Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En simpel cellebaserede immunofluorescens Assay at opdage autoantistof mod N-Methyl-D-aspartat (NMDA) Receptor i blod

Published: January 9, 2018 doi: 10.3791/56676
Automatic Translation
1,2, 1
1Department of Psychiatry, Chang Gung Memorial Hospital-Linkou, 2Department and Graduate Institute of Biomedical Sciences, Chang Gung University

Summary

Vi udtrykte ectopically NR1 underenhed af NMDA-receptor markeret med grønt fluorescerende protein i humane embryonale celler (HEK293) som antigen til at opdage autoantistoffer mod NMDA receptor i blodet hos patienter mistænkt med autoimmun encephalitis. Denne enkle metode kan være egnet til screening i klinisk indstillinger.

Abstract

Tilstedeværelsen af anti-NMDA receptor autoantistof kan forårsage forskellige neuropsykiatriske symptomer hos de berørte patienter, kaldt anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis. Påvisning af specifikke autoantistof mod NMDA-receptor i blod eller cerebrospinalvæske (CSF) er afgørende for den præcise diagnose af denne betingelse. NMDA-receptor er en ion-kanal protein kompleks der indeholder fire underenheder, herunder to obligatoriske NMDA receptor subunit 1 (NR1) og en eller to NMDA-receptor subunit 2A (NR2A), NMDA receptor subunit 2B (NR2B), NMDA-receptor underenhed 2C (NR2C), eller NMDA receptor subunit 2D (NR2D). Epitop af anti-NMDA receptor autoantistof blev rapporteret til at være til stede i den ekstracellulære N-terminale domæne af NR1 subunit af NMDA-receptor. Målet med denne undersøgelse er at udvikle en enkel cellebaserede immunofluorescens assay, der kan bruges som en screeningstest til påvisning af forekomst af autoantistoffer mod NR1 underenhed af NMDA-receptor i blodet til at fremme den kliniske og grundlæggende forskning i anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis.

Introduction

Anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis er en nyligt anerkendt sygdom enhed, der kan forekomme hos patienter i alle aldre, og påvirker overvejende kvindelige patienter1,2. Det er en af de hyppigst diagnosticerede hjernebetændelse blandt patienter med indledende ukendt ætiologi af hjernebetændelse3. Patienter, der lider med anti-NMDA receptor encephalitis normalt har prodromale symptomer på en hovedpine eller feber, efterfulgt af en hurtig udvikling af bevidsthed niveau forandring og en række akutte neuropsykiatriske symptomer, herunder agitation, irritabilitet , angst, søvnløshed, hallucinationer, vrangforestillinger, aggression, bizar adfærd, bevægelse abnormaliteter, autonome dysregulering og beslaglæggelse angreb4,5. Tidlig erkendelse af denne betingelse og rettidig behandling med immunterapi er vigtige for et bedre resultat og endda fuld helbredelse i berørte patienter6. Det foreslås derfor, at anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis bør betragtes som en vigtig differentialdiagnose af patienter med akut eller ny-debut psykotiske træk7,8.

Udover kliniske funktioner er påvisning af autoantistof mod NMDA-receptor i blod eller CSF afgørende for den præcise diagnose af anti-NMDA receptor autoimmune encephalitis9. De fleste af de immunologiske tests for at påvise anti-NMDA receptor autoantistof er tilgængelige i et par forskning laboratorier10,11, og der er kun et kommercielt tilgængelige cellebaserede immunofluorescens assay for screening af anti-NMDA receptor autoantistoffer12. Målet med denne undersøgelse er at udvikle en enkel in-house cellebaserede immunofluorescens assay, der bekvemt kan bruges i laboratoriet til at screene tilstedeværelsen af anti-NMDA receptor autoantistoffer til at lette den kliniske forskning af anti-NMDA receptor autoimmun encephalitis. NMDA-receptor er en heterotetramer ion-kanal proteinkompleks især udtrykt i hjernen. Det er lavet af to obligatoriske NR1 underenheder, og kombinationen af en eller to underenheder af NR2A, NR2B, NR2C eller NR2D13. En tidligere undersøgelse rapporterede, at de vigtigste epitop målrettet af antistoffer var på domænet ekstracellulære N-terminalen af NR1 subunit5. Derfor, i denne protokol, vi udtrykke den menneskelige rekombinant NR1-subunit protein af NMDA-receptor markeret med grønt fluorescerende proteiner (NGL) i den menneskelige embryonale nyre epitelcelle linje (HEK293) og udvikle en celle-baserede immunofluorescens assay til påvisning IgG-klasse af anti-NMDA receptor autoantistoffer i blodet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Undersøgelsen blev godkendt af det institutionelle Review Board af Chang Gung Memorial Hospital på Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3).

