Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Resumo

O presente estudo descreve um método simples de detectar níveis endógenos de fosforilação de Rab10 pela rica em leucina repetição quinase 2.

Resumo

Mutações no rico em leucina repetição quinase 2 (LRRK2) foram mostradas para ser associada com a doença de Parkinson familiar (FPD). Como ativação anormal da atividade da quinase de LRRK2 tem sido implicada na patogênese da DP, é essencial estabelecer um método para avaliar os níveis fisiológicos da atividade da quinase de LRRK2. Estudos recentes revelaram que LRRK2 fosforila membros da família Rab GTPase, incluindo Rab10, sob condições fisiológicas. Embora a fosforilação de Rab10 endógeno por LRRK2 em pilhas cultivadas pode ser detectada por espectrometria de massa, tem sido difícil detectá-lo pelo immunoblotting devido à sensibilidade pobre de anticorpos de fosforilação específicos disponíveis atualmente para Rab10. Aqui, descrevemos um simples método de detectar os níveis endógenos de fosforilação de Rab10 por LRRK2 baseado na immunoblotting utilizando sódio Dodecil sulfato poliacrilamida electroforese do gel (SDS-PAGE) combinado com uma marca de ligação de fosfato (P-tag), que é N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N «,N «- tris (piridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. O presente protocolo não só fornece um exemplo da metodologia utilizando a tag-P, mas também permite a avaliação de como mutações, bem como inibidor de tratamento/administração ou quaisquer outros fatores alteram a sinalização a jusante de LRRK2 em células e tecidos .

Introdução

PD é uma das mais comuns doenças neurodegenerativas, predominantemente, afetando os neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo, resultando em disfunção dos sistemas de motor em idosos¹. Enquanto a maioria dos pacientes desenvolvem PD de forma esporádica, há famílias herdar a doença. Mutações em vários genes foram encontradas para ser ligado com FPD². Um dos genes causadores de FPD é LRRK2, em que oito mutações missense (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S e I2020T), ligadas a um FPD predominantemente hereditária chamada PARK8 até agora têm sido relatados^3,4,5. Vários estudos de associação de genoma-larga (GWAS) de pacientes com DP esporádicos também identificaram variações genômicas no locus LRRK2 como um fator de risco para a polícia, sugerindo que a anormalidade na função do LRRK2 é uma causa comum de neurodegeneração em ambos os casos esporádicos e PARK8 FPD^6,7,8.

LRRK2 é uma proteína grande (2.527 aminoácidos), consistindo de um domínio de repetição rico em leucina, um Ras-GTP-vinculação do domínio de proteínas complexas (ROC), um C-terminal do domínio, um domínio da quinase serina/treonina proteína e um domínio de WD40⁹ROC (CR). As oito mutações FPD localizar estes domínios funcionais; N1437H e R1441C/G/H/S no domínio do ROC, Y1699C no domínio do CR, G2019S e I2020T no domínio de cinase. Desde que a mutação G2019S, que é o mais frequentemente encontrada mutação em PD pacientes^10,11,12, aumenta a atividade da quinase de LRRK2 por 2-3 vezes em vitro¹³, supor que o aumento anormal da fosforilação de LRRK2 substrate(s) é tóxico para os neurônios. No entanto, tem sido impossível estudar se a fosforilação de substratos LRRK2 fisiologicamente relevantes é alterada em pacientes com DP familiar/esporádicas devido à falta de métodos para avaliá-lo em amostras derivadas de pacientes.

Fosforilação de proteínas é geralmente detectada pelo immunoblotting ou ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando anticorpos especificamente, reconhecendo o estado fosforilado de proteínas ou por análise de espectrometria de massa. No entanto, a estratégia anterior às vezes não pode ser aplicada devido às dificuldades em criar anticorpos específicos de fosforilação. Etiquetando metabólica das células com fosfato radioativo é outra opção para examinar os níveis fisiológicos de fosforilação quando anticorpos específicos fosforilação não estão prontamente disponíveis. No entanto, ele requer uma grande quantidade de materiais radioativos e, portanto, envolve alguns equipamentos especializados para protecção contra as radiações¹⁴. Análise de espectrometria de massa é mais sensível em relação a esses métodos imunoquímicos e tornou-se popular na análise de fosforilação de proteínas. No entanto, a preparação da amostra é demorada e caros instrumentos são necessários para a análise.

Um subconjunto da família Rab GTPase, incluindo Rab10 e Rab8 foi relatado recentemente como substratos fisiológicos diretos para LRRK2 com base no resultado de uma análise de phosphoproteomic em grande escala¹⁵. Em seguida demonstramos que a fosforilação de Rab10 foi aumentada por mutações FPD em fibroblastos embrionários de rato e nos pulmões de ratos¹⁶de knockin. Neste relatório, nós escolhemos a empregar uma eletroforese em gel de poliacrilamida sódio Dodecil sulfato (SDS-PAGE)-método em que uma molécula de P-marca é co polimerizada em geles de SDS-PAGE (P-marca SDS-PAGE) para detectar os níveis endógenos de fosforilação de Rab10, baseado em Porque um altamente sensível anticorpos específicos Rab10 fosforilada ainda estava faltando. Nós não conseguiram detectar a fosforilação de endógena Rab8 devido a seletividade pobre de anticorpos disponíveis atualmente para Rab8 total. Por isso, decidimos focar a fosforilação de Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 em Thr73 localizar no meio da região altamente conservadas "alternar II". Alta conservação dos sítios entre proteínas Rab fosforilação pode ser uma das razões por que os anticorpos phosphospecific reconhecer proteínas Rab distintas são difíceis de fazer.

