Este detalhes de protocolo a construção e operação de um microscópio de rastreamento em tempo real 3D única partícula capaz de rastreamento nanoescala fluorescente sondas em alta velocidade difusiva e taxas de contagem de fótons de baixa.
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Artigo de método
Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula
Neste artigo
Resumo
Resumo
Partícula de única tridimensional em tempo real (RT-3D-SPT) de rastreamento tem o potencial de lançar luz sobre os processos rápidos, 3D em sistemas celulares. Apesar de vários métodos de RT-3D-SPT têm sido apresentados nos últimos anos, alta velocidade de rastreamento 3D difusão de partículas em taxas de contagem de fótons de baixa continua a ser um desafio. Além disso, as configurações de RT-3D-SPT são geralmente complexos e difíceis de implementar, limitando sua aplicação generalizada de problemas biológicos. Este protocolo apresenta um sistema de RT-3D-SPT chamado 3D dinâmica fóton localização de rastreamento (3D-DyPLoT), que pode acompanhar a partículas com alta velocidade difusiva (até 20 µm2/s) em taxas de contagem de fótons de baixa (abaixo de 10 kHz). 3D-DyPLoT emprega um defletor de electro-óptica 2D (2D-EOD) e uma lente gradiente acústico sintonizável (TAG) para conduzir um único foco laser ponto dinamicamente em 3D. Combinada com um algoritmo de estimativa de posição otimizada, 3D-DyPLoT pode travar em partículas única com acompanhamento de alta velocidade e localização de alta precisão. Devido à sua excitação única e layout de caminho único deteção, 3D-DyPLoT é robusto e fácil de configurar. Este protocolo discute como construir 3D-DyPLoT passo a passo. Primeiro, o layout óptico é descrito. Em seguida, o sistema é calibrado e otimizado por raster um grânulo de fluorescente 190 nm com o nanopositioner piezoeléctrica de digitalização. Finalmente, para demonstrar o 3D em tempo real, capacidade de rastreamento, grânulos de fluorescente 110 nm são controlados em água.
Introdução
O surgimento de técnicas avançadas de imagem abriu uma janela para ver a estrutura cada vez mais detalhada de fenômenos celulares, todo o caminho até o nível molecular. Métodos como reconstrução óptica estocástico microscopia (Tempestade)1,2,3, localização de foto-ativado microscopia (PALM)4,5,6,7 , estruturada iluminação microscopia (SIM)8,9,10,....
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Protocolo
1. configuração de Layout e alinhamento
- Instalação e colimação de excitação o rastreamento a laser
- Apor o laser à tabela óptico usando um monte de casa construída. A montagem é uma placa de alumínio simples com furos para a cabeça do laser e óptica mesa de montagem. O laser deve ser firmemente presa para um monte de metal para a estabilidade e a dissipação de calor. Para este trabalho, use um 488 nm laser de estado sólido para iluminação (Figura 1), embora o comprimento de onda pode ser selecionado para atender um determinado fluoróforo ou experimentar. Um fator crítico é que o comprimento de onda do laser se encaixa....
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Resultados
Partícula fixa digitalização (Figura 4) e difunde livremente 110 nm fluorescente partícula de controle (Figura 5) foram realizados seguindo o protocolo acima. A digitalização de partícula foi realizada movendo os fótons nanopositioner e bin piezoelétricos enquanto simultaneamente cálculo da partícula calcula a posição em cada ponto no scan. A imagem de varredura mostra um quadrado de intensidade mesmo (figura.......
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Discussão
Embora muitas variedades de 3D única partícula métodos de rastreamento têm surgido nos últimos anos, robusto acompanhamento em tempo real de difusão 3D de alta velocidade em taxas de contagem de fótons de baixa com uma configuração simples ainda é um desafio, o que limita sua aplicação biológica importante problemas. O método 3D-DyPLoT descrito em endereços este protocolo estes desafios de várias maneiras. Em primeiro lugar, as vias de excitação e deteção são simplificadas muito comparado a outras implementações fazendo .......
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Divulgações
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, dos institutos nacionais de saúde, sob número de prêmio R35GM124868 e pela Duke University.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Defletor Eletro-óptico 2D | ConOptics | M310A | 2 |
| necessária Fonte de alimentação para EOD | ConOptics | 412 | Converte saída FPGA para alta tensão para EOD |
| TAG Lente | TAG Optics | TAG 2.0 | Usada para desviar o laser ao longo da direção axial |
| XY piezoelétrico nanoposicionador | MadCity Labs | Nano-PDQ275HS | Usado para mover a amostra para travar a partícula no volume focal objetivo em |
| Z piezoelétrico nanoposiitoner | MadCity Labs | Nano-OP65HS | Usado para mover a lente objetiva para seguir a partícula difusora |
| Micropositioner | MadCity Labs | MicroDrive | Usado para posicionar grosseiramente a amostra e avaliar a lente |
| objetiva | Zeiss | PlanApo | Alta abertura numérica necessária para melhor sensibilidade. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss |
| sCMOS câmera | PCO | pco.edge 4.2 | Usado para monitorar a posição da partícula |
| APD | Excelitas | SPCM-ARQH-15 | Contagens escuras mais baixas benéficas |
| Matriz de portas programáveis em campo | National Instruments | NI-7852r | |
| Software | National Instruments | LabVIEW | |
| Laser de excitação de rastreamento | JDSU | FCD488-30 | |
| Lens | ThorLabs | Lente AC254-150-A-ML | L1 |
| ThorLabs | AC254-200-A-ML | L2 | |
| Pinhole | ThorLabs | P75S | PH |
| Glan-Thompson Polarizador | ThorLabs | GTH5-A | GT |
| Placa de meia onda | ThorLabs | WPH05M-488 | WP |
| Lente | ThorLabs | AC254-75-A-ML | L3 |
| Lente | ThorLabs | Lente AC254-250-A-ML | L4 |
| ThorLabs | AC254-200-A-ML | Lente L5 | |
| ThorLabs | AC254-200-A-ML | L6 | |
| Espelho Dicróico | Chroma | ZT405 / 488/561 / 640rpc | DC |
| Filtro de Emissão de Fluorescência | Chroma | D535 / 40m | F |
| 10/90 divisor de feixe | Chroma | 21012 | BS |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| 190 nm nanopartículas fluorescentes | Bangs laboratories | FC02F / 9942 | |
| 110 nm nanopartículas fluorescentes | Bangs laboratories | FC02F / 10617 | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-545A | |
| Powermeter | Thorlabs | PM100D | |
| CMOS | Thorlabs | DCC1545M | |
| Iris | Thorlabs | SM1D12D | |
| Microscópio | Mad City Labs | RM21 |
Referências
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imagi....
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Reimpressões e permissões
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