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Artigo de método

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

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DOI:

10.3791/56688

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14 de dezembro de 2017

 , 
1Laboratory of Brain and Neurological Disorders, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 2Laboratory of Neuropathology and Neuroscience, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

Neste artigo

Resumo

O presente estudo descreve um método simples de detectar níveis endógenos de fosforilação de Rab10 pela rica em leucina repetição quinase 2.

Resumo

Mutações no rico em leucina repetição quinase 2 (LRRK2) foram mostradas para ser associada com a doença de Parkinson familiar (FPD). Como ativação anormal da atividade da quinase de LRRK2 tem sido implicada na patogênese da DP, é essencial estabelecer um método para avaliar os níveis fisiológicos da atividade da quinase de LRRK2. Estudos recentes revelaram que LRRK2 fosforila membros da família Rab GTPase, incluindo Rab10, sob condições fisiológicas. Embora a fosforilação de Rab10 endógeno por LRRK2 em pilhas cultivadas pode ser detectada por espectrometria de massa, tem sido difícil detectá-lo pelo immunoblotting devido à sensibilidade pobre de anticorpos de fosforilação específicos disponíveis atualmente para Rab10. Aqui, descrevemos um simples método de detectar os níveis endógenos de fosforilação de Rab10 por LRRK2 baseado na immunoblotting utilizando sódio Dodecil sulfato poliacrilamida electroforese do gel (SDS-PAGE) combinado com uma marca de ligação de fosfato (P-tag), que é N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N «,N «- tris (piridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. O presente protocolo não só fornece um exemplo da metodologia utilizando a tag-P, mas também permite a avaliação de como mutações, bem como inibidor de tratamento/administração ou quaisquer outros fatores alteram a sinalização a jusante de LRRK2 em células e tecidos .

Introdução

PD é uma das mais comuns doenças neurodegenerativas, predominantemente, afetando os neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo, resultando em disfunção dos sistemas de motor em idosos1. Enquanto a maioria dos pacientes desenvolvem PD de forma esporádica, há famílias herdar a doença. Mutações em vários genes foram encontradas para ser ligado com FPD2. Um dos genes causadores de FPD é LRRK2, em que oito mutações missense (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S e I2020T), ligadas a um FPD predominantemente hereditária chamada PARK8 até agora têm sido relatados3,4,5. Vários estudos de associação de genoma-larga (GWAS) de pacientes com DP esporádicos também identificaram variações genômicas no locus LRRK2 como um fator de risco para a polícia, sugerindo que a anormalidade na função do LRRK2 é uma causa comum de neurodegeneração em ambos os casos esporádicos e PARK8 FPD6,7,8.

LRRK2 é uma proteína grande (2.527 aminoácidos), consistindo de um domínio de repetição rico em leucina, um Ras-GTP-vinculação do domínio de proteínas complexas (ROC), um C-terminal do domínio, um domínio da quinase serina/treonina proteína e um domínio de WD409ROC (CR). As oito mutações FPD localizar estes domínios funcionais; N1437H e R1441C/G/H/S no domínio do ROC, Y1699C no domínio do CR, G2019S e I2020T no domínio de cinase. Desde que a mutação G2019S, que é o mais frequentemente encontrada mutação em PD pacientes10,11,12, aumenta a atividade da quinase de LRRK2 por 2-3 vezes em vitro13, supor que o aumento anormal da fosforilação de LRRK2 substrate(s) é tóxico para os neurônios. No entanto, tem sido impossível estudar se a fosforilação de substratos LRRK2 fisiologicamente relevantes é alterada em pacientes com DP familiar/esporádicas devido à falta de métodos para avaliá-lo em amostras derivadas de pacientes.

Fosforilação de proteínas é geralmente detectada pelo immunoblotting ou ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando anticorpos especificamente, reconhecendo o estado fosforilado de proteínas ou por análise de espectrometria de massa. No entanto, a estratégia anterior às vezes não pode ser aplicada devido às dificuldades em criar anticorpos específicos de fosforilação. Etiquetando metabólica das células com fosfato radioativo é outra opção para examinar os níveis fisiológicos de fosforilação quando anticorpos específicos fosforilação não estão prontamente disponíveis. No entanto, ele requer uma grande quantidade de materiais radioativos e, portanto, envolve alguns equipamentos especializados para protecção contra as radiações14. Análise de espectrometria de massa é mais sensível em relação a esses métodos imunoquímicos e tornou-se popular na análise de fosforilação de proteínas. No entanto, a preparação da amostra é demorada e caros instrumentos são necessários para a análise.

Um subconjunto da família Rab GTPase, incluindo Rab10 e Rab8 foi relatado recentemente como substratos fisiológicos diretos para LRRK2 com base no resultado de uma análise de phosphoproteomic em grande escala15. Em seguida demonstramos que a fosforilação de Rab10 foi aumentada por mutações FPD em fibroblastos embrionários de rato e nos pulmões de ratos16de knockin. Neste relatório, nós escolhemos a empregar uma eletroforese em gel de poliacrilamida sódio Dodecil sulfato (SDS-PAGE)-método em que uma molécula de P-marca é co polimerizada em geles de SDS-PAGE (P-marca SDS-PAGE) para detectar os níveis endógenos de fosforilação de Rab10, baseado em Porque um altamente sensível anticorpos específicos Rab10 fosforilada ainda estava faltando. Nós não conseguiram detectar a fosforilação de endógena Rab8 devido a seletividade pobre de anticorpos disponíveis atualmente para Rab8 total. Por isso, decidimos focar a fosforilação de Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 em Thr73 localizar no meio da região altamente conservadas "alternar II". Alta conservação dos sítios entre proteínas Rab fosforilação pode ser uma das razões por que os anticorpos phosphospecific reconhecer proteínas Rab distintas são difíceis de fazer.

A fosforilação de Rab8A por LRRK2 inibe a ligação do Rabin8, um fator da troca do nucleotídeo guanina (GEF) que ativa Rab8A trocando o PIB ligado com GTP15. A fosforilação de Rab10 e Rab8A por LRRK2 também inibe a ligação dos inibidores de PIB-dissociação (GDIs), que são essenciais para a ativação de proteínas Rab extraindo as proteínas Rab ligados a PIB de membranas15. Coletivamente, supor que a fosforilação de proteínas Rab por LRRK2 impede que a ativação embora o mecanismo molecular preciso e consequências fisiológicas da fosforilação permanecem obscuros.

P-marca SDS-PAGE foi inventado por Kinoshita et al em 2006: neste método, acrilamida covalentemente foi acoplada com P-tag, uma molécula capturando fosfatos com alta afinidade, que copolymerized em SDS-PAGE geles17. Porque as moléculas de P-etiqueta em um gel de SDS-PAGE seletivamente retardam mobilidade eletroforética de proteínas fosforiladas, P-marca SDS-PAGE pode separar proteínas fosforiladas aqueles não-fosforilada (Figura 1). Se a proteína de interesse é fosforilado em múltiplos resíduos, uma escada de bandas correspondentes às formas diferencialmente fosforiladas será observada. No caso de Rab10, observamos apenas uma banda deslocada, indicando que o Rab10 é phosphorylated apenas em Thr73. A grande vantagem de P-marca SDS-PAGE sobre immunoblotting com anticorpos específicos fosforilação é que Rab10 fosforilada pode ser detectado pelo immunoblotting com anticorpos de fosforilação específico (ou seja, reconhecendo Rab10 total) após ser transferido nas membranas, que é geralmente mais específica, sensível e disponível de fontes comerciais/acadêmico. Outra vantagem de usar P-marca SDS-PAGE é que um pode obter a estimativa aproximada da estequiometria da fosforilação, que é impossível pelo immunoblotting com anticorpos específicos fosforilação ou através da marcação metabólica das células com radioativo fosfatos.

Aparte o uso de barato P-marca acrilamida e algumas pequenas modificações relacionadas a ela, o presente método de detecção de fosforilação de Rab10 por LRRK2 segue um protocolo geral de immunoblotting.Portanto, deve ser simples e facilmente executável em alguns laboratórios onde immunoblotting é uma prática usual, com todos os tipos de amostras, incluindo proteínas purified, lisados celulares e tecido homogenates.

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Protocolo

1. amostra preparação para o P-marca SDS-PAGE

  1. Remover e descartar os meios de comunicação de pratos de 10 cm na qual as células são cultivadas usando uma sucção lavar as células com fosfato salino de 5ml Dulbecco (DPBS) pelo primeiro DPBS adicionando ao lado dos pratos, para evitar perturbar a camada de células e agitar manualmente os pratos de volta e para trás várias vezes.
  2. Remover e descartar o DPBS usando uma sucção adicionar 2 mL de tripsina 0,25% (p/v), diluída em DPBS e agitar suavemente os pratos para cobrir a camada de células. Colocar os pratos em uma incubadora2 CO (37 ° C, ar umidificado, 5% CO2) por 5 min.
  3. Depois de pipetagem acima e para baixo usando uma pipeta descartável para quebrar células isoladas, coletar a suspensão de células em um tubo de 15 mL e medir a densidade de células usando um hematocytometer sob um microscópio,18.
  4. Dilua as células de 2,5 × 105 células/mL com meio modificado de águia de Dulbecco (DMEM) suplementadas com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL. Adicione 2 mL (5 × 105 células) de suspensão de célula diluídos a cada poço de placas boas 6.
  5. Crescem as células durante a noite em uma incubadora de CO2 (37 ° C, ar umidificado, 5% CO2).
  6. Transfection em células HEK293
    Nota: Se a fosforilação de Rab10 endógeno é a ser examinado, vá para etapa 1.7. Plasmídeos utilizados neste protocolo podem ser obtidos dos autores mediante pedido. Consulte Tabela de materiais para breve informação e Figura S1 para seu DNA sequências.
    1. Alíquota 200 µ l de DMEM para tubos de 1,5 mL.
    2. A cada tubo, adicione ambos 0.266 µ g (concentração final de 1,33 g/mL) de um plasmídeo codificação HA-Rab10 e 1.066 µ g (concentração final de 5.33 µ g/mL) de um plasmídeo codificação 3 × bandeira-LRRK2 de 500 ações de plasmídeo µ g/mL. Em seguida, adicione 4 µ l da solução de 1 mg/mL de polyethyleneimine (dissolvido em 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.0) e misture a solução vortexing para 5 s.
    3. Deixe os tubos ficar à temperatura ambiente durante 10 minutos e adicione o conteúdo de um tubo gota a gota para um bem utilizando uma micropipeta. Suavemente e manualmente de rock as placas de cultura e para trás várias vezes para deixar a mistura de transfeccao difusa uniformemente em todo o poço.
  7. Deixe que as células crescem para outro 24-36 h numa incubadora de CO2 (37 ° C, ar umidificado, 5% CO2).
  8. Se a fosforilação de Rab10 endógeno é a ser examinado, trate células com e sem inibidores de LRRK2 para 1 h antes de lise de células.
    1. Prepare soluções estoque de inibidores LRRK2, dissolvendo os inibidores em dimetilsulfóxido (DMSO) em 10 milímetros. Nós recomendamos usar MLi-2 e GSK2578215A, que são altamente específicos e potentes inibidores da LRRK2. Soluções conservadas em estoque de loja a-80 ° C.
    2. Preparar acções de trabalho dos inibidores diluindo as soluções estoque com DMSO: para MLi-2, prepare-se 10 µM e 30 µM para endógena e Blumental LRRK2, respectivamente. Para GSK2578215A, prepare-se 1 mM e 3 mM para endógena e Blumental LRRK2, respectivamente.
    3. Adicionar 2 µ l das existências do MLi-2 ou GSK2578215A trabalhar no meio de um bem, utilizando uma micropipeta e suavemente rock a placa manualmente para frente e para trás várias vezes para deixar os inibidores difusa uniformemente em todo o poço.
    4. Adicione 2 µ l de DMSO para um bem diferente como um controle negativo de forma semelhante ao inibidor na etapa 1.8.3.
    5. Colocar as placas para a incubadora e cultura das células por 1h.
  9. Lise as células.
    1. Coloque as placas de cultura no gelo. Remova e descarte a mídia. Lave as células primeiro adicionando 2 ml DPBS ao lado dos pratos para não comprometer a célula da camada e agitar manualmente os pratos e para trás várias vezes.
    2. Remover e descartar o DPBS e adicionar as células 100 µ l da lise (pH 50 mM Tris-HCl 7.5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) octilfenil éter, 1mm EGTA (glicol de etileno-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-ácido etilenodiaminotetracético), ortovanadato de sódio de 1 mM, 50 mM fluoreto de sódio, β-glicerofosfato de 10mm, pirofosfato de sódio de 5 mM, 0,1 µ g/mL microcistina-LR, 270 mM de sacarose, coquetel de inibidor de protease).
    3. Incline as placas no gelo e raspe as células com uma espátula de célula para reunir tanto celular lisado quanto possível. Recolha os lysates utilizando uma micropipeta para tubos de 1,5 mL (pré-refrigerados no gelo).
      Atenção: Microcistina-LR pode ser fatal se ingerido ou em contato com a pele.
  10. Deixe os tubos no gelo por 10 min para lise completa. Esclarecer os lisados celulares por centrifugação (20.000 × g, 10 min a 4 ° C) e transferir os sobrenadantes para novos tubos de 1,5 mL previamente refrigerados no gelo.
  11. Medir a concentração de proteína (µ g / µ l) dos lysates apuradas pelo ensaio de Bradford.
    1. Preparar a albumina de soro bovino padrões (BSA) (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1 mg/mL) diluindo a solução com água destilada. Diluir os lysates célula desmarcada por 20 vezes com água destilada.
    2. Colocar 5 µ l/poço de cada célula diluída, em branco (água destilada) e os padrões de BSA lisado em uma placa de 96 poços em triplicado.
    3. Adicionar 150 µ l/poço do reagente Bradford ensaio usando micropipeta 12 canais e deixar a placa à temperatura ambiente por 5 min.
    4. Medir a absorvância em 595 nm em um leitor de placas e comparar com padrões de BSA.
  12. Prepare-se 100 µ l de amostras para SDS-PAGE. A concentração de proteína das amostras é de 1 µ g / µ l para Blumental HA-Rab10 e 2 µ g / µ l para Rab10 endógena.
    1. Usando as concentrações quantificadas da etapa 1.11.4, calcular o volume (µ l) dos lisados celulares equivalentes a 100 µ g (Blumental HA-Rab10) ou 200 µ g (Rab10 endógenos), dividindo a quantidade de proteína (100 µ g ou 200 µ g) pela concentração de proteína de lisados (µ µ g/l).
    2. Adicione 25 µ l de tampão de amostra SDS-PAGE do 4 × Laemmli (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8% (p/v) SDS, 40% (v/v) glicerol, azul de bromofenol 0,02% (p/v), 4% (v/v) β-Mercaptoetanol) para novos tubos de 1,5 mL, mantidos em temperatura ambiente.
    3. Adicionar o volume calculado da célula lysates a cada tubo e misture por num Vortex para 5 s à temperatura ambiente.
    4. Trazer o volume total de 100 µ l com a Lise e a mistura vortexing por 5 s à temperatura ambiente.
  13. Suplemento com 10mm MnCl2 para saciar o agente quelante. Adicione 1 µ l de 500mm MnCl2. Mix vortexing para 5 s à temperatura ambiente.
    Nota: As amostras que contêm MnCl2 podem não ser adequadas para SDS-PAGE normal.
Esta etapa é necessária devido à presença do agente quelante (tais como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), EGTA, etc.) na Lise. Caso contrário, Mn2 + íons acopladas a acrilamida P-marca serão dissociadas pelos agentes quelantes, e P-marca SDS-PAGE não funcionará corretamente.
  • Ferver todas as amostras a 100 ° C por 5 min e armazenar as amostras abaixo de-20 ° C até o uso. As amostras cozidas podem ser armazenadas até pelo menos 6 meses.

    • 2. fundição géis para P-marca SDS-PAGE

    Nota: O gel deve ser feita no mesmo dia como correr os géis. Gel pode ser feita sob condições de luz ambiente.

    1. Preparar solução de acrilamida 5mm P-marca dissolvendo a 10 mg de pó/sólido P-marca do acrilamido completamente com 100 µ l de metanol e depois trazer a 3,3 mL adicionando água bidestilada.
      Nota: P-marca acrilamida é sensível à luz. A solução preparada deve ser armazenada no escuro a 4 ° C até o uso.
    2. Limpeza simples e entalhadas placas etanol a 70% de pulverização e limpando com uma toalha de papel. Monte as placas de gel. As dimensões das placas de gel usadas neste protocolo particular são 80 ou 100 mm de comprimento por 100 mm de largura. Silicone limpa espaçadores colocados entre a planície e entalhadas chapas e as chapas montadas são presas com grampos da pasta.
      Nota: Pode ser usado qualquer tipo de placas de gel que trabalham para SDS-PAGE ordinário.
    3. Colocar um pente ser usado (17-bem plastico) em placas de gel montado e marca na posição de fundo dos poços da placa de gel com um marcador permanente.
    4. Prepare-se 10 mL da mistura de gel de acrilamida 10% (10% (p/v) de acrilamida (acrylamide:bis-acrilamida = 29:1), 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% (p/v) SDS) em um tubo de 15 mL.
      Nota: A concentração ideal de acrilamida pode variar consoante os reagentes utilizados. Tempted (TEMED) e amônio persulfato (APS) não deve ser adicionado neste ponto.
    5. Adicione 100 µ l de acrilamida P-marca de 5 mM e 10 µ l de 1m MnCl2 soluções em concentrações finais de 50 µM e 100 µM, respectivamente.
      Nota: As concentrações ideais dos P-marca acrilamida e MnCl2 também podem variar dependendo os reagentes utilizados.
    6. Adicione 15 µ l de TEMED para a mistura de gel em uma concentração final de 0,15% (v/v) e depois de 50 µ l de 10% (p/v) APS em uma concentração final de 0,05% (p/v). Misturar bem agitando suavemente o tubo para 5 s e despeje nas placas montadas imediatamente até uma altura que é de 2 mm abaixo da posição marcada na etapa 2.3.
    7. Suavemente a camada para a solução de gel para achatar a parte superior do gel de separação de 2-propanol.
    8. Deixe o gel descansar por 30 min à temperatura ambiente. Não é necessário proteger os géis de luz.
      Nota: Pode levar mais tempo para géis definir sob temperatura ambiente fria. A mistura de gel de desgasificação antes de adicionar TEMED e APS ajuda a acelerar a esta etapa. Para este efeito, a mistura de gel pode ser preparada em um Erlenmeyer de 100-200 mL, conectado a um sistema de sucção. Desgaseifica a solução durante 10 minutos.
    9. Remova o 2-propanol em camadas absorventes com uma toalha de papel.
    10. Lavar o espaço superior a géis preenchendo o espaço com água destilada de um frasco de lavagem e descarte a água derramando fora em bacia. Repeti 3 vezes de lavagem.
    11. Remova a água residual, permanecendo no espaço superior a géis absorvendo com uma toalha de papel.
    12. Prepare-se 3 mL da mistura de gel do acrilamido 4% (4% (p/v) de acrilamida (r: crylamide:bis-acrilamida = 29:1), 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,1% (p/v) SDS) em um tubo de 15 mL.
      Nota: Não adicione P-marca acrilamida ou MnCl2 solução para a mistura de gel de empilhamento.
    13. Adicione 7,5 µ l de TEMED e 24 µ l de 10% (p/v) APS em concentrações finais de 0,25% (v/v) e 0,08% (p/v), respectivamente. Misture bem e agitando suavemente o tubo para 5 s e despeje a mistura em cima do gel de separação. Imediatamente colocar pentes adequados (17-bem plásticos pentes que acomodar até 25 µ l de amostras, por exemplo).
    14. Deixe o gel descansar por 30 min à temperatura ambiente. Não é necessário proteger os géis de luz. Depois de define o gel de empilhamento, executá-los sem mais armazenamento.

    3. SDS-PAGE e Immunoblotting

    1. Retire os pentes os géis. Então retire os espaçadores de silício e depois clipes os géis.
    2. Colocar os géis fundidos em gel de tanques e corrigir o gel para o tanque, fixando com os grampos da pasta.
    3. Despeje o buffer de execução (25 mM Tris, 192mm glicina, 0,1% (p/v) SDS) na parte inferior e superior dos géis. Limpos poços pela liberação de buffer corrente, usando uma seringa de 5 mL e uma agulha 21G para remover pedaços de gel.
    4. Remova as bolhas de ar do espaço de fundo os géis usando uma agulha torta, ligada a uma seringa. Para tornar uma agulha torta, dobre manualmente uma agulha 21G no meio da agulha para que o ângulo entre a ponta e a base da agulha torna-se 30-45 °.
    5. Spin para baixo precipitados causados pela adição de MnCl2 a 20.000 × g por 1 min à temperatura ambiente para obter amostras de claras.
    6. Carrega 10 µ g proteínas para detectar a fosforilação de Rab10 Blumental e 30 µ g proteínas para Rab10 endógena.
      Nota: É essencial para carregar um volume igual de amostras em todos os poços. Corredores vazios devem ser carregados com amortecedor da amostra do 1 × Laemmli SDS-PAGE. Se as amostras contêm MnCl2, adicione a mesma concentração de MnCl2 para as amostras de manequim.
    7. O bem carregado com um marcador de peso molecular (MWM) deve também ser complementado com tampão de amostra SDS-PAGE do 1 × Laemmli para que o volume de amostras carregado é o mesmo em todos os poços.
      Nota: Novamente, se as amostras contêm MnCl2, adicione a mesma concentração de MnCl2 para a MWM. Alternativamente, um MWM de EDTA livre pode ser usado.
    8. Execute géis em 50 V para empilhamento (cerca de 30 min) até a frente da tintura cruza para o gel de separação.
    9. Depois que as amostras de pilha, mudar a tensão de 120 V para a separação até a frente do corante atinge a parte inferior dos géis (aproximadamente 50 e 80 min para 80 e 100 mm comprimento géis, respectivamente).
      Nota: O padrão de migração do MWM deverá ser diferente em geles de SDS-PAGE normais. Ele não deve ser usado para estimar o peso molecular das proteínas em geles de SDS-PAGE de P-marca, mas pode ser usado para verificar a reprodutibilidade dos géis P-marca. Consulte a discussão para mais detalhes.
    10. Lave os geles para remover os géis MnCl2 .
      1. Despeje a transferência de reserva (48 mM Tris, 39mm glicina, 20% (v/v) de metanol) contendo 10 mM EDTA e 0,05% (p/v) SDS em um recipiente (por exemplo, grandes barcos de pesagem).
    O volume da reserva deve ser suficiente para cobrir um gel.
  • Remover o gel de separação de placas o gel e ponha um gel em um recipiente. Descarte o gel de empilhamento.
  • Deixe o gel num agitador de balanço (~ 60 rpm) durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  • Repita as etapas de lavagem no total de 3 vezes.
    Nota: Use buffer fresco para cada lavagem.
  • Lave o gel uma vez por 10 min com o buffer de transferência contendo 0,05% (p/v) SDS para remover o EDTA. O volume da reserva deve ser suficiente para cobrir um gel.
  • Electro-transferência de nitrocelulose ou polivinilideno membranas difluoreto (PVDF) usando tanques molhados.
    1. Coloque um papel de filtro (10 x 7 cm) num bloco de esponja para transferência. Coloque o gel sobre o papel de filtro. Certifique-se que há nenhuma bolha de ar entre o papel de filtro e o gel.
    2. Ponha o gel de uma membrana (10 x 7 cm) e certifique-se que há nenhuma bolha de ar entre o gel e a membrana.
    3. Coloque outro papel de filtro (10 x 7 cm) sobre a membrana e, novamente, certifique-se que há nenhuma bolha de ar entre a membrana e o papel de filtro.
    4. Colocar outra esponja almofada sobre o papel de filtro. Coloque a pilha de papéis de filtro de membrana/em uma gaveta para transferência.
    5. Coloque a fita em um tanque de transferência, certificando-se que a membrana está localizada entre o gel e o ânodo positivamente carregado.
    6. Conectar uma fonte de alimentação do tanque e colocar o tanque em uma caixa de espuma de estireno cheia com água gelada. Inicie transferência a 100 V para 180 min.
      Nota: Transferência prolongada é necessária desde que a transferência de proteínas do gel de SDS-PAGE de P-marca não são tão eficientes como que de normais geles de SDS-PAGE. Resfriamento eficiente é essencial para evitar derretimento géis durante a transferência.
  • Verificar a transferência
    1. Remova as membranas os géis usando uma pinça e mergulhe as membranas em uma solução de Ponceau S (0,1% (p/v), Ponceau S, 5% (v/v) de ácido acético) para manchar proteínas transferidas em membranas em um recipiente de plástico. O volume da solução deve ser suficiente para cobrir uma membrana.
    2. Incube as membranas para 1 min à temperatura ambiente agite-o manualmente.
      Nota: Uma escada das bandas deve tornar-se visível em cada raia.
    3. Pegue a membrana fora a solução de coloração com uma pinça e ver se a escada das bandas tem uniforme padrão e intensidade em cada pista, onde as amostras foram carregadas.
    4. Depois de verificar a coloração, retirar a solução de coloração e adicionar tampão TBST (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, monolaurato de polyoxyethylenesorbitan de 0,1% (v/v)). O volume da reserva deve ser suficiente para cobrir uma membrana.
      Nota: A solução de Ponceau S pode ser recolhida e reutilizados várias vezes.
    5. Virar as membranas em TBST num agitador de balanço (~ 60 rpm) à temperatura ambiente, enquanto não visíveis bandas permanecem sobre as membranas.
    6. Repita a etapa de lavagem com TBST fresco por 5 min.
  • Remova e descarte a TBST. Bloquear a adição de leite desnatado 5% (p/v) dissolvido em TBST e balançando em um shaker (~ 60 rpm) por 1h à temperatura ambiente. O volume da solução de bloqueio deve ser suficiente para cobrir uma membrana.
  • Preparar soluções de anticorpo primário diluindo os anticorpos primários (anticorpo anti-Rab10 para Rab10 endógeno) e anticorpos anti-HA HA-Rab10 Blumental em 10 mL por membrana, da solução de bloqueio (ver Tabela de materiais para as concentrações).
  • Remova e descarte a solução de bloqueio e adicione o anticorpo primário. Incubar as membranas num agitador de balanço (~ 60 rpm) durante a noite a 4 ° C.
  • Remover a solução de anticorpo primário e adicionar TBST para lavar as membranas. O volume da reserva deve ser suficiente para cobrir uma membrana.
  • Incube as membranas por 5 min num agitador de balanço (~ 60 rpm) à temperatura ambiente. Repetir a lavagem (etapa 3.16), no total de 3 vezes usando TBST fresco cada vez.
  • Prepare soluções de anticorpo secundário por diluição anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano (HRP) em 10 mL por membrana, da solução de bloqueio. Use o anticorpo de IgG de antirotulado coelho com HRP para membranas sondadas com o anticorpo anti-Rab10 e o anticorpo de IgG anti-rato rotulado com HRP para aqueles sondado com o anti-HA anticorpo (consulte Tabela de materiais para concentração).
  • Remova e descarte a TBST após a terceira lavagem e adicionar a solução de anticorpo secundário. Incube as membranas num agitador de balanço (~ 60 rpm) por 1h à temperatura ambiente.
  • Lave as membranas em TBST durante 10 min. repetir a lavagem passo no total 3 vezes, semelhantes ao passo 3.17.
  • Desenvolva as membranas utilizando quimioluminescência reforçada (ECL).
    Nota: O tempo de exposição pode variar dependendo da solução ECL e o sistema usado para detecção de quimioluminescência.
    1. Ligue um Imageador equipado com uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) e um computador ligado para a câmera. Inicie o software de controle para a câmera. Espere até que a temperatura da Câmara CCD chegou a-25 ° C.
    2. Colocar 1 mL da solução por uma membrana ECL em um envoltório plástico espalhar num banco.
    3. Colocar uma membrana gel-lado-para cima sobre a solução de ECL... e então rapidamente vire-o para que ambos os lados da membrana são revestidos com a solução.
    4. Pegue a membrana e drená-lo, deixando um lado do toque da membrana, uma toalha de papel para 5 s.
    5. Coloca a membrana entre os filmes claros (por exemplo, bolsas de papel claro).
      Nota: O plástico não é recomendado para envolvimento das membranas. Os filmes claros usados para envolver a membrana precisam ser tão liso quanto possível sem rugas visíveis, para evitar o fundo irregular.
    6. Coloque a membrana em uma bandeja preta. Coloque a bandeja no tonalizador e feche a porta.
    7. Clique no botão de "Focalização" na janela do software controle. Verifica que a membrana está posicionada corretamente. Clique no botão "Voltar".
    8. Selecione "Precisão" para "Tipo de exposição". Selecione "Manual" para "Tempo de exposição" e definir o tempo de exposição a 1 s.
    9. Selecione "Alto" para "Sensibilidade/resolução". "Adicionar imagem de digitalização" Deixe desmarcada. Clique no botão "Iniciar" para criar a imagem.
    10. Salve a imagem que apareceu no visor no computador como um arquivo TIFF.
    11. Repetir a tomada de imagens com o tempo de exposição de 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s e até 180 s. Quando se toma a última imagem, verifique se "Adicionar imagem de digitalização" para a imagem digital, não a quimioluminescência, da membrana pode ser tomada simultaneamente.
    12. Selecione a melhor imagem com a maior gama dinâmica e sem qualquer saturação pixels (mostrados em vermelho) nas bandas de interesse.
      Nota: Películas de raio x convencional também podem ser usadas para a deteção de19.

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    Resultados

    Superexpressão sistema: Fosforilação de HA-Rab10 por 3 × bandeira-LRRK2 em HEK293 de células:

    Células HEK293 foram transfectadas com 0.266 µ g de HA-Rab10 selvagem-tipo e 1.066 µ g de 3 × bandeira-LRRK2 (mutante tipo selvagem, quinase-inativo (K1906M), ou mutantes FPD). Fosforilação de Rab10 foi examinada por P-marca SDS-PAGE seguido immunoblotting usando um anti-HA anticorpo (Figura 2). 10 µ g de prot...

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    Discussão

    Aqui, descrevemos um método robusto e fácil de detectar a fosforilação de Rab10 por LRRK2 níveis endógenos com base na metodologia do P-marca. Porque o anticorpo atualmente disponível contra fosforilada Rab10 só funciona com proteínas Blumental15, o presente método utilizando P-marca SDS-PAGE é a única maneira de avaliar os níveis endógenos de fosforilação Rab10. Além disso, o presente método permite a estimativa da estequiometria da fosforilação de Rab10 nas células. Porque a metodologia de P-mar...

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    Divulgações

    Os autores não têm nada para divulgar.

    Agradecimentos

    Agradecemos o Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio, Japão) por gentilmente fornecendo os plasmídeos codificação 3xFLAG-LRRK2 WT e mutantes. Agradecemos também o Dr. Dario Alessi (Universidade de Dundee, Reino Unido) para fornecer gentilmente MLi-2 e o plasmídeo codificação HA-Rab10. Este trabalho foi apoiado pela sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHI Grant número JP17K08265 (G.I.).

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Reagentes
    solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)caseiro150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 em água MilliQ e esterilizado por autoclave
    Cloreto de sódioNacalai Tesque31320-34
    Hidrogenofosfato Dissódico de Sódio 12-ÁguaWako196-02835
    Cloreto de potássioWako163-03545
    Dihidrogenofosfato de potássioWako169-04245
    2,5% de tripsina (10X)Sigma-AldrichT4549Diluir 10 vezes com DPBS estéril para preparar a solução
    de trabalhoMeio Eagle modificado de Dulbecco
    (DMEM)    		Wako044-29765
    Soro fetal bovinoBioWestS1560Inativado por calor a 56 ° C por 30 min
    Penicilina-Estreptomicina (100X)Wako168-23191
    HEPESWako342-01375
    Hidróxido de sódioWako198-13765
    Polietileninina HCl MAX, Linear, Mw 40.000 (PEI MAX 40000)PolySciences, Inc.24765-1A solução-mãe foi preparada em HEPES-NaOH 20 mM pH 7,0 a 1 mg/mL e o pH foi então ajustado para 7,0 com NaOH
    Dimetilsulfóxido Wako045-28335
    TrisSTARRSP-THA500G
    Ácido clorídricoWako080-01066
    Polioxietileno (10) Éter octilfenílicoWako160-24751Equivalente a Triton X-100
    Etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter) -N, N, N ', N'-ácido tetracético (EGTA)Wako346-01312
    Ortovanadato de sódio (V)Wako198-09752
    Fluoreto de sódioKanto Chemical37174-20
    β -Ácido glicerofosfórico Sal dissódico PentahidratadoNacalai Tesque17103-82
    Sódio pirofosfato decahidratadoKokusan Químico2113899
    Microcistina-LRWako136-12241
    SacaroseWako196-00015
    Coquetel completo de inibidores de protease sem EDTARoche11873580001Dissolva um comprimido em 1 mL de água, que pode ser armazenado a -20 ° C por um mês. Use-o na diluição de 1:50 para lise celular
    Kit de Ensaio de Proteína Pierce Coomassie (Bradford)Thermo Fisher Scientific23200
    Dodecil sulfato de sódioNacalai Tesque31607-65
    GlicerolWako075-00616
    Azul de bromofenolWako021-02911
    β-mercaptoetanolKanto Chemical25099-00
    EtanolWako056-06967
    MetanolWako136-01837
    Acrilamida de etiqueta de ligação de fosfatoWakoAAL-107Solução de acrilamida P-tag
    40% (p / v)Nacalai Tesque06119-45Acrilamida: Bis = 29: 1
    Tetrametiletilenodiamina (TEMED)Nacalai Tesque33401-72
    persulfato de amônio (APS)Wako016-0802110% (p/v) foi preparada dissolvendo o pó de persulfato de amônio em água MilliQ
    2-propanolWako166-04831
    Cloreto de manganês tetrahidratadoSigma-AldrichM3634
    Precision Plus Protein Prestained StandardBio-Rad1610374, 1610373, 1610377Marcador de peso molecular usado no protocolo
    WIDE-VIEW Marcador de tamanho de proteína prestado IIIWako230-02461
    GlycineNacalai Tesque17109-64
    Amersham Protran NC 0,45GE Healthcare10600007Membrana de nitrocelulose
    Filtro de membrana Durapore EMDMilliporeGVHP00010membrana PVDF
    No.1Advantec00013600
    Ponceau SNacalai Tesque28322-72
    Ácido acéticoWako017-00251
    Tween-20Sigma-AldrichP1379monolaurato de polioxietilenoorbitano
    Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Wako345-01865
    Leite em pó desnatadoDifco Laboratories232100
    ImmunostarWako291-55203Solução ECL (sensibilidade normal)
    Solução Immunostar LDWako290-69904ECL (alta sensibilidade)
    Solução de coloração CBBcaseira1 g CBB R-250, 50% (v/v) de metanol, 10% (v/v) de ácido acético em 1 L de água MilliQ
    CBB R-250Wako031-17922
    CBB descoloração soluçãocaseira12% (v/v) de metanol, 7% (v/v) de ácido acético em 1 L de água MilliQ
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Anticorpos
    anti-HA anticorpoSigma-Aldrich11583816001Usado em 0,2 μ g/mL para immunoblotting.
    anticorpo anti-Rab10Tecnologia de sinalização celular# 8127Usado em 1: 1000 para immunoblotting.
    A especificidade foi confirmada por CRISPR KO em Ito et al., Biochem J, 2016.
    anti-pSer935 anticorpoAbcamab133450Usado em 1 μ g/mL para immunoblotting.
    anti-LRRK2 anticorpoAbcamab133518Usado em 1 μ g/mL para immunoblotting.
    anticorpo anti-&alfa;-tubulinaSigma-AldrichT9026Usado em 1 μ g/mL para immunoblotting.
    anticorpo anti-GAPDHSanta-Cruzsc-32233Usado a 0,02 μ g/mL para immunoblotting.
    Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch515-035-003Usado a 0.16 μ g/mL para immunoblotting.
    Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-035-003Usado a 0.16 μ g/mL para immunoblotting.
    NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
    Inibidores
    GSK2578215AMedChem ExpressHY-13237A solução-mãe foi preparada em DMSO a 10 mM e armazenada a -80 ° C
    MLi-2Fornecido pelo Dr. Dario Alessi (Universidade de Dundee)A solução de estoque foi preparada em DMSO a 10 mM e armazenada a -80 ° C
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Plasmídeos
    Rab10/pcDNA5 FRT TO HAFornecido pelo Dr. Dario Alessi
    (Universidade de Dundee)    		Este plasmídeo expressa Rab10 humano marcado com HA aminoterminal.
    LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)Ito et al., Bioquímica, 46: 1380– 1388 (2007). Este plasmídeo expressa LRRK2 humano de tipo selvagem marcado com amino-terminal 3xFLAG.
    LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)Ito et al., Bioquímica, 46: 1380– 1388 (2007). Este plasmídeo expressa mutante inativo K1906M amino-terminal de LRRK2 humano marcado com quinase 3xFLAG.
    LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10Este artigo. Este plasmídeo expressa o mutante N1437H FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
    LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963– 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante R1441C FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
    LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963– 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante R1441G FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
    LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963– 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante R1441H FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
    LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10Este artigo. Este plasmídeo expressa o mutante R1441S FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
    LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963– 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante Y1699C FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
    LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963– 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante G2019S FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
    LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10Fornecido pelo Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio)Kamikawaji et al., Bioquímica, 48: 10963– 10975 (2013). Este plasmídeo expressa o mutante I2020T FPD marcado com amino-terminal 3xFLAG de LRRK2 humano.
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Equipamentos
    CO2 IncubadoraThermo Fisher ScientificForma Série II 3110 Pipeta
    DrummondMicropipeta Pipet-Aid PA-400
    P10Nichiryo00-NPX2-100.5– 10 μ
    L Micropipeta P200Nichiryo00-NPX2-20020– 200 μ L
    Micropipeta P1000Nichiryo00-NPX2-1000100- 1000 μ L
    Pontas para micropipeta P10STARRST-481LCRSTPontas estéreis
    para micropipeta P200FUKAEKASEI1201-705YSPontas estéreis
    para micropipeta P1000STARRST-4810BRSTPipeta estéril
    de 5 mL desportávelGreiner606180Pipeta estéril
    de 10 mL desportávelGreiner607180Pipeta desportável estéril
    de 25 mLFalcon357535Hematocitômetro estéril
    Sunlead GlassA126Microscópio Neubeuer aprimorado
    OlympusCKX53
    pratos de 10 cmFalcon353003Para cultura de tecidos
    Placas de 6 poçosAGC Techno Glass3810-006Para cultura
    de tecidosMisturador de vórticeScientific IndustriesVortex-Genie 2
    Sumitomo BaqueliteMS-93100
    Tubos de 1,5 mLSTARRSV-MTT1.5
    Tubos de 15 mLAGC Techno Glass2323-015
    Tubos de 50 mLCentrífugas AGC Techno Glass2343-050
    TOMYMX-307
    Placas de 96 poçosGreiner655061Não para cultura de tecidos
    Leitor de placasMolecular DevicesSpectraMax M2e
    SDS– Tanques PAGENihon EidoNA-1010
    Tanques de transferênciaNihon EidoNA-1510B
    Placas de gel (entalhadas)Nihon EidoNA-1000-1
    Placas de gel (lisas)Nihon EidoNA-1000-2
    Espaçadores de silícioNihon EidoNA-1000-16
    Pentes de 17 poçosNihon EidoFeito
    Clipes de fichárioNihon EidoNA-1000-15
    seringa de 5 mLTerumoSS-05SZ
    21GTerumoNN-2138R
    Power Station 1000 VCATTOAE-8450Fonte de alimentação para SDS– PÁGINA e transferência
    Grandes barcos de pesagemIna OptikaAS-DL
    Recipientes de plásticoASONE PS CASE No.410 x 80 x 50 mm
    Agitadorde balanço TitechNR-10
    Caixa de espuma de estirenogenéricoAs dimensões internas devem caber em um tanque de transferência (200 x 250 x 250 mm).
    ImageQuant LAS-4000GE HealthcareUm gerador de imagens equipado com uma câmera CCD refrigerada para detecção de ECL
    A solução de Papéis de filtro de Automática com Camisa de Água Raspadores de células sob medida

    Referências

    1. Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
    2. Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
    3. Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
    4. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
    5. Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
    6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
    7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
    8. Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
    9. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
    10. Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
    11. Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
    12. Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
    13. West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
    14. Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
    15. Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
    16. Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
    17. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
    18. Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
    19. Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
    20. Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
    21. Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
    22. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
    23. Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519(2011).

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