A fosforilação de Rab8A por LRRK2 inibe a ligação do Rabin8, um fator da troca do nucleotídeo guanina (GEF) que ativa Rab8A trocando o PIB ligado com GTP¹⁵. A fosforilação de Rab10 e Rab8A por LRRK2 também inibe a ligação dos inibidores de PIB-dissociação (GDIs), que são essenciais para a ativação de proteínas Rab extraindo as proteínas Rab ligados a PIB de membranas¹⁵. Coletivamente, supor que a fosforilação de proteínas Rab por LRRK2 impede que a ativação embora o mecanismo molecular preciso e consequências fisiológicas da fosforilação permanecem obscuros.

P-marca SDS-PAGE foi inventado por Kinoshita et al em 2006: neste método, acrilamida covalentemente foi acoplada com P-tag, uma molécula capturando fosfatos com alta afinidade, que copolymerized em SDS-PAGE geles¹⁷. Porque as moléculas de P-etiqueta em um gel de SDS-PAGE seletivamente retardam mobilidade eletroforética de proteínas fosforiladas, P-marca SDS-PAGE pode separar proteínas fosforiladas aqueles não-fosforilada (Figura 1). Se a proteína de interesse é fosforilado em múltiplos resíduos, uma escada de bandas correspondentes às formas diferencialmente fosforiladas será observada. No caso de Rab10, observamos apenas uma banda deslocada, indicando que o Rab10 é phosphorylated apenas em Thr73. A grande vantagem de P-marca SDS-PAGE sobre immunoblotting com anticorpos específicos fosforilação é que Rab10 fosforilada pode ser detectado pelo immunoblotting com anticorpos de fosforilação específico (ou seja, reconhecendo Rab10 total) após ser transferido nas membranas, que é geralmente mais específica, sensível e disponível de fontes comerciais/acadêmico. Outra vantagem de usar P-marca SDS-PAGE é que um pode obter a estimativa aproximada da estequiometria da fosforilação, que é impossível pelo immunoblotting com anticorpos específicos fosforilação ou através da marcação metabólica das células com radioativo fosfatos.

Aparte o uso de barato P-marca acrilamida e algumas pequenas modificações relacionadas a ela, o presente método de detecção de fosforilação de Rab10 por LRRK2 segue um protocolo geral de immunoblotting.Portanto, deve ser simples e facilmente executável em alguns laboratórios onde immunoblotting é uma prática usual, com todos os tipos de amostras, incluindo proteínas purified, lisados celulares e tecido homogenates.