1. forberedelse af NR1-normal god landbrugspraksis udtryk Plasmid

  1. Mix 10 ng af NR1-normal god landbrugspraksis plasmid med 100 µL af Escherichia coli kompetente celler stamme DH5α i en sterile 1,5 mL centrifugeres tube, afpipetteres blandingen forsigtigt op og ned 4 - 6 gange, og Inkuber røret på isen i 20 min.
  2. Inkuber tube på 42 ° C i 1 min i et vandbad, fjerne røret fra vandbadet, tilsæt 1 mL lysogeny bouillon (LB) medium i røret, og der inkuberes rør ved 37 ° C i en inkubator med ryster for 1 h.
  3. Spred 50 µL af blandingen på en LB-agar plade med ampicillin (0,1 mg/mL), og der inkuberes LB-agar plade ved 37 ° C i en inkubator natten over.
  4. Vælge en enkelt koloni fra den overnight LB agar plade ved hjælp af en steril tip, og slyng tip i en i en bakteriekultur rør der indeholder 5 mL af LB medium og ampicillin (0,1 mg/mL). Inkuber rør ved 37 ° C i en inkubator med ryster natten over.
  5. Alikvot 3 mL af overnight bakteriekulturen til en 500 mL målekolbe, der indeholder 250 mL sterilt LB medium og ampicillin (0,1 mg/mL). Inkuber i kolben ved 37 ° C under omrystning. Kontroller jævnligt optic massefylde (OD) af bakteriekulturen på bølgelængde på 600 nm ved hjælp af et spektrometer, indtil OD600 når 0,6-1,0.
    Bemærk: Bland godt 800 µL af overnight bakteriekulturen med 200 µL glycerol til at forberede glycerol lager, og lagre glycerol lager under-80 ° C til fremtidig brug.
  6. Forberede NR1-normal god landbrugspraksis udtryk plasmid fra 250 mL bakteriekulturen
    1. Indsamle cellerne ved centrifugering ved 6.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
    2. Bakterier resuspenderes i 10 mL resuspension buffer indeholdende RNase A; vortex grundigt indtil ingen klump er set.
    3. Tilføje 10 mL lysisbuffer til bakteriel suspension forsigtigt vendes blandingen 4 - 6 gange, og Inkuber den lysate ved stuetemperatur (RT) for 5 min.
    4. Tilsæt 10 mL pre kølet nedbør buffer til den lysate, forsigtigt vendes blandingen 4 - 6 gange.
    5. Hæld lysate i en filterpatron med fælles landbrugspolitik tønde på; vente 10 min på RT.
    6. Fjern hætten fra patron afgang dyse, indsætte en stemplet i patronen, og tryk forsigtigt på stemplet. Indsamle de filtrerede lysate ind i en 50 mL tube.
    7. Tilføje 2,5 mL proprietære buffer fra producenten til den filtrerede lysate, bland blandingen af invertere røret ca 10 gange, og der inkuberes blanding på is i 30 min.
    8. Anvende den filtrerede lysate blanding til en filterkolonne, der blev præ ekvilibreres med 10 mL ækvilibrering buffer. Tillade kolonnen for at dræne af tyngdekraften.
    9. Vaske kolonnen med 30 mL vaskebuffer to gange og derefter elueres DNA fra kolonnen ved hjælp af 15 mL eluering buffer.
    10. Tilføje 10,5 mL (0,7 diskenheder) isopropanol til eluted DNA-bufferen, bland godt og centrifugeres blandingen på 20.000 x g i 30 min. ved 4 ° C.
    11. Dekanteres omhyggeligt, vask DNA pellet med 5 mL endotoxin-fri 70% ethanol én gang, og der centrifugeres ved 20.000 x g i 10 min.
    12. Den dekanteres, tørre pellet for 5-10 min i en kemisk hætte og opløse pellet i 300-500 µL af endotoxin-fri buffer.
    13. Bestemme plasmid koncentrationen ved at måle absorptionen af løsning på UV-260/280 nm ved hjælp af et spektrofotometer.
      Bemærk: Forberede udtryk plasmid normal god landbrugspraksis ved hjælp af den samme protokol.

2. Transfektion af HEK293 celler med NR1-normal god landbrugspraksis udtryk Plasmid

  1. Alikvot 200 µL af 2% gelatine løsning til hver godt af en 48-godt kultur plade og inkuberes plade ved 37 ° C i mindst 30 min.
  2. Opsug den gelatine løsning fra godt og frø 5 x 104 HEK293 celler i 200 µL af cellekulturmedium indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS) i hver brønd. Inkuber plade ved 37 ° C i en fugtig inkubator leveres med 5% CO2 natten over.
    Bemærk: Celler blev talt ved hjælp af en hemocytometer.
  3. Den næste dag, erstatte brugt næringssubstratet med 200 µL af frisk næringssubstratet indeholdende 10% FBS pr. brønd.
  4. For hver enkelt godt, forberede opløsning A ved blanding af 100 ng af NR1-tGFP plasmid med 20 µL næringssubstratet og løsning B ved at blande 0,8 µL Transfektion reagens med 20 µL næringssubstratet. Multiplicer antallet af brønde skulle forberede den samlede mængde for hvert forsøg.
  5. Forberede løsning C ved blanding af opløsning A og løsning B, og Inkuber blanding på RT for 20-30 min.
  6. Alikvot 40 µL opløsning C til hver godt med HEK293 cellerne, swirl pladen forsigtigt, og der inkuberes plade ved 37 ° C i en fugtig inkubator leveres med 5% CO2 natten over.
  7. Kontrollere udtryk for NR1-normal god landbrugspraksis rekombinante proteiner i værtsceller under fluorescerende mikroskop med 40 X-200 X forstørrelse (excitation/emission: 482/502 nm), og Fortsæt til celle-baserede immunofluorescens assay.
    Bemærk: Transfect udtryk plasmid normal god landbrugspraksis i de HEK293 celler ved hjælp af den samme protokol.

3. celle-baserede immunofluorescens Assay

  1. Opsug den brugte medium fra brøndene, så vask hver brønd med 200 µL af phosphat bufferet saltvand (PBS), tre gange.
  2. Tilføje 200 µL af 4% PARAFORMALDEHYD løsning til hver brønd; Inkuber plade på RT for 15 min.
  3. Opsug PARAFORMALDEHYD løsningen fra brøndene, og vaskes hver godt med 200 µL af PBS tre gange.
  4. Tilføje 200 µL af 10% skummetmælk i PBST (0,1% Tween-20 i PBS) løsning til hver godt og Inkuber plade på RT for 1 h med blid ryster.
  5. Opsug 10% skummetmælk i PBST løsning fra brønden, så vask brønde med 200 µL PBST én gang.
  6. Inkubér brøndene med fortyndet plasma (1: 100 i PBST) som den primære antistof med blid ryster på RT for 1 h.
    Bemærk: Plasma fremstilles af blod fra patienter mistænkt for at have autoimmune encephalitis.
  7. Opsug den fortyndede plasma fra brøndene, og vaskes hver godt med 200 µL af PBST tre gange.
  8. Tilføje 200 µL af gede-anti-humant IgG konjugeret med Alexa Fluor 594 (1:1, 000 fortynding i PBST) til hver brønd og Inkuber kultur pladen på RT med blid ryster for 1 h.
  9. Opsug det ged-anti-humant IgG konjugeret med Alexa Fluor 594 løsning, og vaskes hver godt med 200 µL af PBST tre gange.
  10. Tilsæt 100 µL glycerol løsning (50% glycerol i PBS og 1:100,000 af 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) til hver brønd.
  11. Observere og billed celler under en fluorescerende mikroskop ved hjælp af en 10 X okular, og 4 X, 10 X og 20 X mål.
    Bemærk: Brug den korrekte filter for hver farvestof: for NR1-normal god landbrugspraksis (excitation/emission = 482/502 nm), for Alexa Fluor 594 (excitation/emission = 561/594 nm), for DAPI (excitation/emission = 358/461 nm). Gennemføre den negative kontrol bruge de HEK celler udtryk for normal god landbrugspraksis på samme måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I gennemsnit kunne vi få 200-300 µg endotoxin-fri udtryk plasmid NR1-normal god landbrugspraksis og normal god landbrugspraksis fra 250 mL bakteriekulturen efter procedurerne i afsnit 1 i protokollen. Et beløb på 100 ng/brønd af udtryk plasmid blev brugt til Transfektion af HEK293 celler dyrkes i 48-godt plade som beskrevet i punkt 2 i protokollen. 24-30 h efter Transfektion, cellerne udtrykt NR1-normal god landbrugspraksis, og normal god landbrugspraksis rekombinante proteiner kunne påvises under mikroskop for fluorescerende. Figur 1A viser billedet af de værtsceller der udtrykker NR1-normal god landbrugspraksis, mens figur 1 d viser de celler, der udtrykker normal god landbrugspraksis. Det grønne signal kan bruges som en kvalitetssikring af analysen: ca. 30% af cellerne havde de grønne signaler under fluorescerende mikroskop. Figur 1A og 1 D viser billedet af de værtsceller der udtrykker NR1-normal god landbrugspraksis. Det grønne signal kan bruges som en kvalitetssikring af analysen: ca. 30% af cellerne havde de grønne signaler under fluorescerende mikroskop. De celler, der udtrykker NR1-normal god landbrugspraksis blev anvendt til screening tilstedeværelsen af anti-NMDA receptor autoantistoffer i humant plasma-prøve.

I celle-baserede immunofluorescens analysen som beskrevet i punkt 3 i protokollen, positivt kontrol prøve (fremstillet af en kommerciel kilde, se Tabel af materialer) blev føjet til de poolede plasma i 1:10 fortynding i henhold til den producentens anvisninger. Poolede plasma blev udarbejdet fra 5 voksne hanner og 5 voksne hunner. Figur 1B er Alexa Fluor-594 billedet af positive kontrolprøve efter inkubering med celler udtryk NR1-normal god landbrugspraksis, mens figur 1E er Alexa Fluor-594 billedet af positive kontrolprøve efter inkubering med celler udtryk normal god landbrugspraksis. Figur 1 c er det flettede billede af figur 1A og figur 1B: der er væsentlig overlapning af grønne signaler og røde signaler i samme celle, der angiver Co lokaliseringen af NR1-normal god landbrugspraksis og antistoffer mod NR1 underenhed af NMDA receptor (pile). En plasmaprøve, der viser mere end 30% overlapninger af grønne og røde signaler vil blive fortolket som positive i dette tilfælde. Figur 1F er det flettede billede fra figur 1 d og figur 1E , der fungerer som den negative kontrol for figur 1 c. Den svage røde farve er baggrunden fluorescens af Alexa Fluor-594 billede. Der er lille overlapning af grønne og røde signaler, der angiver ingen binding af anti-NMDA receptor autoantistof mod den rekombinante proteiner.

Under oprettelsen af de eksperimentelle procedurer observeret vi et lavt signal / støj forholdet mellem Alexa Fluor-594 billede når plasmaprøver blev testet. Vi forsøgte at optimere signal / støj-forhold ved at foretage en seriel fortynding af plasma form 1:10, 1:50, 1: 100, og 1:200, og teste forskellige koncentrationer af Alex Fluor-594 mærket sekundær antistof fra 1: 500 til 1:2, 000. Vi fandt denne 1: 100 fortynding af plasma og 1:1,000 eller 1:2,000 fortyndingen af Alexa Fluor-594 var de optimale betingelser for fortolkning af data.

Figure 1
Figur 1: repræsentative billeder af celle-baseret immunofluorescens analysen at opdage anti-NMDA receptor autoantistof. (A) billede af de HEK293 celler, der udtrykker NR1-normal god landbrugspraksis. (B) den Alexa Fluor-594 billede taget fra det samme felt a efter inkubation med positive kontrolprøve. Røde signal angiver binding af anti-NMDA receptor autoantistoffer til NR1 udtrykt i HEK293 celler. (C) det flettede billede af A og B. Gule farve indikerer Co lokaliseringen af NR1 (grønne signal) og anti-NMDA receptor autoantistoffer (rødt signal). Pilene angiver eksempler på nogle fremtrædende celler viser Co lokalisering af NR1-normal god landbrugspraksis og anti-NMDA receptor autoantistoffer. (D) billede af HEK293 celler udtrykker NR1-NGL. (E) den Alexa Fluor-594 billede taget fra det samme felt i D efter inkubation med positive kontrolprøve. Svag rød signal angiver baggrundsstøj af Alexa Fluor-594 billede. (F) det flettede billede af D og E. Dette billede fungerer som en negativ kontrol, da der er lidt gul signal observeret. Negativ kontrol billede viser den specifikke binding af anti-NMDA receptor antistoffer til NR1-normal god landbrugspraksis i analysen. Alle billeder blev taget under 10 X eye linse og 20 X linse mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er flere cellebaserede immunologiske assays til skærmen forekomst af autoantistoffer mod NMDA receptor rapporteret i litteraturen, herunder levende celle-baserede immunofluorescens assay11, fast cellebaserede immunofluorescens assay9 , og flow flowcytometri-baserede assay14. Den levende celle-baserede immunofluorescens assay bør udføres kort efter udarbejdelsen af celler, der ectopically udtrykker NR1 protein, mens strømmen flowcytometri-baserede analyse kræver uddannet personale og specialudstyr. En fast cellebaserede immunofluorescens assay er en mere bekvem assay, der kan gennemføres for kliniske indstillinger. Derfor, mange undersøgelser anvendes kommercielt indirekte fast cellebaserede immunofluorescens assay til skærmen anti-NMDA receptor autoantistof i serum og CSF enheder12,15. Den kit anvendte (se tabellen af materialer) indeholder de faste HEK293 celler, der ectopically udtrykker den rekombinante NR1 underenhed af NMDA-receptor. Analysen er blevet evalueret for at få fremragende ydeevne til at opdage anti-NMDA receptor IgG antistof i serum og CSF enheder12. I vores protokol brugte vi den samme tilgang som anbefalet af kit producent, bortset fra at vi bruger NR1-normal god landbrugspraksis udtryk plasmid. NR1-normal god landbrugspraksis protein kan bruges til at overvåge Transfektion effektivitet og distribution af NR1 protein i hvert forsøg. Det kan derfor bruges som en kvalitetssikring af analysen.

Transfektion effektivitet NR1-normal god landbrugspraksis udtryk plasmid i HEK293 celler er ca 30% i den protokol, der præsenteres her, hvilket er tilstrækkeligt for immunofluorescens assay. Men vi fandt at intensiteten af den grønne fluorescens ikke er jævnt fordelt blandt de transfected celler, tyder på forskelle i effektivitet af Transfektion eller udtryk mulighed for individuelle celler. De varierende udtryk niveauer af rekombinant NR1-normal god landbrugspraksis i forskellige celler forårsage heterogene intensitet, når den grønne image blev fusioneret med den røde image i Alexa Fluor 594. Det gede-anti-humant IgG konjugeret med Alexa Fluor 594 blev brugt som sekundær antistof til påvisning af tilstedeværelsen af menneskelige autoantistof IgG klasse. Vi fandt, at lysstyrken af Alexa Fluor 594 er relativt svagere end den grønne fluorescerende proteiner. Vi forsøgte at optimere signalet intensitet ved at øge koncentrationen af anti-human IgG konjugeret med Alex Fluor 594, men baggrunden steg så godt. Derfor, den optimale koncentration af anti-human IgG konjugeret med Alex Fluor 594 er 1:1,000 i dette laboratorium. Også, nogle plasmaprøver havde en markant høj baggrund signal i Alexa Fluor 594 billede. Forskellige fortyndinger af plasma blev testet, og det konstateredes, at en minimal fortynding på 1: 100 er nødvendig for at opnå en ren baggrund for de fleste af prøverne. Dermed, vi anbefaler 1: 100 fortynding af plasma som standard skridt i denne protokol. Sammenlignet med de andre celle-baserede assays, der kan registrere serumprøven i 1:10 og 1:20 fortynding af blod prøve11,16, har denne aktuelle protokol ikke tilstrækkelig følsomhed til at opdage lav titer anti-NMDA receptor autoantistoffer, der er en begrænsning af protokollen.

Den nuværende protokol er en fast cellebaserede immunofluorescens assay. Kultur plade kan gemmes i 4 ° C køleskab efter fiksering til senere brug i op til 1 måned, i forhold til den levende celle-baserede analyse, der ikke kan opbevares i lang tid. Men NR1 protein vil denatureres og mister sin naturlige kropsbygning under proceduren fiksation, som kan påvirke kropsbygning af de epitop, der binder sig til anti-NMDA receptor autoantistoffer. Dermed, nogle undersøgelser vedtog levende celle-baserede immunofluorescene11,17. Vores protokol kan alternativt modificeret til at blive en levende celle-baserede immunofluorescens assay at bevare den naturlige kropsbygning NR1 protein, hvis vi Inkuber plasmaprøve med levende celler først, og fastsætte cellerne senere. Der er således fleksibilitet i protokollen til opfylder behovet i eksperimentet.

NMDA-receptor er en heterotetramer komplekse protein bestående af NR1, NR2A, NR2B, NR2C og NR2D. Den nuværende protokol var designet til at opdage autoantistof mod NR1 underenhed af NMDA-receptor IgG-klasse. Protokollen kan også ændres for at opdage forskellige isotypes af autoantistoffer, så længe-anti-humant IgG sekundære antistoffer er erstattet af andre specifikke klassen med sekundære antistoffer. Desuden kan den nuværende protokol ændres til paavisning af autoantistoffer mod NR2A, NR2B, NR2C og NR2D, hvis NR1-normal god landbrugspraksis udtryk plasmid er erstattet med den tilsvarende udtryk plasmid, henholdsvis.

I denne protokol brugte vi en plasma-modellen i stedet for serum, fordi vi rutinemæssigt indsamler blodprøve med antikoagulerende henblik på forskellige studier, men protokollen kan anvende til serum eller CSF prøver. Titer af autoantistoffer i plasma kan kvantificeres ved seriel fortynding af prøven. I laboratoriet testede vi også afrikanske green monkey nyre fibroblast-lignende cellelinje (COS1) som værtsceller ved hjælp af den samme protokol. Resultaterne er de samme som dem, der bruger HEK293 cellerne, bortset fra at COS1 cellerne har en lidt lavere Transfektion effektivitet end HEK293 cellerne.

For at fastslå tilstedeværelsen af anti-NMDA receptor autoantistoffer, foreslås det, at yderligere eksperimenter såsom Immunhistokemi assay ved hjælp af gnaver hjernen væv og immuncytokemi ved hjælp af primære kulturperler gnaver neuroner være udført5 ,9. Den nuværende protokol kan derfor kun betragtes som en screening assay. Selv om sine eksperimenterende gyldighed blev kontrolleret ved hjælp af positive kontrolprøve i denne undersøgelse, følsomheden og specificitet af denne analyse i klinisk indstillinger skal være etableret i fremtiden undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Chang Gung medicinsk Foundation (grant nummer CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 og CMRPG3E0633).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 Origene (Rockville, MD, USA) RG219368 NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences
pCMV6-AC-GFP Origene (Rockville, MD, USA) PS100010 mammalian vector with C-terminal tGFP tag
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen (Hilden Germany) 12362
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 11668-019
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher 31985-070
DMEM, High Glucose, Pyruvate Thermo Fisher 11995-065
Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin GE Healthcare Life Sciences SH30071.01
Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher A-11014
Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) Euroimmun AG, Lübeck, Germany CA 112d-0101
Euroimmun Assay Kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
  2. Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
  3. Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
  4. Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
  5. Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
  6. Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
  7. Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
  8. Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
  9. Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
  10. Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
  11. Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
  12. Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
  13. Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
  14. Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
  15. Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
  16. Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
  17. Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).

Tags

Neurovidenskab sag 131 Anti-NMDA receptor autoantistof NR1 subunit grøn fluorescerende proteiner autoimmune encephalitis celle-baserede immunofluorescens assay differentialdiagnosticering neuropsykiatriske symptomer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. H., Chang, Y. S. A Simple… More

Chen, C. H., Chang, Y. S. A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood. J. Vis. Exp. (131), e56676, doi:10.3791/56676 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter