrehalter.
    8. Av pO2 kontrollvärden av lösningar av bubblande med gasblandning levereras från en gas controller. Kontrollera lösningen temperatur (37 ° C) med hjälp av ett vattenbad som är kopplat till en termostat.
    9. Simulera EPR spektra och passar dem med experimentell de som beskrivs i steg 1.4.6 att bestämma värdena av syre-inducerad avkoppling priser.
      Obs: Värdena för syre-inducerad avkoppling priser var 0.49 mG/mmHg både för A och B former av hopp sond mätt vid 37 ° C8.
    10. För sonden kalibrering av [Pi], förvärva EPR spektra av hopp sonden vid olika koncentrationer som fosfat. Använd hopp radikal lösning med ett pH-värde nära pKen (pKen = 6,9 vid 37 ° C)18 och titrera den med olika fosfat koncentrationer. Upprätthålla den temperatur och gas sammansättningen som beskrivs i ovanstående steg.
    11. Simulera EPR spektra och passar dem med experimentell de som beskrivs i steg 1.4.6 att bestämma värdena av Pi-inducerad växelkurs.
      Obs: Beroendet av växelkursen Pi-inducerad på [Pi] används som kalibrering i fortsatta studier.

2. musmodeller av bröstcancer

  1. MMTV-PyMT spontana tumör modell
    1. Använd 4-8 vecka-gammal vän virus B-typen känslighet/NIH (Kandeekane/N) mus mjölkkörtlar tumör virus arrangören (MMTV) polyoma mitten-T antigen (PyMT +) honmöss med spontant bildade bröst tumörer i vivo EPR studier.
    2. För jämförelse av vävnad mikromiljö av normala mjölkkörtlar och tumörer, använda åldersmatchade littermate honor bristfällig i PyMT onkogen (PyMT−, ”vildtyp”)20.
    3. Utsätta möss för L-bandet EPR spektroskopi en gång per vecka i fyra veckor under isofluran anestesi (se sonden leverans nedan).
    4. Söva musen med hjälp av en luft-isofluran blandning (3% isofluran) och Placera musen på en justerbar tabell i en rätt lateral position med tumören (bröstkörtlarna) nära ytan spole resonator.
    5. Efter musen placering, administrera sonden genom intratissual (i.t.) injektion, tune EPR spektrometern och förvärva EPR spektra för 5-10 min.
    6. Mäter 2-3 bröst tumörer (från MMTV-PyMT + möss) eller icke-tumör med mjölkkörtlar (från PyMT− möss) under samma EPR session.
  2. Ortotop MET-1 tumör-modellen
    1. Växa bröstcancerceller i Kandeekane/N bakgrund Met-1 murina vid 37 ° C, 5% CO2och 95% relativ luftfuktighet i DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 10 µg/mL insulin, 5 ng/mL rhEGF och 1% PSA (penicillin G natrium, streptomycin sulfat och amfotericin B) till ~ 80% sammanflödet i en T175 kolv.
    2. Aspirera media och skölj vidhäftande cellerna med 10 mL PBS (1.54 mM KH2PO4, 155 mM NaCl och 2,71 mM Na2HPO4-7 H2O utan kalciumklorid eller magnesiumklorid, pH = 7.4).
    3. Lossa cellerna genom att tillsätta 5 mL 0,25% Trypsin-EDTA-lösning och gunga kolven. När cellerna är fristående, tillsätt 10 mL DMEM innehållande 10% FBS till kolven och samla cellerna.
    4. Centrifugera cellsuspension på 132 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och resuspendera till 1 x 106 celler per 100 µL minimal DMEM.
    5. Använder en insulinspruta (29G 1/2 nål), långsamt injicera 100 µL av tumör cellsuspension i de nummer 4 mjölkkörtlar fett kuddar av 8 veckor gamla honmöss Kandeekane/N vildtyp.
    6. Övervaka tumör inledande genom palpation (visas efter ca 2-3 veckor), tillväxt (visuell) och mus heath (visuell) varannan dag.
    7. Mäta tumör dimensioner en gång per vecka med bromsok och fastställa tumör volymer med hjälp av ekvation:
      Figure

3. sonden leverans för In Vivo funktionella mätningar

  1. Användning partiklar LiNc-BuO sonden (protokoll I) för pO2 mätningar i ortotop tumör modeller av implantation av tumörceller med internaliserade LiNc-BuO microcrystals som tidigare beskrivs14,21 och beskrivs nedan.
    1. När det gäller MET-1 tumör modellen, för internalisering av LiNc-BuO microcrystals till MET-1 celler, avbryta den LiNc-BuO microcrystals i DMEM vid en koncentration på 20 mg/mL och Sonikera med en sond någon sonikator vid 20 kHz med 7 W uteffekt i en 5 mL glasrör-runda-botten för 5 min på is.
    2. Tillsätt 100 µL (LiNc-BuO 2 mg) av suspensionen till en T75-kolv med 10 mL odlingssubstrat som innehåller MET-1 celler (cirka 30% konfluenta). Alla förfaranden som äger rum i ett biosäkerhet skåp och media innehåller penicillin och streptomycin att minimera eventuell infektion.
    3. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 72 tim eller tills de når ~ 80% konfluens.
    4. Aspirera media. Tvätta cellerna fem gånger med 10 mL PBS. Lossa cellerna med 5 mL trypsin-EDTA. Samla in cellerna. Centrifugera som beskrivs ovan i steg 2.2.4. Färga ett urval av celler med utslagning färgämne att bestämma cellernas viabilitet och kvantitet.
    5. Upphäva cellerna vid en koncentration på 1 x 10-6 per 100 µL minimal DMEM.
    6. Med en insulinspruta, injicera långsamt 100 µL cellsuspension som innehåller de internaliserade LiNc-BuO microcrystals till nummer 4 mjölkkörtlar fett kuddar av 8 veckor gamla Kandeekane/N vildtyp honmöss som beskrivs i steg 2.2.5.
    7. Övervaka tumör initiering och tillväxt som beskrivs i steg 2.2.6 och 2.2.7.
  2. Användning partiklar LiNc-BuO probe (protokoll II) i antingen spontan eller ortotop modeller. Injicera LiNc-OBu microcrystals på platsen av intresse, t.ex., i normal bröstkörtlar eller bröst tumörer, använder en insulinspruta.
  3. Lösliga sonder
    1. Söva möss genom inandning av blandningen luft-isofluran (1,0 L/min leverans och 2-3% av isofluran) använder en anestesi maskin och placera dem i mellanrummet av EPR spektrometern.
    2. Tune instrumentet och sedan injicera den NR (10-30 µL, 10 mM), hopp sonden (10−30 µL, 0,5-2 mM) i saltlösning, pH 7,2 eller GFDFJH probe i DMSO (10 µL, 10 mM) lösningar (i.t.).

4. in Vivo funktionella mätningar

  1. För EPR spektroskopiska mätningar, söva möss genom inandning av luft-isofluran blandning med hjälp av en anestesi maskin som beskrivs i steg 3.3.1.
  2. Utföra funktionella mätningar med L-bandet (1,2 GHz) EPR spektrometer som följer.
    1. Placera surface spole resonator på en normal bröstkörteln eller en mjölkkörtlar tumör och finjustera spektrometern.
    2. Förvärva EPR spektra från implanterade partiklar sonden för 5−10 min över flera veckor efter implantationen. När det gäller lösliga sonder, förvärva EPR spektra omedelbart efter sonden injektion för 5-10 min.
    3. Analysera EPR spektra av NR sonden att hitta det hyperfine splitting, ettNoch signalens amplitud, I(t). Konvertera värdet av enN till pH-värdet med hjälp av kalibreringskurvan erhölls i steg 1.2.4. Analysera graden av förfall av signalen amplituden I(t) som relativ förändring från den ursprungliga amplituden, I(t = 0), beräknade i godtyckliga enheter per sekund (s-1).
    4. Passa ökningen av komponenten monoradical av EPR spektrumet av GSH-känsliga GFDFJH sond till monoexponents att erhålla tidskonstanten av exponentiell kineticsen att beräkna GSH koncentration.
    5. Passa EPR spektra av hög-fältet komponent av multifunktionella hopp sonden med experimentell de som beskrivs i (steg 1.4.5) att ge värdena för pH, pO2 och Pi.

5. statistisk analys

  1. Utföra databehandling och statistiska analyser. Använd en Pearson's r korrelation test (för normalfördelade datamängder) och Spearman's Rank Order korrelation (för datamängder med avvisade normalitet av Datadistribution) för korrelation analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vävnad p O 2 Bedömning med hjälp av LiNc-BuO sonder:

Med hjälp av proceduren som beskrivs under steg 1.1, utfört vi kalibreringen av nylagade LiNc-BuO microcrystals suspension. Figur 2 visar typiska syre beroendet av linewidth av LiNc-BuO sonden, liksom dess exemplifieras EPR spectra mätt i buffert fjädring och tumör bröstvävnad hos kvinnliga C57Bl/6 möss vuxit efter tumör initiering av injektion av celler med internaliserade partiklar (steg 3.1). Använda linewidth kalibreringen möjliggör beräkning av värdet vävnad pO2 (motsvarar 7.5 mmHg för spectrum (b) visas i figur 2).

Figure 2
Figur 2 . EPR spektrala känslighet av partikelformiga LiNc-BuO sonden att syre. Representativa beroendet av linewidth av EPR spektrumet LiNc-BuO sonden suspensionen i DMEM på oxygen partialtryck visas. EPR spektrumet (infoga en) mättes på 0% av pO2, 37 ° C, och representerar en ren Lorentzian linje med den linewidth ΔHpp = 113 mG. Linewidth ökar linjärt med pO2 med en lutning på 11,7 mG/mmHg. Det spektrum som visas i (infoga b) mättes i mjölkkörtlar tumörvävnad sövda kvinnliga C57Bl/6 möss visar ΔHpp = 204 mG, vilket motsvarar vävnad pO2 7.5 mmHg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bedömning av vävnad extracellulära pH och Redox använder NR sonder:

Med hjälp av proceduren som beskrivs i steg 1.2, utfört vi kalibreringen av pH och redox sonden, NR. Figur 3 visar den observerade hyperfine dela konstant beroende, enN, för NR radikala på pH. Beroendet är beskrivs av en standard Titrerkurvan med pKen = 6,6 vid 37 ° C. Detta beroende av enN(pH) fungerar som kalibreringskurvan för motsvarande i vivo mätningar, vilket möjliggör pH-värden i intervallet från 5,6 till 7,6, med noggrannhet av 0,05 pH-enheter.

Figure 3
Figur 3 . EPR spektrala känslighet av lösliga NR sonden till pH. L-bandet EPR spektra av NR sonden lösningen förvärvades vid 37 ° C vid olika pH och pH-beroende av den observerade hyperfine dela konstant, enN, var ritade. Den heldragna linjen är passformen av experimentella data med standard Titrerkurvan, Equation 2 , framställning av pKen = 6.6, enN(NR-H+) = 14.24 G och enN(R) = 15.27 G. skär: exemplifieras EPR spektrum av 1 mM NR lösning (pH 6,4) förvärvade med följande spektrometer inställningar: magnetfält sopa, 80 G; modulering amplitud, 2,5 G, förvärv tid, 20 s. Den uppmätta hyperfine dela konstant är 14.63 G. Reproducerad från referens23 med tillåtelse av John Wiley & Sons, Inc. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 4 exemplifierar mätningar av pH och redox i en bröst tumör musmodell, utförs enligt beskrivningen i steg 3.3 (i.t. sonden injektion) och avsnitt 4 (spectra förvärv och spectra analys).

Figure 4
Figur 4 . EPR bedömning av vävnaden minskar kapaciteten i vivo. Infoga: L-bandet EPR spektrum av NR sonden mäts i vivo efter i.t. injektion (10 µL, 10 mM) i mjölkkörtlar tumörvävnad sövda kvinnliga Kandeekane/N möss. Det hyperfine splitting, enN, befanns vara lika 14.72 G, vilket motsvarar värdet av pHe = 6,52 förutsatt att tumören vävnad temperaturen 34 ° C och pKen = 6,6. Den NR minskningstakten bedöms av efter förfalla av central-fältet spektrala komponenten. Exemplifieras kinetik mätt i mjölkkörtlar tumör (■) och bröstkörtlarna (o) Visa högre reducerande förmåga av tumörvävnad vs normal bröstkörteln. Analysen av den inledande delen av kineticsen avkastningen av EPR signal minskning, kröda, den extracellulära medier i vävnaderna som 2,5 x 10-3/si tumören vs. 0,5 x 10-3/s i normal körtel. Återgivits från referens11 med tillåtelse av John Wiley & Sons, Inc. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 5 sammanfattas de pHe och redox mätningar som gjorts för gruppen av kvinnliga Kandeekane/N MMTV-PyMT möss i tumörer och normala mjölkkörtlar stöd tumör sura extracellulära närmiljön och minska högkapacitet.

Figure 5
Figur 5 . In vivo EPR bedömning av vävnad syra och minskar kapaciteten. Extracellulära vävnaden pH (fyllda staplar) och minskningen Betygsätt (tom barer) värdena för NR nitroxide i normala mjölkkörtlar och bröst tumörer i honmöss Kandeekane/N mätt i vivo EPR. Felstaplar beteckna SE. Reproducerad från referens11 med tillåtelse av John Wiley & Sons, Inc. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Samtidiga vävnad pH e , Redox, och p O 2 Bedömning genom att kombinera NR och LiNc-BuO sonder:

Partikelformiga LiNc-BuO är sond val när repetitiva längsgående mätningar av pO2 värden planeras i en förutbestämd vävnad av intresse. Tyvärr är en stor begränsning av partikelformiga sonden att den endast tillåter för detektion av syre och inga andra fysiologiskt relevanta kemiska parametrar inom TME och tillåter inte vävnad imaging. Användning av lösliga sonder i EPR har alltså fördelen med imaging och detektion av flera fysiologiskt relevanta TME parametrar. I detta avseende pO2 mätningar med hjälp av inopererade LiNc-BuO partiklar kan kombineras med dubbel funktion pH och redox NR sond eftersom låg - och hög-fältet spektrala komponenter av NR EPR spektrum inte överlappar med EPR fodra av den LiNc-BuO sonden.

Figur 6 visar en typisk EPR spektrum observeras av NR sonden omedelbart efter i.t. injektion i bröstvävnaden tumör av kvinnliga C57Bl/6 möss. Observerade triplett spectrumen av NR sonden överdras med enda EPR raden av LiNc-BuO microcrystals som har bäddats inom tumören (tumörtillväxt initierades genom injektion av cellerna med internaliserade partiklar som beskrivs i steg 3.1. PH-värdet beräknas genom att mätaN hyperfine dela som ett avstånd mellan låg - och hög-fältet komponenter och använda kalibrering visas i figur 3 (lika 6,88) för spectrum visas i figur 6. Observera att pO2 bedömning utförs baserat på mätningar av linjebredd på LiNc-BuO signalen före injektion av NR sonden. Sönderfallet av NR signalen ger värdet av vävnaden minskar kapaciteten som illustreras i figur 4.

Figure 6
Figur 6 . Multifunktionell TME bedömning att kombinera LiNc-BuO och NR sonder. EPR spektrum mätt i vivo i bröstvävnaden tumör av kvinnliga C57Bl/6 mus omedelbart efter i.t. injektion av NR sonden. Observerade triplett spektrumet för NR är ovanpå med en enda EPR rad LiNc-BuO sonder inbäddade i tumören. Det pH-värde som beräknats vid delningen mellan låg - och hög-fältet komponenter är 6,88. Sönderfallet av NR signalen ger värdet av vävnaden minskar kapaciteten. p O2 bedömning utförs utifrån mätningar av linewidth av den LiNc-BuO före injektion av NR sonden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

In Vivo Bedömning av intracellulära GSH:

Reaktionen av tiol-disulfid utbyte mellan GFDFJH sonden och GSH splittar den disulfide bond av sonden vilket resulterar i bildandet av två monoradicals22 och uppsägning av intramolekylära spin utbyte mellan monoradical fragment. Figur 7A illustrerar effekten av reaktionen av GFDFJH sonden med GSH på EPR spektra resulterar i försvinnandet av ”biradical” spektrala komponenter och motsvarande ökning av intensiteten av monoradical komponenter. Observerad frekvens konstanten av reaktionen mellan GSH och GFDFJH är: kobs = 2,8 ± 0,2 M-1s-1 (T = 34 ° C, pH 7,2)11. Figur 7B exemplifierar kineticsen av monoradical spektraltoppen intensitet förändringen mätt i mjölkkörtlar tumör (●) och normal bröstkörteln (o) med L-bandet EPR. De heldragna linjerna är passar i den inledande delen av kineticsen av den monoexponent som använder kobs = 2,8 M-1s-1 och framställning [GSH] = 10,7 mM respektive 3,3 mM för tumör och normala bröstkörteln,.

Figure 7
Figur 7 . In vivo EPR utvärdering av intracellulära vävnad glutation koncentrationer. (A) på X-bandet EPR spectra 100 µm GFDFJH mäts vid olika tidpunkter efter inkubation med 2,5 mM GSH i 0,1 M Na-fosfat buffert, pH 7,2, och 1 mM DTPA vid 34 ° C. Kinetik analysen ger observerad frekvens konstantvärdet reaktionen mellan GSH och GFDFJH, kobs (pH 7,2, 34 ° C) = (2,8 ± 0,2) M-1 s-1. (B) kineticsen av monoradical spektraltoppen intensitet förändringen mätt L-bandet EPR i mjölkkörtlar tumör (●) och normal bröstkörteln (o) Kandeekane/N möss omedelbart efter det att i.t. injektion av GFDFJH sond (se punkt 3.3.2). De heldragna linjerna är passar i den inledande delen av kineticsen av den monoexponent, anta kobs (pH 7,2, 34 ° C) = 2,8 M-1s-1 och framställning [GSH] = 10,7 mM respektive 3,3 mM för tumör och normala bröstkörteln,. Återgivits från referens11 med tillåtelse av John Wiley & Sons, Inc. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Multifunktionell bedömning av vävnad extracellulära pH, p O 2 , och Pi med multifunktionella hopp sonden:

Diagram 8 illustrerar känsligheten hos de spektrala parametrarna hopp sondens erhålls genom kalibrering förfaranden som beskrivs i avsnitt 1.4.

Figure 8
Figur 8 . Multifunktionell bedömningen av den kemiska närmiljön med hopp sond. (en) systemet för pH-beroende jämvikt mellan två jonisering stater av sonden. (b), L-bandet EPR spectrum av hopp. (c), The EPR linewidth av HOPPET är en pO2 markör (noggrannhet, ≈ 1 mmHg; p O2 intervall 1-100 mmHg). (d) andelen av protonerade hopp är en pH markör i intervallet från 6 till 8,0 (noggrannhet, ± 0,05). (e) beroende av proton växelkurs (uttryckt i mG) av HOPPET med oorganiskt fosfat (Pi) koncentration utvinns av spectra simulering (noggrannhet, ± 0,1 mM, utbud, 0,1-20 mM) 12,18. Återgivits från referens8 med tillåtelse av Nature Publishing Group. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9 visar multifunktionella mätningar som gjorts i Kandeekane/N vildtyp mjölkkörtlar och i de TME av MMTV-PyMT transgena möss som spontant utvecklar bröstcancer och efterlikna mänskliga tumör staging20. Medelvärdena för pO2 (50 ± 3 mmHg i TME vs. 58 ±3 mmHg i normal vävnad) och pHe (6.99 ± 0,03 i TME vs. 7,1 ± 0,03 i normal vävnad) stöder ett utseendemässigt av hypoxisk och sura regioner i tumören. De mest dramatiska förändringarna observerades i koncentrationen av interstitiell Pi (1,8 ± 0,2 mM i TME vs. 0,84 ± 0,07 mM i normal vävnad) indikerar en potentiell roll av interstitiell Pi koncentration som TME markör av tumör progression. De enskilda mätningarna visar stora variationer runt medelvärden. En viktig fördel av en multifunktionell sond är att alla parametrar mäts med hjälp av en enda probe, därför möjliggör korrelation analyser oberoende av probe distribution och tiden för mätningarna som illustreras i figur 9b- e. Den observerade positiva korrelationen mellan pO2 och pHe i normala bröstkörteln kontra avsaknad av korrelation i tumörer stöder tumör beroendet av glykolys oberoende av syrekoncentrationen; enligt vår mening är detta en exemplifieras i vivo demonstration av effekten Warburg. I sin tur är den observerade negativa korrelationen mellan interstitiell [Pi] och pO2 både i normal och tumör vävnader överens med föreningen för hög [Pi] (och låg ATP/Pi baserat) med ändringar i bioenergetik status vid lägre syre leverans.

Figure 9
Figur 9 . In vivo vävnad p O 2 pH e , och Pi bedömning med hjälp av hopp sonden och EPR. (en) fotografi av set-up för i vivo L-bandet EPR mätningar visar sövda musen mellan magneterna av EPR spektrometern, med insatsen till höger visar placering och positionering av loop resonator ovanpå den uppmätta vävnad. Notera interstitiell extracellulära localizationen av sonden hopp: inte tränga in i cellerna på grund av skrymmande laddade strukturer och hopp signalen från blodet upptäcks inte av EPR på grund av signal breddning av hopp komplexbildning med plasma albumin24 . (b–e) Korrelation mellan interstitiell pO2, pHeoch Pi-värden uppmätta i normala mjölkkörtlar hos Kandeekane/N vildtyp möss och TME av bröstcancer MMTV-PyMT transgena möss (n = 23). För att utöka räckvidden för syre variationer, fastställdes syrefria förhållanden i interstitiell utrymme genom i.t. injektion av syreförbrukande enzymatisk systemet av glukos/glukosoxidas (röda symboler). Blå linjer representerar en linjär passform för de totala datauppsättningarna. (b) en positiv korrelation mellan pO2 och pHe i normal vävnad (r = 0,5, p = 0,014 för svart symboler; r = 0,64, p = 1,8 × 10-4 för totala datauppsättningen) vs. (c) inga betydande samband mellan pO2 och pHe i TME (r = 0,01, p = 0,97 för svart symboler; r = 0,23, p = 0,3 för totala datauppsättningen) hittades. (d), en negativ korrelation mellan pO2 och Pi både i normal vävnad (r = −0.51, p = 0,013 för svart symboler; r = −0, 7, p = 2,3 × 10-5 för totala datauppsättningen) och (e) i TME (b, botten: r = −0, 4, p = 0.079 svarta symboler; r = −0.62, p = 0,001 för totala datauppsättningen) hittades. Anpassad från referens8 med tillstånd med av Nature Publishing Group. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De presenterade metoderna möjliggör noninvasiv i vivo bedömning av kritiska parametrarna för den kemiska TME, nämligen pO2, pH, redox status och koncentrationer av interstitiell Pi och intracellulära GSH. Magnetisk resonans tekniker, såsom MRI och låg-fältet EPR, är metoderna för val av noninvasiv i vivo profilering av dessa TME-parametrar. MRT visualiserar anatomiska strukturer men saknar funktionell känslighet. I motsats till MRI ger EPR tekniker funktionella känslighet till lokala parametrar för närmiljön när den används i kombination med funktionell spin sonder. Såvitt vi vet finns det inga andra metoder som är tillgängliga för att samtidigt bedöma i vivo fysiologiskt viktiga kemiska TME parametrar i levande ämnen, såsom pO2, pHe, Pi, redox och GSH.

Protokoll som beskrivs är baserad på användning av låg-fältet L-bandet EPR och specialdesignat paramagnetiska sonder. En uppsättning av fyra sonder presenteras i figur 1 kan anses vara ett effektivt i vivo TME bedömning test. Sonderna är en viktig förutsättning för mätningarna som beskrivs i vivo EPR. Syntesen av sonderna enligt den offentliggjorda förfaranden11,12,13,15 kräver expertis i syntetisk organisk kemi och kan bli ett viktigt steg för att metoden .

Tillämpningen av partikelformiga sonden möjliggör upprepade mätningar av vävnad pO2 för upp till veckor efter implantationen14,21. Lösliga sonder visar känslighet för ett utökat antal parametrar utöver syre koncentration25 och ge en möjlighet för spatial-löst mått26. I synnerhet ger en ansökan av multifunktionella hopp sonden oöverträffad möjlighet i vivo samtidiga mätningar av pH, pO2och Pi i extracellulära. Mätningar av de tre parametrarna som använder en enda sond möjliggör deras korrelation analyser som är oberoende av sonden distribution och tid av mätningar8.

Sonderna kan inte användas samtidigt, förutom den implanterade LiNc-BuO partiklar probe som kan användas i kombination med någon av de lösliga sonderna som visas i figur 6. Experimentell design bör därför baseras på separata mätningar av enskilda injektioner av specifika funktionella lösliga sonder. Hydrofil extracellulära pH och redox NR sonden kan levereras både via i.t. injektion11,14,26 och systemisk leverans27, medan två andra lösliga sonder, GFDFJH och hopp, låt för i.t. leverans endast 8 , 11 , 12 , 16. Observera att de framtida ombyggnader av GFDFJH och hoppas sonder kan övervinna den sistnämnda begränsningen av sonden leverans av utvecklingen av mer hydrofil och mindre giftiga sonden analoger för systemisk leverans25.

Observera att spektroskopiska EPR modalitet erbjuder de genomsnittliga värdena för de parametrar som mäts i den TME, som ofta kännetecknas av dess höga heterogenitet. Detta delvis döljer potentiella skillnader mellan parametrarna eller minskar betydelse i korrelation analys. Användningen av de beskrivna sonderna i imaging villkoren tillåter för att erhålla rumsligt-löst funktionell information26. Vi tror att framtiden för multifunktionella EPR imaging bygger på vidareutveckling av relativt nya metoder såsom snabb scan EPR imaging och Overhauser-enhanced MRI (OMRI, också betecknas proton-elektron dubbel-resonanstomografi, PEDRI). De nya riktningarna i utvecklingen av funktionella EPR sonder och avancerade bildgivande tekniker har nyligen diskuterats i motsvarande funktion artikel25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete var delvis stöds av NIH grants CA194013, CA192064 och U54GM104942. WVCTSI är erkänt för uppstart till VVK, AB, och TDE. Författarna tackar Dr. M. Gencheva och K. Steinberger för hjälpen med de belysande experiment. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-band EPR spectrometer Magnettech, Germany L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules
 Temperature & Gas Controller  Noxygen, Germany Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition  
Sonicator Fisher Scientific
GSH (L-Glutathione reduced) Sigma-Aldrich G4251
MMTV-PyMT  mice In house
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Met-1 murine breast cancer cells In house
C57Bl/6 wild type mice  Jackson Laboratory
Trypsin Thermo Fisher Scientific 25200056
Trypan Blue Exclusion Dye  Thermo Fisher Scientific T10282
Ohmeda Fluotec 3 
Isoflurane (IsoFlo) Abbott Laboratories
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic sigma-Aldrich S07051
Sodium Chloride sigma-Aldrich S7653
Hydrochloric acid sigma-Aldrich 320331
Sodium Hydroxide sigma-Aldrich S8045
Glucose sigma-Aldrich
Glucose oxydase sigma-Aldrich
Lauda Circulator E100 Lauda-Brikmann
pH meter Orion Thermo Scientific 
LiNc-BuO probe In house The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13
NR probe In house The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11
RSSR probe In house The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15
HOPE probe In house The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siemann, D. W. Tumor Microenvironment. , John Wiley & Sons Ltd.,. Chichester, UK; Hoboken, NJ, USA. (2011).
  2. Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
  3. Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
  4. Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
  5. Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
  6. Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
  7. Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
  8. Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233 (2017).
  9. Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
  10. Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
  11. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
  12. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
  13. Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
  14. Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
  15. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  16. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
  17. Hicks, R. Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , John Wiley & Sons, Ltd. 537-566 (2010).
  18. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
  19. Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. Practical NMR spectroscopy. , Heyden. (1980).
  20. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  21. Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
  22. Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
  23. Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
  24. Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
  25. Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
  26. Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
  27. Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).

Tags

Cancerforskning fråga 133 Electron paramagnetiska resonans nitroxide trityl radikala pH syrekoncentrationen redox status glutation oorganiskt fosfat tumör mikromiljö
<em>In Vivo</em> EPR bedömning av pH, <em>p</em>O<sub>2</sub>, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bobko, A. A., Eubank, T. D.,… More

Bobko, A. A., Eubank, T. D., Driesschaert, B., Khramtsov, V. V. In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (133), e56624, doi:10.3791/56624 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter