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Cancer Research

In Vivo Évaluation des EPR du pH, pO2, statut Redox et les Concentrations de Phosphate et de glutathion dans le microenvironnement tumoral

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/56624
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1In Vivo Multifunctional Magnetic Resonance center, Robert C. Byrd Health Sciences Center, West Virginia University, 2Department of Biochemistry, West Virginia University School of Medicine, 3Department of Microbiology, Immunology & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

Summary

La résonance paramagnétique électronique champ faible (bande L, 1,2 GHz) à l’aide des sondes nitroxyles et trityle solubles est démontrée pour l’évaluation des paramètres physiologiques importants dans le microenvironnement tumoral dans des modèles murins de cancer du sein.

Abstract

Ce protocole démontre la capacité de résonance paramagnétique électronique de champ faible (RPE)-basé techniques en combinaison avec des sondes paramagnétiques fonctionnelles pour fournir des informations quantitatives sur le microenvironnement tumoral chimique (TME), y compris p O2, statut redox, pH, concentrations d’interstitielle phosphate inorganique (Pi) et intracellulaire glutathion (GSH). En particulier, une demande d’une sonde trityle multifonctionnel soluble récemment développés fournit une occasion inégalée pour in vivo des mesures simultanées de p,H, pO2 et Pi dans E espace mi (sonde d’espoir). Les mesures des trois paramètres à l’aide d’une seule sonde permettant leur analyse de corrélation indépendantes de distribution de la sonde et l’heure des mesures.

Introduction

Un rôle clé de la TME dans la progression du cancer et la thérapie est de plus en plus apprécié1. Parmi les paramètres physiologiques importants de la TME dans les tumeurs solides, d’une hypoxie tissulaire2, acidose3,4, réducteurs haute capacité5, des concentrations élevées de6,de GSH intracellulaire7, et interstitielle Pi8 sont bien documentés. Non invasif in vivo pO2, pH, Pi, BA et oxydo-réduction évaluations fournissent un aperçu unique des processus biologiques dans TME et outils d’avance pour le dépistage préclinique des médicaments anticancéreux et stratégies thérapeutiques ciblées TME. Une profondeur de pénétration de radiofréquence raisonnable dans les tissus par l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et des techniques basées sur l’EPR de champ faible rend les approches les plus appropriées pour l’évaluation non invasive de ces paramètres TME. MRI dépend en grande partie d’imagerie protons de l’eau et est largement utilisé dans les milieux cliniques pour fournir une résolution anatomique mais manque de résolution fonctionnelle. Les mesures de 31P RMN (31P-NMR) de concentration de Pi et pH basé sur un signal de phosphate endogène extracellulaires sont potentiellement intéressants pour la caractérisation de la TME, mais sont habituellement masqués par plusieurs fois plus élevé intracellulaire Pi concentrations9,10. En revanche, mesures de l’EPR s’appuient sur la spectroscopie et imagerie de spécialement conçu des sondes paramagnétiques pour fournir une résolution fonctionnelle. Notez qu’exogène EPR sondes ont un avantage sur les exogènes NMR sondes en raison de la grande sensibilité intrinsèque plus élevée de l’EPR et l’absence de signaux RPE fond endogène. Le développement récent d’une nitroxyles double fonction de pH et redox probe11 et multifonctionnel trityle sonde12 offre des possibilités inégalées pour in vivo des mesures simultanées de plusieurs paramètres TME et leur analyses de corrélation dépend de la distribution de la sonde et l’heure de la mesure. À notre connaissance, il n’y a pas d’autres méthodes disponibles pour évaluer simultanément en vivo physiologiquement importants paramètres chimiques TME dans des sujets vivants, tels que pO2, pHe, Pi, oxydo-réduction et BA.

Sondes pour In Vivo Mesures fonctionnelles :

La figure 1 illustre les structures chimiques des sondes paramagnétiques utilisés pour accéder aux paramètres TME, incluent des sondes particulaires et solubles. Haute sensibilité fonctionnelle, de la stabilité dans les tissus vivants et toxicité minimale sont quelques avantages qui rendent les particules sondes préféraient plutôt que des sondes solubles pour in vivo l’oxymétrie EPR. Par exemple, particules sondes ont augmenté les temps de rétention sur le site de l’implant de tissus par rapport aux sondes solubles permettant la mesure longitudinale du tissu pO2 sur plusieurs semaines. En revanche, les sondes solubles surpassent particules sondes en fournissant des mesures spatiales résolues en utilisant EPR axée sur les techniques d’imagerie ainsi que permettant des analyses concomitantes de plusieurs fonctionnalités (pO2, pH, Pi, redox, et BA).

Figure 1
La figure 1. Structures chimiques des sondes paramagnétiques qui assemblent des test d’évaluation de TME. Cela inclut la sonde de2 particules pO, LiNc-BuO (R = - O (CH2)3CH3) et les sondes solubles : double fonction sonde pH et redox, NR ; BA-sensible à la sonde, RSER ; et multifonctionnel pO2, pH et sonde de Pi du microenvironnement extracellulaire, la sonde espoir. La synthèse de ces sondes a été décrite dans les références fournies 11,12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Protocol

Tous les animaux travaux ont été réalisés conformément au protocole de WVU IACUC approuvé.

1. sonde de synthèse et étalonnage

  1. Particules pO2-sonde de LiNc-BuO sensible
    Remarque : LiNc-BuO microcristaux est synthétisés et préparé comme indiqué en référence13. Ils sont très stables et peuvent être conservés à température ambiante pendant ans. La largeur des raies de la sonde de particules LiNc-BuO EPR sont une pO2-paramètre sensible. LiNc-BuO microcristaux démontre idéale dépendance linéaire de la largeur des raies sur la concentration d’oxygène dans la gamme des conditions anoxiques à 760 mmHg de pression partielle2 pO13, avec les valeurs de largeur de raie intrinsèque en l’absence de l’oxygène et la pente de la dépendance de l’oxygène (mesurée en mG/mmHg) légèrement différentes pour différents lots de la préparation de microcristallines. Il est donc nécessaire pour chaque lot notamment étalonnage.
    1. Peser 60 mg de microcristaux de LiNc-BuO.
    2. Pour l’étalonnage de sensibilité de l’oxygène, suspendre des microcristaux dans 3 mL de milieu modifié Eagle Media (DMEM) de Dulbecco (à une concentration de 20 mg/mL) et laisser agir pendant 5 minutes sur la glace avec un sonicateur sonde à 20 kHz à l’aide de 7 W de puissance dans un tube fond rond en verre de 5 mL.
    3. Placez 1 mL de la microcristaux aux ultrasons dans un verre tube dans le résonateur de bobine de surface du spectromètre RPE bande L (1,2 GHz) et d’acquérir des spectres rpe des ondes continues (CW) à la température physiologique de 37 ° C et l’oxygène des concentrations de 0, 1, 2, 4, 8 et 20,9 %. Maintenir la concentration en oxygène par la propagation de la solution avec le mélange de gaz livré à partir d’un contrôleur de gaz et maintenir la température à l’aide d’un bain d’eau attaché à un thermostat. Utilisez les paramètres d’acquisition de spectromètre EPR suivants : modulation d’amplitude, 100 mG ; fréquence de modulation, 100 kHz ; largeur de balayage, 5 G ; balayage de temps, de 60 s.
    4. Pour obtenir un meilleur rapport signal sur bruit (SNR), utilisez une valeur d’amplitude modulation de 60 % de la largeur des raies (par exemple, utiliser une modulation d’amplitude 0,6 G pour la largeur des raies de 1 G).
    5. Remplacement simplifié la procédure d’étalonnage : enregistrer les spectres rpe en solutions air-barboter et anoxiques14. Dans ce dernier cas, maintenir l’anoxie dans les échantillons par l’addition de 10 mM de glucose et de 100 U/mL glucose oxydase aux solutions sonde 1 mL selon la référence14.
    6. Monter les spectres rpe avec la fonction lorentzienne pour trouver la largeur de la ligne, LW. Évaluer la sensibilité des microcristaux de pO2 comme une pente de la dépendance de LW sur pO2, à savoir comme une valeur de (LWair−LWanoxie) /pO2Le, oùaérienne de la LW et LWanoxie sont des spectres linewidth dans des conditions d’air et l’anoxie, respectivement ; p O2Le = 152 mm Hg.
  2. Double fonction sonde pH et redox, NR
    Remarque : La sonde NR est synthétisée comme décrit dans référence11. Il est stable à température ambiante sous forme de solide et en solution aqueuse. La sonde NR synthétisée est maintenue à 4 ° C. La séparation hyperfine azote,Net la vitesse de décroissance d’amplitude de signal sont les paramètres spectraux de la sonde NR qui sont sensibles au pH (sonde pKun = 6,6 à 37 ° C, plage de sensibilité de pH de 5,6 à 7,6) et à la capacité réductrice de la sonde microenvironnement, respectivement.
    1. Retirer le NR du congélateur et laisser le conteneur se réchauffer à température ambiante (10-15 min). Peser à 6,34 mg de la NR, dissoudre dans 1 mL de solution saline et ajuster le pH à 7,2 avec petites parties aliquotes de HCl ou NaOH à l’aide d’un pH-mètre. Utiliser la solution préparée de la NR (10 mM) comme une solution-mère.
    2. Effectuer l’étalonnage du pH de la sonde NR comme suit (voir référence11). Tout d’abord, ajouter 0,1 mL de la solution mère de NR à 0,9 mL de tampon de 2 mM Na-phosphate, NaCl 150 mM. Titrer la solution obtenue 1 mM NR avec parties aliquotes de HCl ou NaOH pour le pH requis à l’aide d’un pH-mètre. Contrôler la température à l’aide d’un bain d’eau attaché à un thermostat.
    3. Enregistrer les spectres rpe des échantillons dans des microtubes de 1,5 mL à en utilisant le spectromètre bande L EPR. Utilisez les paramètres d’acquisition de spectromètre EPR suivants : modulation d’amplitude, 2,5 G ; fréquence de modulation, 100 kHz ; largeur de balayage, 60 G ; balayage de temps, 20 s.
    4. Mesurer la structure hyperfine fractionnement constant (N) comme la moitié de la distance entre les composants de faible et grande pelouse de spectres rpe et il intrigue versus le pH, pour fournir la courbe d’étalonnage pour la mesure de la bande L EPR du pH.
  3. Sonde de RSER GSH-sensible
    Remarque : La sonde RSER est synthétisée comme décrit dans référence15. Stockez la sonde NR synthétisée à 4 ° C. Le lipophiles RSER disulfure biradical composé diffuse facilement à travers la membrane cellulaire de réagir avec GSH intracellulaire et de fournir une méthode fiable pour déterminer BA in vivo à l’aide de REP16,17. Cette méthode est basée sur les vitesses de réaction forte du pool intracellulaire prédominant de thiols BA avec la sonde RSER. La réaction du RSER biradical avec fractionnements BA son disulfure bond (voir schéma 1) ce qui entraîne l’annulation de l’échange de spin entre les deux fragments radicales et qui manifeste une diminution des composantes spectrales biradical et correspondant augmentation des composants monoradical. Pour la sonde de RSER biradical, le taux de l’augmentation de l’amplitude de la composante monoradical est proportionnel à la concentration de GSH et est un paramètre spectral commode de GSH sensibles EPR. Pour évaluer la concentration de GSH des mesures in vivo EPR, l’étalonnage précédent de la vitesse de la réaction de RSER avec BA à la température et le pH correspondant doit être effectué comme suit.
    1. Retirer le RSER du congélateur et laisser le conteneur se réchauffer à température ambiante (10-15 min). Peser 4,05 mg de la NR et dissoudre dans 1 mL de solution de DMSO. Utiliser la solution ainsi préparée RSER (10 mM) comme une solution-mère.
    2. Déterminer la valeur de la vitesse constante, kobs, de la réaction du RSER avec BA à la température désirable et à pH comme suit.
    3. Tout d’abord, ajouter 20 µL de la solution mère RSER (10 mM) à 0,98 mL de tampon de 1 mM Na-phosphate, pH 7,2, 150 mM NaCl, pour obtenir un 0,2 mM RSER sonde solution.
    4. Préparer des solutions de concentrations de 1, 2 et 5 mM de BA en tampon Na-phosphate 0,1 M à pH 7,2. Pour évaluer avec précision la concentration de GSH dans les cellules de l’organe ciblé des mesures in vivo , la calibration in vitro doit être exécuté à un pH proche de la valeur du pH intracellulaire.
    5. Mélanger des quantités égales de 0,2 mM RSER solution et une des solutions BA préparées à l’étape 1.3.4. pour une concentration finale de la sonde à 0,1 mM et de GSH à 0,5, 1 ou 2. 5 mM.
    6. Immédiatement après la solution RSER et BA mélanger, placer l’échantillon dans le résonateur de l’EPR et enregistrer les spectres rpe toutes les 12 secondes pendant 10 minutes. Puis calculer la cinétique de l’augmentation de l’amplitude spectrale de monoradical. Utilisez les paramètres d’acquisition de spectromètre EPR suivants : modulation d’amplitude, 1 G ; fréquence de modulation, 100 kHz ; largeur de balayage, 60 G ; temps de balayage, 10-60 s.
    7. Monter la cinétique d’EPR mesurée à la monoexponents et calculer la constante de temps de la cinétique exponentielle, τ. La régression linéaire (1/τ = k ×obs [BA]) fournit la valeur de constante de vitesse observée de la réaction entre BA et RSER (p. ex., à 34 ° C et à pH 7,2, kobs = 2,8 ± 0,2 M-1s-1)11.
  4. Sonde d’espoir multifonctionnel de pO2, pH et d’évaluation de la Pi
    Remarque : Le monophosphonated trityle sonde espoir est synthétisé comme décrit dans référence12 et est conservé à 4 ° C. Spectres rpe CW de l’espoir à pH << pKa (A - forme acide) et pH >> pKa B - formulaire de base sont représentés par les doublets en raison de phosphore hyperfine fractionnement, uneP. Les paramètres de l’instrument typiques sont comme suit : modulation d’amplitude, de 37,5 mG ; fréquence de modulation, 100 kHz ; largeur de balayage, 0,9 G ; temps de balayage, 20-60 s. À pH intermédiaire (5 < pH < 8) le spectre RPE de sonde espoir se caractérise par un quatuor lorsque des A et B États sont présents. La largeur de raie EPR individuel de l’espoir est un marqueur de2 pO (précision, ≈ 1 mmHg ; p O gamme2 , 1-100 mmHg). La fraction de protoné HOPE (une forme) est un marqueur de pH compris entre 6 à 8.0 (précision : ± 0,05). La valeur du taux de change proton (exprimée en mG) avec Pi extraite par simulation des spectres est un marqueur de Pi (précision, ± 0,1 mM, gamme, 0,1 à 20 mM). Procédures d’étalonnage sont effectuées à température physiologique (37 ° C), force ionique de la solution (NaCl 150 mM) et la concentration de sonde espoir de 0,2 mM, comme décrit précédemment dans références12,18et détaillés ci-dessous.
    1. Retirer la sonde espoir du congélateur et laisser le conteneur se réchauffer à température ambiante (10-15 min).
    2. Peser à 10,7 mg de la sonde de l’espoir, dissoudre dans 1 mL de solution saline et ajuster le pH à 7,4. Ajouter 20 µL de la solution mère préparée de l’espoir (10 mM) à 0,98 mL de la solution saline pour obtenir un espoir de 0,2 mM sonde solution.
    3. Pour l’étalonnage de la sonde de pH, titrer 0,2 mM de la solution de sonde espoir par l’ajout d’un petit volume de NaOH ou HCl, avec la dilution finale de l’échantillon de moins de 1 %. Mesurer le pH avec une électrode pH calibrée à 37 ° C, en utilisant les valeurs de pH de la solution de référence recommandée par National Bureau of Standards (US). Utilisez un bécher de réaction chemisé attaché à un circulateur pour maintenir la température de référence et des solutions titrées de soigneusement pendant les mesures de pH. Maintenir des conditions anoxiques par l’addition de 10 mM de glucose et 100 U/mL glucose oxydase pour les solutions de la sonde.
    4. Acquérir les spectres rpe des formes A et B ≤ pH 5 et pH ≥ 8, respectivement, dans des conditions anoxiques en l’absence de phosphate.
    5. Utilisez les spectres correspondants pour obtenir les paramètres spectraux intrinsèques. À savoir, simuler la raie spectrale comme le produit de convolution de la fonction lorentzienne avec la fonction gaussienne qui se rapproche de la structure hyperfine du suspens super de la sonde de l’espoir. Le montage des spectres rpe calculées à des spectres expérimentaux donne les valeurs deP et linewidth lorentzienne (ΔLpp), déterminés par le taux de relaxation transversale, 1/T2 (où 1/T2 = pp (/ 3/2) L pour la mesure dérivée de la raie d’absorption de RF dans CW EPR) et la largeur des raies de distribution gaussienne, G.
      Remarque : Voici les paramètres obtenus à partir des spectres mesurés dans les conditions indiquées dans l’étape 1.4.2 : unP(A) = 3,63 G,P(B) = 3,37 G ; 1/T2(A) = 23,6 mG ; 1/T2(B) = 9 mG ; G(A) = 40 mG ; G(B) = 45 mG (voir référence8).
    6. Acquérir les spectres rpe de l’espoir à pH intermédiaire (5 < pH < 8). Simuler la composante haute-déposer des spectres rpe acquis à l’aide de la théorie de l’échange entre plusieurs sites dans les systèmes faiblement couplés ou non couplés adaptés de référence19 comme décrit précédemment18. Utiliser les paramètres intrinsèques obtenus pour A et B États (voir étape 1.4.5) pour diminuer le nombre de variables. Monter les spectres calculés à celles expérimentales pour trouver les valeurs de la fraction une (pA) et tracer la dépendance à l’égard de la valeur deA p pH. Utiliser la dépendance de pA le pH dans d’autres études comme une courbe d’étalonnage pH.
      Remarque : Montage de la dépendance au pH de p,A , avec une courbe de titrage standard fournit la valeur de la dissociation constante, pKun (HOPE) = 6,98. Dans des études in vivo , acquérir les spectres rpe complets de la sonde de l’espoir est impraticable en raison du temps supplémentaire nécessaire à l’acquisition de l’écart entre les composants de faible et grande pelouse de la séparation dans le spectre RPE hyperfine phosphore. Par conséquent, dans des études plus poussées dont témoigne seulement la composante haute-déposer du spectre RPE a été mesurée et analysée.
    7. Pour l’étalonnage de la sonde de pO2, acquérir les spectres rpe de la sonde de l’espoir à différentes concentrations d’oxygène.
    8. Valeurs de contrôle pO2 des solutions par barbotage avec mélange de gaz livré d’un contrôleur de gaz. Contrôler la température de la solution (37 ° C) à l’aide d’un bain d’eau attaché à un thermostat.
    9. Simuler les spectres rpe et fixez-les sur les plus expérimentales, comme indiqué au point 1.4.6 pour déterminer les valeurs des taux de relaxation induite par l’oxygène.
      Remarque : Les valeurs des taux de relaxation induite par l’oxygène étaient 0,49 mG/mmHg deux pour A et B des formulaires de l’espoir sonde mesurée à 37 ° C8.
    10. Pour l’étalonnage de la sonde de [Pi], acquérir les spectres rpe de la sonde de l’espoir à différentes concentrations de phosphate. Utiliser la solution radicale de l’espoir avec un pH près de pKun (pKun = 6,9 à 37 ° C)18 et il titrer avec différentes concentrations de phosphate. Maintenir la composition de la température et des gaz comme ci-dessus en étapes.
    11. Simuler les spectres rpe et fixez-les sur les plus expérimentales, comme indiqué au point 1.4.6 pour déterminer les valeurs de Pi-induit des taux de change.
      Remarque : La dépendance à l’égard du taux de change induite par la Pi [Pi] sert d’étalonnage dans d’autres études.

2. souris modèles de Cancer du sein

  1. Modèle de tumeurs spontanées MMTV-PyMT
    1. Utiliser les 4-8 semaine-vieux ami virus type B sensibilité/NIH (FVB/N) souris mammary tumor virus promoteur (MMTV) polyome middle-T antigène (PyMT +) des souris femelles avec des tumeurs mammaires spontanément formés pour des études in vivo EPR.
    2. Pour comparaison des micro-environnements tissus de tumeurs des glandes mammaires normales, utilisez femelles de même âge même portée déficientes en oncogène (PyMT−, « type sauvage ») daté du20.
    3. Sous réserve des souris à la spectroscopie RPE bande L une fois par semaine pendant quatre semaines durant l’anesthésie isoflurane (voir sonde livraison ci-dessous).
    4. Anesthésier la souris à l’aide d’un mélange air-isoflurane (3 % isoflurane) et placez la souris sur une table réglable en position droite, latérale avec la tumeur (glandes mammaires) près de la caisse de résonance de bobine de surface.
    5. Après le placement de la souris, administrer la sonde par injection d’intratissual (i.t.), tune le spectromètre EPR et acquérir les spectres rpe pendant 5-10 min.
    6. Mesurer les 2-3 tumeurs mammaires (de MMTV-PyMT + souris) ou non-tumeur portant des glandes mammaires (à partir de souris PyMT−) pendant la même session de l’EPR.
  2. Modèle de tumeur orthotopique MET-1
    1. FVB/N contexte Met-1 murin cellules mammaires cancéreuses à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité relative en DMEM contenant 10 % sérum fœtal (SVF), 10 µg/mL d’insuline, rhEGF de 5 ng/mL et 1 % de croissance PSA (pénicilline G sodique, sulfate de streptomycine et amphotéricine B) à environ 80 % confluent dans une fiole de T175.
    2. Aspirer les médias et rincer les cellules adhérentes avec 10 mL de PBS (1,54 mM KH2PO4, 155 mM NaCl et 2,71 mM Na2HPO4-7 H2O sans chlorure de calcium ou le chlorure de magnésium, pH = 7,4).
    3. Détacher les cellules en ajoutant 5 mL de solution de trypsine-EDTA de 0,25 % et le ballon à bascule. Lorsque les cellules sont détachés, ajouter 10 mL DMEM contenant 10 % FBS dans le ballon et de recueillir les cellules.
    4. Centrifuger la suspension cellulaire à 132 x g pendant 10 min à 4 ° C. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et remettre en suspension à 1 x 106 cellules / µL 100 DMEM minime.
    5. À l’aide d’une seringue à insuline (aiguille de 29 1/2), injecter lentement 100 µL de la suspension de cellules tumorales dans les coussinets adipeux mammaire numéro 4 de souris de type sauvage FVB/N femelles âgés de 8 semaines.
    6. Surveiller l’initiation tumorale par palpation (apparaît après environ 2-3 semaines), croissance (visuelle) et souris heath (visuel) tous les deux jours.
    7. Mesurer les dimensions de la tumeur une fois par semaine à l’aide d’étriers et de déterminer les volumes de la tumeur à l’aide de l’équation :
      Figure

3. livraison sonde pour les mesures de fonctionnelles In Vivo

  1. Utilisation de la sonde LiNc-BuO particulaire (Protocole I) pour les mesures de2 pO dans les modèles de tumeur orthotopique par implantation de cellules tumorales avec intériorisée LiNc-BuO microcristaux comme précédemment décrit14,21 et détaillées ci-dessous.
    1. Dans le cas du modèle de tumeur MET-1, pour l’internalisation des microcristaux de LiNc-BuO MET-1 cellules, suspendre les microcristaux de LiNc-BuO dans DMEM à une concentration de 20 mg/mL et laisser agir avec un sonicateur sonde à 20 kHz à l’aide de 7 W de puissance dans un tube fond rond en verre de 5 mL pendant 5 min sur la glace.
    2. Ajouter 100 µL (2 mg de LiNc-BuO) de la suspension dans un ballon T75 avec 10 mL de milieu de culture contenant des cellules de MET-1 (environ 30 % anastomosé). Toutes les procédures se déroulent dans une enceinte de sécurité biologique et les médias contient la pénicilline et la streptomycine pour minimiser les infections potentielles.
    3. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 72 h ou jusqu'à ce qu’ils atteignent ~ 80 % confluence.
    4. Aspirer les médias. Laver les cellules cinq fois avec 10 mL de PBS. Détacher les cellules avec 5 mL de trypsine-EDTA. Recueillir les cellules. Centrifugeuse comme indiqué ci-dessus au point 2.2.4. Tache d’un échantillon de cellules avec un colorant d’exclusion afin de déterminer la quantité et la viabilité cellulaire.
    5. Suspendre les cellules à une concentration de 1 x 106 par 100 µL DMEM minime.
    6. À l’aide d’une seringue à insuline, injecter lentement 100 µL de la suspension de cellules contenant les microcristaux de LiNc-BuO intériorisée dans les coussinets adipeux mammaire numéro 4 de souris de type sauvage FVB/N femelles de 8 semaines tel que décrit à l’étape 2.2.5.
    7. Surveiller l’initiation tumorale et la croissance comme indiqué aux paragraphes 2.2.6 et 2.2.7.
  2. Sonde de LiNc-BuO particulaire utilisation (Protocole II) en soit spontanée ou modèles orthotopiques. Injecter LiNc-OBu microcristaux sur le site d’intérêt, par exemple, dans les glandes mammaires normales ou des tumeurs mammaires, à l’aide d’une seringue à insuline.
  3. Sondes solubles
    1. Anesthésier les souris par inhalation d’un mélange air-isoflurane (livraison de 1,0 L/min et 2 à 3 % d’isoflurane) à l’aide d’une anesthésie de la machine et rangez-les dans le fossé du spectromètre EPR.
    2. Accorder l’instrument, puis injecter la NR (10-30 µL, 10 mM), la sonde de l’espoir (10−30 µL, 0,5 à 2 mM) dans une solution saline, pH 7,2 ou sonde RSER dans les solutions de DMSO (10 µL, 10 mM) (i.t.).

4. mesures de fonctionnelles in Vivo

  1. Pour des mesures spectroscopiques EPR, anesthésier les souris par inhalation d’air-isoflurane mélange à l’aide d’une machine d’anesthésie comme indiqué au point 3.3.1.
  2. Effectuer des mesures fonctionnelles utilisant le spectromètre RPE bande L (1,2 GHz) comme suit.
    1. Placez le résonateur de bobine de surface sur une glande mammaire normale ou d’une tumeur mammaire et capter le spectromètre.
    2. Acquérir les spectres rpe de la sonde de particules implantée pendant 5−10 min pendant plusieurs semaines après l’implantation. Dans le cas des sondes solubles, acquérir les spectres rpe immédiatement après l’injection de la sonde pendant 5-10 min.
    3. Analyser les spectres rpe de la sonde NR à trouver la structure hyperfine fractionnement, unNet l’amplitude du signal, i (t). Convertir la valeur d’unN à la valeur du pH à l’aide de la courbe d’étalonnage obtenue à l’étape 1.2.4. Analyser le taux de décomposition de l’amplitude du signal i (t) comme la variation relative de l’amplitude initiale, I(t = 0), calculés en unités arbitraires par seconde (s-1).
    4. S’adapter à l’augmentation de la composante monoradical du spectre RPE de sonde RSER BA sensibles à la monoexponents pour obtenir la constante de temps de la cinétique exponentielle pour calculer la concentration de GSH.
    5. Monter les spectres rpe de haut champ composant de la sonde espoir multifonctionnelle à celles expérimentales décrites (étape 1.4.5) pour obtenir les valeurs de pH, pO2 et Pi.

5. analyse statistique

  1. Effectuer le traitement des données et analyses statistiques. Utilisez le test de corrélation de Pearson, un r (pour les ensembles de données distribuées normalement) et ordre de rang de Spearman (pour les ensembles de données avec rejetés normalité de la distribution des données) pour des analyses de corrélation.

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Representative Results

Tissu p O 2 Évaluation en utilisant le clic-BuO sondes :

En utilisant la procédure décrite sous étape 1.1, nous avons effectué l’étalonnage de suspension de microcristaux LiNc-BuO fraîchement préparée. La figure 2 illustre la dépendance de l’oxygène typique de la largeur des raies de la sonde de LiNc-BuO, ainsi que ses spectres rpe authentifiées, mesurées en tampon suspension et dans le tissu de tumeur mammaire chez les souris C57Bl/6 femelles cultivées après le début de la tumeur par l’injection de cellules avec particules intériorisées (étape 3.1). À l’aide de l’étalonnage de la largeur des raies permet le calcul de la valeur de2 tissus pO (égale à 7,5 mm Hg pour le spectre (b), illustré à la Figure 2).

Figure 2
Figure 2 . Sensibilité spectrale EPR de la sonde de LiNc-BuO particulaire pour oxygène. La dépendance représentatif de la largeur des raies du spectre RPE de la suspension de la sonde LiNc-BuO dans DMEM sur la pression partielle d’oxygène est montrée. Le spectre RPE (insérer une) a été mesuré à 0 % de pO2, 37 ° C et représente une lignée pure de Lorentz avec la Δ de largeur de raieHpp = 113 mG. La largeur des raies augmentant linéairement avec la pO2 avec une pente de 11,7 mG/mmHg. Le spectre montré (insert b) a été mesuré dans le tissu de la tumeur mammaire d’anesthésiés souris C57Bl/6 femelles montrant ΔHpp = 204 mG, ce qui correspond à des tissus pO2 de 7,5 mm de Hg. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Évaluation des pH extracellulaire des tissus et des sondes Redox utilisant la NR :

En utilisant la procédure décrite sous étape 1.2, nous avons effectué l’étalonnage de la sonde pH et redox, NR. La figure 3 montre la séparation constante dépendance, unN, de la NR d’observées hyperfine radicale sur le pH. La dépendance est décrit par une courbe de titrage standard avec le pKun = 6,6 à 37 ° C. Cette dépendance à l’égard d’unN(pH) sert de la courbe d’étalonnage pour les correspondants en vivo mesures, permettant des mesures de pH compris entre 5,6 à 7,6, avec une précision de 0,05 unité pH.

Figure 3
Figure 3 . Sensibilité spectrale EPR de la sonde NR soluble à pH. Spectres rpe bande L de la solution de sonde NR ont été acquises à 37 ° C à différents pH et pH-dépendance à l’égard de la séparation constante, hyperfine observé unN, a été tracée. La ligne continue est l’ajustement de données expérimentales avec la courbe de titrage standard, Equation 2 , cédant pKun = 6.6, unN(NR-H+) = 14,24 G etN(R) = 15,27 G. Insert : exemplifié spectre RPE de solution 1 mM NR (pH 6,4) acquis en utilisant les paramètres suivants du spectromètre : balayage du champ magnétique, 80 G ; temps d’acquisition de modulation d’amplitude, 2,5 G, 20 s. La séparation constante hyperfine mesurée est de 14,63 G. reproduit de référence23 avec la permission de John Wiley & Sons, Inc. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 4 illustre les mesures de pH et redox dans un modèle de souris de tumeur mammaire, réalisée comme décrit aux étapes 3.3 (injection de sonde i.t.) et la section 4 (acquisition de spectres et analyse de spectres).

Figure 4
Figure 4 . Évaluation d’EPR de réduction de la capacité des tissus en vivo. Insert : Spectre de la bande L RPE de la sonde NR mesurée in vivo après injection i.t. (10 µL, 10 mM) dans le tissu de la tumeur mammaire d’anesthésiés souris FVB/N femelles. La structure hyperfine fractionnement, uneN, s’est avéré pour être égal à 14,72 G, ce qui correspond à la valeur du pHe = 6,52 en supposant la tumeur tissu température 34 ° C et pKun = 6,6. Le taux de réduction NR est évalué en suivant la décroissance de la composante spectrale centrale-champ. La cinétique dont témoigne mesurée dans les tumeurs mammaires (■) et des glandes mammaires (o) démontrent de plus grande capacité de réduction du tissu tumoral vs normale des glandes mammaires. L’analyse de la partie initiale de la cinétique donne les taux de la réduction du signal rpe, krouge, dans les médias extracellulaires des tissus comme 2,5 x 10-3/sdans la tumeur par rapport à 0,5 x 10-3/s dans la glande normale. Reproduit de référence11 avec la permission de John Wiley & Sons, Inc. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 5 résume les mesures de pHe et oxydo-réduction réalisées pour le groupe de souris FVB/N MMTV-PyMT femelles dans les tumeurs et les glandes mammaires normales soutenant micromilieu extracellulaire acide de tumeur et haute capacité réductrice.

Figure 5
Figure 5 . In vivo Évaluation des EPR d’acidité tissulaire et de réduire la capacité de. PH extracellulaire tissulaire (rempli bars) et la réduction de taux (barres vides) valeurs de NR nitroxyde dans les glandes mammaires normales et les tumeurs mammaires de souris FVB/N femelles mesurées par in vivo EPR. Barres d’erreur indiquent se reproduit de référence11 avec la permission de John Wiley & Sons, Inc. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

PH de tissus simultanés e , Redox, et p O 2 Évaluation en combinant NR et LiNc-BuO sondes :

BuO-LiNc particulaire est la sonde de choix quand répétitives mesures longitudinales des valeurs de pO2 sont prévus dans un tissu prédéterminé d’intérêt. Malheureusement, une limitation majeure de la sonde particulaire est qu’elle seulement permet la détection d’oxygène et d’aucun autre paramètre chimique physiologiquement pertinents au sein de la TME et ne permet pas d’imagerie des tissus. Ainsi, l’utilisation de sondes solubles dans les EPR ont l’avantage de l’imagerie et la détection des paramètres multiples de TME physiologiquement pertinents. À cet égard, pO2 mesures utilisant des particules de LiNc-BuO implantés peuvent être combinées avec le pH de la double fonction et oxydo-réduction NR sonde parce que les composantes spectrales basse - et haute-champ du spectre NR EPR ne se chevauchent pas avec la ligne de l’EPR de la Sonde de LiNc-BuO.

La figure 6 illustre un spectre RPE typique observé par la sonde NR immédiatement après l’injection de i.t. dans le tissu de tumeur mammaire de souris C57Bl/6 femelles. Le spectre observé triplet de la sonde NR se superpose avec la ligne EPR de microcristaux de LiNc-BuO qui ont été incorporées au sein de la tumeur (croissance de la tumeur a été lancée par l’injection des cellules avec des particules intériorisées comme indiqué au point 3.1. La valeur du pH est calculée en mesurant une séparation de hyperfine deN comme une distance entre les composants de faible et grande pelouse et à l’aide de l’étalonnage illustré à la Figure 3 (égal à 6,88) pour le spectre illustré à la Figure 6. Remarque que pO2 évaluation est effectuée fondées sur des mesures de la largeur des raies du signal LiNc-BuO avant l’injection de la sonde NR. La décroissance du signal NR fournit la valeur du tissu réduisant la capacité tel qu’illustré à la Figure 4.

Figure 6
Figure 6 . Sondes d’évaluation de TME multifonctionnelle combinant LiNc-BuO et NR. Spectre RPE mesurée in vivo dans le tissu de tumeur mammaire de souris C57Bl/6 femelle immédiatement après l’injection de i.t. de la sonde NR. Le spectre observé triplet de la NR est superposé avec une seule ligne de l’EPR de LiNc-BuO sondes incorporées au sein de la tumeur. La valeur de pH calculée à partir de la séparation entre les composants de faible et grande pelouse est 6,88. La décroissance du signal NR fournit la valeur de réduction de la capacité des tissus. p O2 évaluation est effectuée à base sur des mesures de la largeur des raies de la LiNc-BuO avant l’injection de la sonde NR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

In Vivo Évaluation de GSH intracellulaire :

La réaction d’échange thiol-disulfure entre la sonde RSER et BA scinde la liaison disulfure de la sonde, ce qui entraîne la formation de deux monoradicals22 et annulation d’échange de spin intramoléculaire entre les fragments de monoradical. Figure 7 illustre l’effet de la réaction de la tige sur les spectres rpe, ce qui entraîne la disparition des composantes spectrales « biradical » et une augmentation correspondante de l’intensité des composantes monoradical RSER BA. Est la constante de vitesse observée de la réaction entre BA et RSER : kobs = 2,8 ± 0,2 M-1s-1 (T = 34 ° C, pH 7,2)11. Figure 7 illustre la cinétique du pic spectral monoradical intensité changement mesuré dans les tumeurs mammaires (●) et des glandes mammaires normales (o) à l’aide de la bande L EPR. Les lignes pleines sont les crises de la partie initiale de la cinétique de la monoexponent à l’aide de kobs = 2,8 M-1s-1 et rendement [BA] = 10,7 mM et 3,3 mM pour la tumeur et de la glande mammaire normale, respectivement.

Figure 7
Figure 7 . In vivo Évaluation des EPR des concentrations de glutathion intracellulaire tissus. (A) la bande X spectres rpe 100µm RSER mesurée à divers moments après incubation avec 2,5 mM GSH à 0,1 M Na-phosphate tampon, pH 7,2 et 1 mM DTPA à 34 ° C. L’analyse cinétique fournit la valeur de constante de vitesse observée de la réaction entre BA et RSER, kobs (pH 7,2, 34 ° C) = (2,8 ± 0,2) M-1 s-1. (B) la cinétique de la pic spectral monoradical l’intensité mesurée en bande L EPR dans les tumeurs mammaires (●) et de la glande mammaire normale (o) de souris FVB/N immédiatement après injection i.t. de RSER sonde (voir étape 3.3.2). Les lignes pleines sont les crises de la partie initiale de la cinétique de la monoexponent, en supposant que kobs (pH 7,2, 34 ° C) = 2,8 M-1s-1 et rendement [BA] = 10,7 mM et 3,3 mM pour la tumeur et de la glande mammaire normale, respectivement. Reproduit de référence11 avec la permission de John Wiley & Sons, Inc. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Multifonctionnel évaluation des tissus extracellulaires pH, p O 2 et Pi en utilisant la sonde espoir multifonctionnel :

La figure 8 illustre la sensibilité des paramètres spectres de la sonde espoir obtenue à l’aide de procédures d’étalonnage, décrites au chapitre 1.4.

Figure 8
Figure 8 . Évaluation multifonctionnelle du microenvironnement chimique à l’aide de la sonde espoir. (a) le régime d’équilibre dépend du pH entre deux États d’ionisation de la sonde. (b), à la bande L EPR spectre d’espoir. (c) The EPR linewidth de l’espoir est un marqueur de2 pO (précision, ≈ 1 mmHg ; p O gamme2 , 1-100 mmHg). (d), la fraction de protonée HOPE est un marqueur de pH compris entre 6 à 8.0 (précision : ± 0,05). (e) dépendance à l’égard du taux de change du proton (exprimée en mG) de l’espoir avec la concentration de phosphate inorganique (Pi) extraite de spectres simulation (précision : ± 0,1 mM, gamme, 0,1-20 mM) 12,18. Reproduit de référence8 avec la permission de Nature Publishing Group. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 9 illustre multifonctionnels mesures effectuées dans les glandes mammaires FVB/N type sauvage et chez les souris transgéniques TME de MMTV-PyMT, qui spontanément développent un cancer du sein et d’émulent tumorales humaines, mise en scène de20. Les valeurs moyennes des pO2 (50 ± 3 mmHg dans TME vs 58 ± 3 mmHg dans les tissus normaux) et pHe (6.99 ± 0,03 dans TME contre 7,1 ± 0,03 dans les tissus normaux) prennent en charge une apparence de régions hypoxiques et acides dans la tumeur. Les changements plus importants ont été observés dans la concentration de Pi interstitielle (1,8 ± 0,2 mM de TME contre 0,84 ± 0,07 mM dans les tissus normaux) indiquant un rôle potentiel de la concentration de Pi interstitiel comme marqueur TME de progression tumorale. Les différentes mesures obtenues montrent des variations importantes dans les valeurs moyennes. Un avantage important d’une sonde multifonctionnelle est que tous les paramètres sont mesurés à l’aide d’une seule sonde, donc permettant des analyses de corrélation indépendante de sonder la distribution et l’heure des mesures comme l’illustre la Figure 9 b- e. La corrélation positive observée entre pO2 et pHe dans la glande mammaire normale par rapport à l’absence de corrélation dans les tumeurs prend en charge la dépendance de tumeur glycolyse indépendante de la concentration d’oxygène ; à notre avis, c’est une démonstration dont témoigne en vivo de l’effet Warburg. À son tour, la corrélation négative observée entre interstitiel [Pi] et pO2 fois dans les tissus normaux et la tumeur est en accord avec l’association des hautes [Pi] (et faible ratio ATP/Pi) avec des changements dans le statut de bioénergétique à oxygène inférieur approvisionnement.

Figure 9
Figure 9 . In vivo tissu p O 2 pH e , évaluation de Pi en utilisant la sonde de l’espoir et l’EPR et. (un) photographie de la mise en place pour les mesures in vivo bande L EPR montre la souris anesthésiée entre les aimants du spectromètre RPE, avec l’encart sur la droite indiquant la mise en place et le positionnement du résonateur boucle sur le dessus de la tissu mesuré. Notez la localisation extracellulaire interstitielle de la sonde d’espoir : il ne pénètre pas dans les cellules en raison des structures chargées encombrants et le signal d’espoir dans le sang n’est pas détecté par l’EPR en raison de l’élargissement de signal par complexation d’espoir avec l’albumine plasmatique24 . (b–e) Corrélation entre interstitielle pO2, pHeet valeurs Pi mesurée dans normal des glandes mammaires de souris de type sauvage FVB/N et la TME du cancer du sein chez des souris transgéniques MMTV-PyMT (n = 23). Pour étendre la gamme de variations de l’oxygène, des conditions anoxiques dans l’espace interstitiel ont été établies par injection i.t. du système enzymatique consommatrices de glucose/glucose oxydase (symboles rouges). Les lignes bleues représentent un ajustement linéaire pour les ensembles de données totales. (b) une corrélation positive entre pO2 et pHe dans les tissus normaux (r = 0,5, p = 0,014 pour black symboles ; r = 0,64, p = 1,8 × 10-4 pour le jeu de données total) contre (c) non significatif corrélation entre pO2 et pHe dans TME (r = 0,01, p = 0,97 pour black symboles ; r = 0,23, p = 0,3 pour le jeu de données total) ont été trouvés. (d), un négatif de corrélation entre pO2 et Pi les deux dans les tissus normaux (r = −0, 51, p = 0,013 pour black symboles ; r = −0, 7, p = 2,3 × 10-5 pour l’ensemble de données total) et (e) dans TME (b, fond : r = −0, 4, p = 0,079 pour symboles noirs ; r = −0.62, p = 0,001 pour l’ensemble de données total) ont été trouvés. Adapté de référence8 avec permission de Nature Publishing Group. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les méthodes présentées permettent non invasif in vivo l’évaluation des paramètres critiques de la TME chimique, à savoir pO2, pH, statut redox et concentrations de Pi interstitielle et de GSH intracellulaire. Les techniques de résonance magnétique, tels que les IRM et champ faible EPR, sont les méthodes de choix non invasif in vivo par profilage de ces paramètres TME. MRI visualise les structures anatomiques mais manque de sensibilité fonctionnelle. Contrairement à l’IRM, les techniques de RPE fournissent Sensibilité fonctionnelle pour les paramètres les du microenvironnement lorsqu’il est utilisé en combinaison avec des sondes de spin fonctionnelle. À notre connaissance, il n’y a pas d’autres méthodes disponibles pour évaluer simultanément en vivo physiologiquement importants paramètres chimiques TME dans des sujets vivants, tels que pO2, pHe, Pi, oxydo-réduction et BA.

Les protocoles décrits sont basées sur l’utilisation de champ faible bande L EPR et spécialement les sondes paramagnétiques. Un ensemble de quatre sondes, présenté à la Figure 1 peut être considéré un test d’évaluation de TME efficace in vivo . Disponibilité des sondes est une condition importante pour les mesures des EPR décrit en vivo . La synthèse des sondes selon les procédures publiées11,12,13,15 a besoin de compétences en chimie organique synthétique et peut devenir une étape cruciale pour l’implémentation de la méthode .

Application de la sonde de particules permet des mesures répétées des tissus pO2 pour jusqu'à semaines après implantation14,21. Sondes solubles montrent la sensibilité d’un grand nombre des paramètres au-delà d’oxygène concentration25 et donner l’occasion aux mensurations spatiale résolue26. En particulier, une demande de la sonde espoir multifonctionnelle fournit une occasion inégalée pour in vivo des mesures simultanées de pH, pO2et Pi dans l’espace extracellulaire. Les mesures des trois paramètres à l’aide d’une seule sonde permet leur analyse de corrélation indépendante de distribution de la sonde et l’heure de la mesure8.

Les sondes ne peuvent pas être utilisés simultanément, à l’exception de la sonde de particules LiNc-BuO implantée, qui peut être utilisée en combinaison avec n’importe lequel des sondes solubles, comme le montre la Figure 6. Par conséquent, le protocole expérimental devrait reposer sur des mesures séparées d’injections individuelles de sondes solubles fonctionnelles spécifiques. Le pH extracellulaire hydrophile et sonde redox NR peuvent être fournis aussi bien par l’intermédiaire de i.t. injection11,14,26 et délivrance systémique27, tandis que deux autres sondes solubles, RSER et espoir, permettre la livraison de i.t. seulement 8 , 11 , 12 , 16. note que les futures modifications structurales du RSER et l’espoir des sondes peut surmonter la dernière limitation de livraison de la sonde par le développement d’analogues de sonde plus hydrophiles et moins toxiques pour délivrance systémique25.

Notez que cette modalité EPR spectroscopique fournit les valeurs moyennes des paramètres mesurés dans la TME, qui est souvent caractérisé par sa grande hétérogénéité. Partiellement, cela masque les différences potentielles entre les paramètres ou diminue l’importance dans l’analyse de corrélation. L’utilisation des sondes décrites dans les modalités d’imagerie permet d’obtention d’informations fonctionnelles résolue spatialement,26. Nous croyons que l’avenir de l’imagerie RPE multifonctionnel repose sur le développement des méthodes relativement nouvelles comme l’imagerie RPE balayage rapide et MRI Overhauser-amélioré (OMRI, aussi appelé proton-électron double-résonance, PEDRI). Les nouvelles orientations dans l’élaboration de fonctionnelle EPR sondes et les techniques avancées d’imagerie ont été récemment discutées dans l’article25correspondants de fonctionnalité.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été partiellement pris en charge par les NIH confèrent aux CA194013, CA192064 et U54GM104942. Le WVCTSI est reconnu pour le démarrage à VVK, AB et TDE. Les auteurs remercient Dr M. Gencheva et K. Steinberger pour l’aide avec les expériences illustratives. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-band EPR spectrometer Magnettech, Germany L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules
 Temperature & Gas Controller  Noxygen, Germany Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition  
Sonicator Fisher Scientific
GSH (L-Glutathione reduced) Sigma-Aldrich G4251
MMTV-PyMT  mice In house
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Met-1 murine breast cancer cells In house
C57Bl/6 wild type mice  Jackson Laboratory
Trypsin Thermo Fisher Scientific 25200056
Trypan Blue Exclusion Dye  Thermo Fisher Scientific T10282
Ohmeda Fluotec 3 
Isoflurane (IsoFlo) Abbott Laboratories
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic sigma-Aldrich S07051
Sodium Chloride sigma-Aldrich S7653
Hydrochloric acid sigma-Aldrich 320331
Sodium Hydroxide sigma-Aldrich S8045
Glucose sigma-Aldrich
Glucose oxydase sigma-Aldrich
Lauda Circulator E100 Lauda-Brikmann
pH meter Orion Thermo Scientific 
LiNc-BuO probe In house The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13
NR probe In house The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11
RSSR probe In house The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15
HOPE probe In house The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12

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References

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<em>In Vivo</em> Évaluation des EPR du pH, <em>p</em>O<sub>2</sub>, statut Redox et les Concentrations de Phosphate et de glutathion dans le microenvironnement tumoral
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