Protocolo

1. amostra preparação para o P-marca SDS-PAGE

1. Remover e descartar os meios de comunicação de pratos de 10 cm na qual as células são cultivadas usando uma sucção lavar as células com fosfato salino de 5ml Dulbecco (DPBS) pelo primeiro DPBS adicionando ao lado dos pratos, para evitar perturbar a camada de células e agitar manualmente os pratos de volta e para trás várias vezes.
2. Remover e descartar o DPBS usando uma sucção adicionar 2 mL de tripsina 0,25% (p/v), diluída em DPBS e agitar suavemente os pratos para cobrir a camada de células. Colocar os pratos em uma incubadora₂ CO (37 ° C, ar umidificado, 5% CO₂) por 5 min.
3. Depois de pipetagem acima e para baixo usando uma pipeta descartável para quebrar células isoladas, coletar a suspensão de células em um tubo de 15 mL e medir a densidade de células usando um hematocytometer sob um microscópio,¹⁸.
4. Dilua as células de 2,5 × 10⁵ células/mL com meio modificado de águia de Dulbecco (DMEM) suplementadas com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL. Adicione 2 mL (5 × 10⁵ células) de suspensão de célula diluídos a cada poço de placas boas 6.
5. Crescem as células durante a noite em uma incubadora de CO₂ (37 ° C, ar umidificado, 5% CO₂).
6. Transfection em células HEK293
   Nota: Se a fosforilação de Rab10 endógeno é a ser examinado, vá para etapa 1.7. Plasmídeos utilizados neste protocolo podem ser obtidos dos autores mediante pedido. Consulte Tabela de materiais para breve informação e Figura S1 para seu DNA sequências.
   1. Alíquota 200 µ l de DMEM para tubos de 1,5 mL.
   2. A cada tubo, adicione ambos 0.266 µ g (concentração final de 1,33 g/mL) de um plasmídeo codificação HA-Rab10 e 1.066 µ g (concentração final de 5.33 µ g/mL) de um plasmídeo codificação 3 × bandeira-LRRK2 de 500 ações de plasmídeo µ g/mL. Em seguida, adicione 4 µ l da solução de 1 mg/mL de polyethyleneimine (dissolvido em 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.0) e misture a solução vortexing para 5 s.
   3. Deixe os tubos ficar à temperatura ambiente durante 10 minutos e adicione o conteúdo de um tubo gota a gota para um bem utilizando uma micropipeta. Suavemente e manualmente de rock as placas de cultura e para trás várias vezes para deixar a mistura de transfeccao difusa uniformemente em todo o poço.
7. Deixe que as células crescem para outro 24-36 h numa incubadora de CO₂ (37 ° C, ar umidificado, 5% CO₂).
8. Se a fosforilação de Rab10 endógeno é a ser examinado, trate células com e sem inibidores de LRRK2 para 1 h antes de lise de células.
   1. Prepare soluções estoque de inibidores LRRK2, dissolvendo os inibidores em dimetilsulfóxido (DMSO) em 10 milímetros. Nós recomendamos usar MLi-2 e GSK2578215A, que são altamente específicos e potentes inibidores da LRRK2. Soluções conservadas em estoque de loja a-80 ° C.
   2. Preparar acções de trabalho dos inibidores diluindo as soluções estoque com DMSO: para MLi-2, prepare-se 10 µM e 30 µM para endógena e Blumental LRRK2, respectivamente. Para GSK2578215A, prepare-se 1 mM e 3 mM para endógena e Blumental LRRK2, respectivamente.
   3. Adicionar 2 µ l das existências do MLi-2 ou GSK2578215A trabalhar no meio de um bem, utilizando uma micropipeta e suavemente rock a placa manualmente para frente e para trás várias vezes para deixar os inibidores difusa uniformemente em todo o poço.
   4. Adicione 2 µ l de DMSO para um bem diferente como um controle negativo de forma semelhante ao inibidor na etapa 1.8.3.
   5. Colocar as placas para a incubadora e cultura das células por 1h.
9. Lise as células.
   1. Coloque as placas de cultura no gelo. Remova e descarte a mídia. Lave as células primeiro adicionando 2 ml DPBS ao lado dos pratos para não comprometer a célula da camada e agitar manualmente os pratos e para trás várias vezes.
   2. Remover e descartar o DPBS e adicionar as células 100 µ l da lise (pH 50 mM Tris-HCl 7.5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) octilfenil éter, 1mm EGTA (glicol de etileno-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-ácido etilenodiaminotetracético), ortovanadato de sódio de 1 mM, 50 mM fluoreto de sódio, β-glicerofosfato de 10mm, pirofosfato de sódio de 5 mM, 0,1 µ g/mL microcistina-LR, 270 mM de sacarose, coquetel de inibidor de protease).
   3. Incline as placas no gelo e raspe as células com uma espátula de célula para reunir tanto celular lisado quanto possível. Recolha os lysates utilizando uma micropipeta para tubos de 1,5 mL (pré-refrigerados no gelo).
      Atenção: Microcistina-LR pode ser fatal se ingerido ou em contato com a pele.
10. Deixe os tubos no gelo por 10 min para lise completa. Esclarecer os lisados celulares por centrifugação (20.000 × g, 10 min a 4 ° C) e transferir os sobrenadantes para novos tubos de 1,5 mL previamente refrigerados no gelo.
11. Medir a concentração de proteína (µ g / µ l) dos lysates apuradas pelo ensaio de Bradford.
    1. Preparar a albumina de soro bovino padrões (BSA) (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1 mg/mL) diluindo a solução com água destilada. Diluir os lysates célula desmarcada por 20 vezes com água destilada.
    2. Colocar 5 µ l/poço de cada célula diluída, em branco (água destilada) e os padrões de BSA lisado em uma placa de 96 poços em triplicado.
    3. Adicionar 150 µ l/poço do reagente Bradford ensaio usando micropipeta 12 canais e deixar a placa à temperatura ambiente por 5 min.
    4. Medir a absorvância em 595 nm em um leitor de placas e comparar com padrões de BSA.
12. Prepare-se 100 µ l de amostras para SDS-PAGE. A concentração de proteína das amostras é de 1 µ g / µ l para Blumental HA-Rab10 e 2 µ g / µ l para Rab10 endógena.
    1. Usando as concentrações quantificadas da etapa 1.11.4, calcular o volume (µ l) dos lisados celulares equivalentes a 100 µ g (Blumental HA-Rab10) ou 200 µ g (Rab10 endógenos), dividindo a quantidade de proteína (100 µ g ou 200 µ g) pela concentração de proteína de lisados (µ µ g/l).
    2. Adicione 25 µ l de tampão de amostra SDS-PAGE do 4 × Laemmli (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8% (p/v) SDS, 40% (v/v) glicerol, azul de bromofenol 0,02% (p/v), 4% (v/v) β-Mercaptoetanol) para novos tubos de 1,5 mL, mantidos em temperatura ambiente.
    3. Adicionar o volume calculado da célula lysates a cada tubo e misture por num Vortex para 5 s à temperatura ambiente.
    4. Trazer o volume total de 100 µ l com a Lise e a mistura vortexing por 5 s à temperatura ambiente.
13. Suplemento com 10mm MnCl₂ para saciar o agente quelante. Adicione 1 µ l de 500mm MnCl₂. Mix vortexing para 5 s à temperatura ambiente.
    Nota: As amostras que contêm MnCl₂ podem não ser adequadas para SDS-PAGE normal.

Esta etapa é necessária devido à presença do agente quelante (tais como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), EGTA, etc.) na Lise. Caso contrário, Mn^{2 +} íons acopladas a acrilamida P-marca serão dissociadas pelos agentes quelantes, e P-marca SDS-PAGE não funcionará corretamente.

Ferver todas as amostras a 100 ° C por 5 min e armazenar as amostras abaixo de-20 ° C até o uso. As amostras cozidas podem ser armazenadas até pelo menos 6 meses.

2. fundição géis para P-marca SDS-PAGE

Nota: O gel deve ser feita no mesmo dia como correr os géis. Gel pode ser feita sob condições de luz ambiente.

1. Preparar solução de acrilamida 5mm P-marca dissolvendo a 10 mg de pó/sólido P-marca do acrilamido completamente com 100 µ l de metanol e depois trazer a 3,3 mL adicionando água bidestilada.
   Nota: P-marca acrilamida é sensível à luz. A solução preparada deve ser armazenada no escuro a 4 ° C até o uso.
2. Limpeza simples e entalhadas placas etanol a 70% de pulverização e limpando com uma toalha de papel. Monte as placas de gel. As dimensões das placas de gel usadas neste protocolo particular são 80 ou 100 mm de comprimento por 100 mm de largura. Silicone limpa espaçadores colocados entre a planície e entalhadas chapas e as chapas montadas são presas com grampos da pasta.
   Nota: Pode ser usado qualquer tipo de placas de gel que trabalham para SDS-PAGE ordinário.
3. Colocar um pente ser usado (17-bem plastico) em placas de gel montado e marca na posição de fundo dos poços da placa de gel com um marcador permanente.
4. Prepare-se 10 mL da mistura de gel de acrilamida 10% (10% (p/v) de acrilamida (acrylamide:bis-acrilamida = 29:1), 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% (p/v) SDS) em um tubo de 15 mL.
   Nota: A concentração ideal de acrilamida pode variar consoante os reagentes utilizados. Tempted (TEMED) e amônio persulfato (APS) não deve ser adicionado neste ponto.
5. Adicione 100 µ l de acrilamida P-marca de 5 mM e 10 µ l de 1m MnCl₂ soluções em concentrações finais de 50 µM e 100 µM, respectivamente.
   Nota: As concentrações ideais dos P-marca acrilamida e MnCl₂ também podem variar dependendo os reagentes utilizados.
6. Adicione 15 µ l de TEMED para a mistura de gel em uma concentração final de 0,15% (v/v) e depois de 50 µ l de 10% (p/v) APS em uma concentração final de 0,05% (p/v). Misturar bem agitando suavemente o tubo para 5 s e despeje nas placas montadas imediatamente até uma altura que é de 2 mm abaixo da posição marcada na etapa 2.3.
7. Suavemente a camada para a solução de gel para achatar a parte superior do gel de separação de 2-propanol.
8. Deixe o gel descansar por 30 min à temperatura ambiente. Não é necessário proteger os géis de luz.
   Nota: Pode levar mais tempo para géis definir sob temperatura ambiente fria. A mistura de gel de desgasificação antes de adicionar TEMED e APS ajuda a acelerar a esta etapa. Para este efeito, a mistura de gel pode ser preparada em um Erlenmeyer de 100-200 mL, conectado a um sistema de sucção. Desgaseifica a solução durante 10 minutos.
9. Remova o 2-propanol em camadas absorventes com uma toalha de papel.
10. Lavar o espaço superior a géis preenchendo o espaço com água destilada de um frasco de lavagem e descarte a água derramando fora em bacia. Repeti 3 vezes de lavagem.
11. Remova a água residual, permanecendo no espaço superior a géis absorvendo com uma toalha de papel.
12. Prepare-se 3 mL da mistura de gel do acrilamido 4% (4% (p/v) de acrilamida (r: crylamide:bis-acrilamida = 29:1), 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,1% (p/v) SDS) em um tubo de 15 mL.
    Nota: Não adicione P-marca acrilamida ou MnCl₂ solução para a mistura de gel de empilhamento.
13. Adicione 7,5 µ l de TEMED e 24 µ l de 10% (p/v) APS em concentrações finais de 0,25% (v/v) e 0,08% (p/v), respectivamente. Misture bem e agitando suavemente o tubo para 5 s e despeje a mistura em cima do gel de separação. Imediatamente colocar pentes adequados (17-bem plásticos pentes que acomodar até 25 µ l de amostras, por exemplo).
14. Deixe o gel descansar por 30 min à temperatura ambiente. Não é necessário proteger os géis de luz. Depois de define o gel de empilhamento, executá-los sem mais armazenamento.

3. SDS-PAGE e Immunoblotting

1. Retire os pentes os géis. Então retire os espaçadores de silício e depois clipes os géis.
2. Colocar os géis fundidos em gel de tanques e corrigir o gel para o tanque, fixando com os grampos da pasta.
3. Despeje o buffer de execução (25 mM Tris, 192mm glicina, 0,1% (p/v) SDS) na parte inferior e superior dos géis. Limpos poços pela liberação de buffer corrente, usando uma seringa de 5 mL e uma agulha 21G para remover pedaços de gel.
4. Remova as bolhas de ar do espaço de fundo os géis usando uma agulha torta, ligada a uma seringa. Para tornar uma agulha torta, dobre manualmente uma agulha 21G no meio da agulha para que o ângulo entre a ponta e a base da agulha torna-se 30-45 °.
5. Spin para baixo precipitados causados pela adição de MnCl₂ a 20.000 × g por 1 min à temperatura ambiente para obter amostras de claras.
6. Carrega 10 µ g proteínas para detectar a fosforilação de Rab10 Blumental e 30 µ g proteínas para Rab10 endógena.
   Nota: É essencial para carregar um volume igual de amostras em todos os poços. Corredores vazios devem ser carregados com amortecedor da amostra do 1 × Laemmli SDS-PAGE. Se as amostras contêm MnCl₂, adicione a mesma concentração de MnCl₂ para as amostras de manequim.
7. O bem carregado com um marcador de peso molecular (MWM) deve também ser complementado com tampão de amostra SDS-PAGE do 1 × Laemmli para que o volume de amostras carregado é o mesmo em todos os poços.
   Nota: Novamente, se as amostras contêm MnCl₂, adicione a mesma concentração de MnCl₂ para a MWM. Alternativamente, um MWM de EDTA livre pode ser usado.
8. Execute géis em 50 V para empilhamento (cerca de 30 min) até a frente da tintura cruza para o gel de separação.
9. Depois que as amostras de pilha, mudar a tensão de 120 V para a separação até a frente do corante atinge a parte inferior dos géis (aproximadamente 50 e 80 min para 80 e 100 mm comprimento géis, respectivamente).
   Nota: O padrão de migração do MWM deverá ser diferente em geles de SDS-PAGE normais. Ele não deve ser usado para estimar o peso molecular das proteínas em geles de SDS-PAGE de P-marca, mas pode ser usado para verificar a reprodutibilidade dos géis P-marca. Consulte a discussão para mais detalhes.
10. Lave os geles para remover os géis MnCl₂ .
    1. Despeje a transferência de reserva (48 mM Tris, 39mm glicina, 20% (v/v) de metanol) contendo 10 mM EDTA e 0,05% (p/v) SDS em um recipiente (por exemplo, grandes barcos de pesagem).

O volume da reserva deve ser suficiente para cobrir um gel.

Remover o gel de separação de placas o gel e ponha um gel em um recipiente. Descarte o gel de empilhamento.

Deixe o gel num agitador de balanço (~ 60 rpm) durante 10 minutos à temperatura ambiente.

Repita as etapas de lavagem no total de 3 vezes.
Nota: Use buffer fresco para cada lavagem.

Lave o gel uma vez por 10 min com o buffer de transferência contendo 0,05% (p/v) SDS para remover o EDTA. O volume da reserva deve ser suficiente para cobrir um gel.

Electro-transferência de nitrocelulose ou polivinilideno membranas difluoreto (PVDF) usando tanques molhados.

1. Coloque um papel de filtro (10 x 7 cm) num bloco de esponja para transferência. Coloque o gel sobre o papel de filtro. Certifique-se que há nenhuma bolha de ar entre o papel de filtro e o gel.
2. Ponha o gel de uma membrana (10 x 7 cm) e certifique-se que há nenhuma bolha de ar entre o gel e a membrana.
3. Coloque outro papel de filtro (10 x 7 cm) sobre a membrana e, novamente, certifique-se que há nenhuma bolha de ar entre a membrana e o papel de filtro.
4. Colocar outra esponja almofada sobre o papel de filtro. Coloque a pilha de papéis de filtro de membrana/em uma gaveta para transferência.
5. Coloque a fita em um tanque de transferência, certificando-se que a membrana está localizada entre o gel e o ânodo positivamente carregado.
6. Conectar uma fonte de alimentação do tanque e colocar o tanque em uma caixa de espuma de estireno cheia com água gelada. Inicie transferência a 100 V para 180 min.
   Nota: Transferência prolongada é necessária desde que a transferência de proteínas do gel de SDS-PAGE de P-marca não são tão eficientes como que de normais geles de SDS-PAGE. Resfriamento eficiente é essencial para evitar derretimento géis durante a transferência.

Verificar a transferência

1. Remova as membranas os géis usando uma pinça e mergulhe as membranas em uma solução de Ponceau S (0,1% (p/v), Ponceau S, 5% (v/v) de ácido acético) para manchar proteínas transferidas em membranas em um recipiente de plástico. O volume da solução deve ser suficiente para cobrir uma membrana.
2. Incube as membranas para 1 min à temperatura ambiente agite-o manualmente.
   Nota: Uma escada das bandas deve tornar-se visível em cada raia.
3. Pegue a membrana fora a solução de coloração com uma pinça e ver se a escada das bandas tem uniforme padrão e intensidade em cada pista, onde as amostras foram carregadas.
4. Depois de verificar a coloração, retirar a solução de coloração e adicionar tampão TBST (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, monolaurato de polyoxyethylenesorbitan de 0,1% (v/v)). O volume da reserva deve ser suficiente para cobrir uma membrana.
   Nota: A solução de Ponceau S pode ser recolhida e reutilizados várias vezes.
5. Virar as membranas em TBST num agitador de balanço (~ 60 rpm) à temperatura ambiente, enquanto não visíveis bandas permanecem sobre as membranas.
6. Repita a etapa de lavagem com TBST fresco por 5 min.

Remova e descarte a TBST. Bloquear a adição de leite desnatado 5% (p/v) dissolvido em TBST e balançando em um shaker (~ 60 rpm) por 1h à temperatura ambiente. O volume da solução de bloqueio deve ser suficiente para cobrir uma membrana.

Preparar soluções de anticorpo primário diluindo os anticorpos primários (anticorpo anti-Rab10 para Rab10 endógeno) e anticorpos anti-HA HA-Rab10 Blumental em 10 mL por membrana, da solução de bloqueio (ver Tabela de materiais para as concentrações).

Remova e descarte a solução de bloqueio e adicione o anticorpo primário. Incubar as membranas num agitador de balanço (~ 60 rpm) durante a noite a 4 ° C.

Remover a solução de anticorpo primário e adicionar TBST para lavar as membranas. O volume da reserva deve ser suficiente para cobrir uma membrana.

Incube as membranas por 5 min num agitador de balanço (~ 60 rpm) à temperatura ambiente. Repetir a lavagem (etapa 3.16), no total de 3 vezes usando TBST fresco cada vez.

Prepare soluções de anticorpo secundário por diluição anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano (HRP) em 10 mL por membrana, da solução de bloqueio. Use o anticorpo de IgG de antirotulado coelho com HRP para membranas sondadas com o anticorpo anti-Rab10 e o anticorpo de IgG anti-rato rotulado com HRP para aqueles sondado com o anti-HA anticorpo (consulte Tabela de materiais para concentração).

Remova e descarte a TBST após a terceira lavagem e adicionar a solução de anticorpo secundário. Incube as membranas num agitador de balanço (~ 60 rpm) por 1h à temperatura ambiente.

Lave as membranas em TBST durante 10 min. repetir a lavagem passo no total 3 vezes, semelhantes ao passo 3.17.

Desenvolva as membranas utilizando quimioluminescência reforçada (ECL).
Nota: O tempo de exposição pode variar dependendo da solução ECL e o sistema usado para detecção de quimioluminescência.

1. Ligue um Imageador equipado com uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) e um computador ligado para a câmera. Inicie o software de controle para a câmera. Espere até que a temperatura da Câmara CCD chegou a-25 ° C.
2. Colocar 1 mL da solução por uma membrana ECL em um envoltório plástico espalhar num banco.
3. Colocar uma membrana gel-lado-para cima sobre a solução de ECL... e então rapidamente vire-o para que ambos os lados da membrana são revestidos com a solução.
4. Pegue a membrana e drená-lo, deixando um lado do toque da membrana, uma toalha de papel para 5 s.
5. Coloca a membrana entre os filmes claros (por exemplo, bolsas de papel claro).
   Nota: O plástico não é recomendado para envolvimento das membranas. Os filmes claros usados para envolver a membrana precisam ser tão liso quanto possível sem rugas visíveis, para evitar o fundo irregular.
6. Coloque a membrana em uma bandeja preta. Coloque a bandeja no tonalizador e feche a porta.
7. Clique no botão de "Focalização" na janela do software controle. Verifica que a membrana está posicionada corretamente. Clique no botão "Voltar".
8. Selecione "Precisão" para "Tipo de exposição". Selecione "Manual" para "Tempo de exposição" e definir o tempo de exposição a 1 s.
9. Selecione "Alto" para "Sensibilidade/resolução". "Adicionar imagem de digitalização" Deixe desmarcada. Clique no botão "Iniciar" para criar a imagem.
10. Salve a imagem que apareceu no visor no computador como um arquivo TIFF.
11. Repetir a tomada de imagens com o tempo de exposição de 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s e até 180 s. Quando se toma a última imagem, verifique se "Adicionar imagem de digitalização" para a imagem digital, não a quimioluminescência, da membrana pode ser tomada simultaneamente.
12. Selecione a melhor imagem com a maior gama dinâmica e sem qualquer saturação pixels (mostrados em vermelho) nas bandas de interesse.
    Nota: Películas de raio x convencional também podem ser usadas para a deteção de¹⁹.

Resultados

Superexpressão sistema: Fosforilação de HA-Rab10 por 3 × bandeira-LRRK2 em HEK293 de células:

Células HEK293 foram transfectadas com 0.266 µ g de HA-Rab10 selvagem-tipo e 1.066 µ g de 3 × bandeira-LRRK2 (mutante tipo selvagem, quinase-inativo (K1906M), ou mutantes FPD). Fosforilação de Rab10 foi examinada por P-marca SDS-PAGE seguido immunoblotting usando um anti-HA anticorpo (Figura 2). 10 µ g de prot...

Discussão

Aqui, descrevemos um método robusto e fácil de detectar a fosforilação de Rab10 por LRRK2 níveis endógenos com base na metodologia do P-marca. Porque o anticorpo atualmente disponível contra fosforilada Rab10 só funciona com proteínas Blumental¹⁵, o presente método utilizando P-marca SDS-PAGE é a única maneira de avaliar os níveis endógenos de fosforilação Rab10. Além disso, o presente método permite a estimativa da estequiometria da fosforilação de Rab10 nas células. Porque a metodologia de P-mar...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	caseiro		150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 em água MilliQ e esterilizado por autoclave
Cloreto de sódio	Nacalai Tesque	31320-34
Hidrogenofosfato Dissódico de Sódio 12-Água	Wako	196-02835
Cloreto de potássio	Wako	163-03545
Dihidrogenofosfato de potássio	Wako	169-04245
2,5% de tripsina (10X)	Sigma-Aldrich	T4549	Diluir 10 vezes com DPBS estéril para preparar a solução
de trabalhoMeio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)	Wako	044-29765
Soro fetal bovino	BioWest	S1560	Inativado por calor a 56 ° C por 30 min
Penicilina-Estreptomicina (100X)	Wako	168-23191
HEPES	Wako	342-01375
Hidróxido de sódio	Wako	198-13765
Polietileninina HCl MAX, Linear, Mw 40.000 (PEI MAX 40000)	PolySciences, Inc.	24765-1	A solução-mãe foi preparada em HEPES-NaOH 20 mM pH 7,0 a 1 mg/mL e o pH foi então ajustado para 7,0 com NaOH
Dimetilsulfóxido Wako		045-28335
Tris	STAR	RSP-THA500G
Ácido clorídrico	Wako	080-01066
Polioxietileno (10) Éter octilfenílico	Wako	160-24751	Equivalente a Triton X-100
Etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter) -N, N, N ', N'-ácido tetracético (EGTA)	Wako	346-01312
Ortovanadato de sódio (V)	Wako	198-09752
Fluoreto de sódio	Kanto Chemical	37174-20
β -Ácido glicerofosfórico Sal dissódico Pentahidratado	Nacalai Tesque	17103-82
Sódio pirofosfato decahidratado	Kokusan Químico	2113899
Microcistina-LR	Wako	136-12241
Sacarose	Wako	196-00015
Coquetel completo de inibidores de protease sem EDTA	Roche	11873580001	Dissolva um comprimido em 1 mL de água, que pode ser armazenado a -20 ° C por um mês. Use-o na diluição de 1:50 para lise celular
Kit de Ensaio de Proteína Pierce Coomassie (Bradford)	Thermo Fisher Scientific	23200
Dodecil sulfato de sódio	Nacalai Tesque	31607-65
Glicerol	Wako	075-00616
Azul de bromofenol	Wako	021-02911
β-mercaptoetanol	Kanto Chemical	25099-00
Etanol	Wako	056-06967
Metanol	Wako	136-01837
Acrilamida de etiqueta de ligação de fosfato	Wako	AAL-107	Solução de acrilamida P-tag
40% (p / v)	Nacalai Tesque	06119-45	Acrilamida: Bis = 29: 1
Tetrametiletilenodiamina (TEMED)	Nacalai Tesque	33401-72
persulfato de amônio (APS)	Wako	016-08021	10% (p/v) foi preparada dissolvendo o pó de persulfato de amônio em água MilliQ
2-propanol	Wako	166-04831
Cloreto de manganês tetrahidratado	Sigma-Aldrich	M3634
Precision Plus Protein Prestained Standard	Bio-Rad	1610374, 1610373, 1610377	Marcador de peso molecular usado no protocolo
WIDE-VIEW Marcador de tamanho de proteína prestado III	Wako	230-02461
Glycine	Nacalai Tesque	17109-64
Amersham Protran NC 0,45	GE Healthcare	10600007	Membrana de nitrocelulose
Filtro de membrana Durapore EMD	Millipore	GVHP00010	membrana PVDF
No.1	Advantec	00013600
Ponceau S	Nacalai Tesque	28322-72
Ácido acético	Wako	017-00251
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	monolaurato de polioxietilenoorbitano
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Wako	345-01865
Leite em pó desnatado	Difco Laboratories	232100
Immunostar	Wako	291-55203	Solução ECL (sensibilidade normal)
Solução Immunostar LD	Wako	290-69904	ECL (alta sensibilidade)
Solução de coloração CBB	caseira		1 g CBB R-250, 50% (v/v) de metanol, 10% (v/v) de ácido acético em 1 L de água MilliQ
CBB R-250	Wako	031-17922
CBB descoloração solução	caseira		12% (v/v) de metanol, 7% (v/v) de ácido acético em 1 L de água MilliQ
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpos
anti-HA anticorpo	Sigma-Aldrich	11583816001	Usado em 0,2 μ g/mL para immunoblotting.
anticorpo anti-Rab10	Tecnologia de sinalização celular	# 8127	Usado em 1: 1000 para immunoblotting. A especificidade foi confirmada por CRISPR KO em Ito et al., Biochem J, 2016.
anti-pSer935 anticorpo	Abcam	ab133450	Usado em 1 μ g/mL para immunoblotting.
anti-LRRK2 anticorpo	Abcam	ab133518	Usado em 1 μ g/mL para immunoblotting.
anticorpo anti-&alfa;-tubulina	Sigma-Aldrich	T9026	Usado em 1 μ g/mL para immunoblotting.
anticorpo anti-GAPDH	Santa-Cruz	sc-32233	Usado a 0,02 μ g/mL para immunoblotting.
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	515-035-003	Usado a 0.16 μ g/mL para immunoblotting.
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-003	Usado a 0.16 μ g/mL para immunoblotting.
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Inibidores
GSK2578215A	MedChem Express	HY-13237	A solução-mãe foi preparada em DMSO a 10 mM e armazenada a -80 ° C
MLi-2	Fornecido pelo Dr. Dario Alessi (Universidade de Dundee)		A solução de estoque foi preparada em DMSO a 10 mM e armazenada a -80 ° C
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Plasmídeos
Rab10/pcDNA5 FRT TO HA	Fornecido pelo Dr. Dario Alessi (Universidade de Dundee)		Este plasmídeo expressa Rab10 humano marcado com HA aminoterminal.
LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10	Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)		Ito et al., Bioquímica, 46: 1380– 1388 (2007). Este plasmídeo expressa LRRK2 humano de tipo selvagem marcado com amino-terminal 3xFLAG.
LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10	Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)		Ito et al., Bioquímica, 46: 1380– 1388 (2007). Este plasmídeo expressa mutante inativo K1906M amino-terminal de LRRK2 humano marcado com quinase 3xFLAG.
LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10			Este artigo. Este plasmídeo expressa o mutante N1437H FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10	Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)		Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963– 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante R1441C FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10	Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)		Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963– 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante R1441G FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10	Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)		Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963– 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante R1441H FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10			Este artigo. Este plasmídeo expressa o mutante R1441S FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10	Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)		Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963– 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante Y1699C FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10	Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)		Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963– 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante G2019S FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10	Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)		Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963– 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante I2020T FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamentos
CO2 Incubadora	Thermo Fisher Scientific	Forma Série II 3110 Pipeta
	Drummond	Micropipeta Pipet-Aid PA-400
P10	Nichiryo	00-NPX2-10	0.5– 10 μ
L Micropipeta P200	Nichiryo	00-NPX2-200	20– 200 μ L
Micropipeta P1000	Nichiryo	00-NPX2-1000	100- 1000 μ L
Pontas para micropipeta P10	STAR	RST-481LCRST	Pontas estéreis
para micropipeta P200	FUKAEKASEI	1201-705YS	Pontas estéreis
para micropipeta P1000	STAR	RST-4810BRST	Pipeta estéril
de 5 mL desportável	Greiner	606180	Pipeta estéril
de 10 mL desportável	Greiner	607180	Pipeta desportável estéril
de 25 mL	Falcon	357535	Hematocitômetro estéril
	Sunlead Glass	A126	Microscópio Neubeuer aprimorado
	Olympus	CKX53
pratos de 10 cm	Falcon	353003	Para cultura de tecidos
Placas de 6 poços	AGC Techno Glass	3810-006	Para cultura
de tecidosMisturador de vórtice	Scientific Industries	Vortex-Genie 2
	Sumitomo Baquelite	MS-93100
Tubos de 1,5 mL	STAR	RSV-MTT1.5
Tubos de 15 mL	AGC Techno Glass	2323-015
Tubos de 50 mL	Centrífugas AGC Techno Glass	2343-050
TOMY		MX-307
Placas de 96 poços	Greiner	655061	Não para cultura de tecidos
Leitor de placas	Molecular Devices	SpectraMax M2e
SDS– Tanques PAGE	Nihon Eido	NA-1010
Tanques de transferência	Nihon Eido	NA-1510B
Placas de gel (entalhadas)	Nihon Eido	NA-1000-1
Placas de gel (lisas)	Nihon Eido	NA-1000-2
Espaçadores de silício	Nihon Eido	NA-1000-16
Pentes de 17 poços	Nihon Eido	Feito
Clipes de fichário	Nihon Eido	NA-1000-15
seringa de 5 mL	Terumo	SS-05SZ
21G	Terumo	NN-2138R
Power Station 1000 VC	ATTO	AE-8450	Fonte de alimentação para SDS– PÁGINA e transferência
Grandes barcos de pesagem	Ina Optika	AS-DL
Recipientes de plástico	AS	ONE PS CASE No.4	10 x 80 x 50 mm
Agitador	de balanço Titech	NR-10
Caixa de espuma de estireno	genérico		As dimensões internas devem caber em um tanque de transferência (200 x 250 x 250 mm).
ImageQuant LAS-4000	GE Healthcare		Um gerador de imagens equipado com uma câmera CCD refrigerada para detecção de ECL