Artigo de método

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

DOI:

10.3791/56761

⸱

16 de junho de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

Neste artigo

Resumo

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Um modelo animal é necessário decifrar o papel de células tumorais (CTC) em promover a colonização de pulmão durante a metástase do cancro em circulação. Aqui, nós estabelecemos e realizou com sucesso um na vivo do ensaio para teste especificamente a exigência de assembly de fibronectina poliméricos (polyFN) na CTC para a colonização de pulmão.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metástase é a principal causa de morte por cancro. O papel da circulação de células tumorais (CTC) na promoção de metástases, em que colonização pulmonar por CTC criticamente contribui para primeiros processos de pulmão metastático, foi investigado vigorosamente. Como tal, os modelos animais são a única abordagem que capta o processo completo sistêmico de metástase. Dado que os problemas ocorrem em projetos experimentais anteriores para analisar as contribuições da CTC para extravasamento dos vasos sanguíneos, estabelecemos um ensaio de colonização de pulmão na vivo em que uma célula de longo-prazo-fluorescência-tracer, carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE), era usado para rotular células tumorais suspenso e perfusão pulmonar foi realizada para limpar não especìfica preso CTC antes da remoção do pulmão, imagem latente confocal e quantificação. Polimérica fibronectina (polyFN) montada em superfícies CTC foi encontrada para mediar a colonização de pulmão no estabelecimento final de tecidos de tumor metastático. Aqui, para testar especificamente o requisito de assembly polyFN no CTC para a colonização de pulmão e extravasamento, realizamos a curto prazo suspenso de ensaios de colonização pulmonar em que células de carcinoma de pulmão Lewis (LLCs) expressam estàvel FN-shRNA (shFN) ou scramble-shRNA (shScr) e pre-rotulado com 20 μM de CFSE por via intravenosa foram inoculadas em camundongos C57BL/6. Temos demonstrado com sucesso que as habilidades de shFN células LLC para colonizar os pulmões do mouse foram significativamente reduzidas em comparação com células de shScr LLC. Portanto, esta metodologia a curto prazo pode ser amplamente aplicada para demonstrar especificamente a capacidade do CTC dentro a circulação para colonizar os pulmões.

Introdução

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Metástase é a principal causa de morte de câncer1,2. Células tumorais derivadas de tecidos primários entram a circulação em suspensão e sobrevivem vários desafios hematogênica, por exemplo, anoikis, imunes agressões e danos devido à tensão de cisalhamento de pressão arterial ou restrições geométricas, antes de serem capazes de colonizar órgãos distantes, um passo fundamental a ditar o sucesso de metástase3,4,5,6. Portanto, atualmente foram desenvolvidos esforços vigorosos na caracterização de células tumorais circulantes (CTC) e correlacionando estas características com a malignidade do tumor, metástase e as taxas de sobrevivência de câncer pacientes7,8 , 9. uma vez que o processo de metástase de câncer especificamente retrata um evento na vivo , modelos animais são a única abordagem que capta o processo completo sistêmico de metástase10,11,12 .

CTC-se tecidos de tumor metastático através de vários eventos celulares, incluindo a colonização de órgãos distantes1,2. No entanto, o mais comumente usado metástase ensaios13,14,15 não fornecem uma maneira de observar a colonização de CTC de órgãos distantes. Portanto, um projeto de ensaio na vivo para visualização de colonização do CTC é urgentemente necessária. Embora vários in vivo e ex vivo curto desvantagens, problemas e colonização de pulmão termo ensaios foram projetados permanecem. Por exemplo, enquanto a proteína fluorescência verde (GFP)-tumor superexpressão células têm sido utilizadas nestes ensaios22,23, leva tempo para estàvel transfect e clonar células tumorais com intensidade fluorescente GFP suficiente, sob o microscópio. Da mesma forma, embora transitória de coloração de células tumorais com o marcador de célula de longo prazo CFSE tem sido empregado para substituir as células do tumor-expressando GFP, continua a ser difícil julgar se as células do tumor CFSE-etiquetados são anexadas ou meramente presente dentro do vasculatura do extirpado órgãos distantes16,17.

Polimérica fibronectina (polyFN) montada em superfícies de CTC foi encontrada criticamente, contribuir para o estabelecimento de tumor metastático tecidos18,19,20,21,22 final . Aqui, realizamos a curto prazo pulmão ensaios de colonização na qual suspensos células de carcinoma de pulmão Lewis (LLCs) estàvel expressando FN-shRNA (shFN) ou scramble-shRNA (shScr) e pre-rotulado com CFSE por via intravenosa foram inoculados em camundongos C57BL/6. Após 2-3 dias, pulmões do mouse primeiro foram perfundidos com solução salina tamponada fosfato (PBS) para remover completamente o CTC solto dentro da vasculatura antes de serem submetidos a microscopia confocal e quantificação de pulmão-colonizar LLCs. Mostramos claramente que os números de pulmão-colonizar shFN LLCs e nódulos de tumor foram significativamente reduzidos em comparação com shScr LLCs, corroborando substancialmente o papel do assembly polyFN no CTC facilitar a colonização e crescimento do CTC na pulmões. Nosso estudo garante mais investigação para o papel de polyFN em metástase do cancro.

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Protocolo

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Todas as experiências em ratos foram realizadas de acordo com as orientações do nosso Instituto (guia de cuidados e uso de animais de laboratório, NCKU Medical College).

1. preparação dos instrumentos, meios de cultura e pratos

  1. Antes de iniciar os protocolos experimentais, obter suturas cirúrgicas estéril, seringas de 1 mL com agulha 26G/0,5 cm (para injeção de veia cauda), seringas de 3 mL com agulha de 24G/cm 3 (para perfusão do pulmão), modificado águia Media (DMEM de Dulbecco), solução do trypsin-EDTA (5 tripsina g/L e 0,53 mM), soro bovino fetal (FBS), 1X PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mm at2PHO4e 1,8 mM KH2PO4) e pratos de cultura de 6 cm.

2. preparação e recuperação de células tumorais em suspensão

  1. Prepare-se modificado águia Media (DMEM de estéril Dulbecco) contendo 10% ou 20% FBS e recentemente adicionar 2 mM L-glutamina, 1X PBS e 0,05% Trypsin-EDTA.
  2. Cultura de células em DMEM suplementado com 10% FBS a 37 ° C e cultivá-las até que haja uma confluência de 70-80% da placa de cultura.
  3. Retire os pratos, seguidos de duas lavagens com 2 mL de PBS estéril 1 x os meios de cultura (DMEM).
  4. Adicionar 1 mL de 0.05% Trypsin-EDTA para os pratos para cobrir completamente todas as células. Imediatamente remover 800 μL de solução e deixar apenas 200 μL nos pratos. Incubar os pratos a 37 ° C por 30 s a 1 min (dependendo do tipo de célula) e espere até que a maioria das células estão no estado suspenso.
  5. Adicionar 1 mL de DMEM fresco contendo 10% FBS directamente para os pratos de parar a atividade enzimática da tripsina e vigorosamente Pipetar a suspensão de células acima e para baixo com uma pipeta de 1000 µ l para preparar uma suspensão de célula única.
  6. As células de transferência do prato para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e spin para baixo as células à temperatura ambiente a 162 x g, durante 3 min.
  7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o tumor de células em 1,5 mL DMEM contendo 20% FBS e extremidade-sobre-extremidade girar as células em suspensão a 37 ° C por 2 h.
    Nota: Se o meio fica amarelo durante a recuperação, trocar o antigo médio com meio fresco contendo 20% FBS.

3. fluorescência de coloração e a análise de células tumorais em suspensão com Carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE)

  1. Após a recuperação de células em suspensão, contar o número de células viáveis apropriado com Trypan azul em uma contagem câmara para titulada a fluorescência de coloração doses de Neubauer e cauda veia injeção.
  2. Gire para baixo as células a 162 x g em temperatura ambiente por 3 min e ressuspender esterilizados de peletizadas células em 1 mL de 1X PBS, seguido por centrifugação de temperatura a 162 x g, durante 3 min.
  3. Ressuspender as células peletizadas em 500 µ l de 1X PBS contendo 10% FBS e 0, 5, 10, 20 ou 40 µM CFSE para titulação de dose e incube a suspensão de célula 37 oC por 10 min no escuro.
  4. Gire para baixo as células a 162 x g, à temperatura ambiente por 3 min e ressuspender as células peletizadas com 4 mL de DMEM contendo 1% FBS. Repita essa etapa de lavagem mais três vezes. Ressuspender as células peletizadas com 4 mL de DMEM sozinho para a lavagem final.
  5. Submeter as células CFSE-etiquetadas a fluorescência-ativado da pilha classificação análise (FACS) para quantificar a intensidade de fluorescência de uma única célula, ou injeção de veia da cauda.
    Nota: Manter as células no gelo antes de realizar as injeções de veia de FACS análise ou cauda.

4. pulmão colonização ensaio

  1. Preparar as células rotuladas com 20 µM CFSE (consulte 3.1 etapas através de 3.4).
    Nota: Decidir a dose de trabalho de CFSE para rotulagem de células tumorais, baseadas nos resultados de titulação, a partir da análise de FACS (consulte a etapa 3.3).
  2. Aquecer as caudas de 4-6 semana-velho macho C57BL/6 ratos (6 ratos) com uma lâmpada de iodetos durante 5-10 min em uma base por-do rato para dilatar as veias de cauda de rato.
  3. Homogeneizar bem e Aspire células tumorais CFSE-rotulado com uma seringa de 1 mL (26Gx1/2), evitando quaisquer bolhas na suspensão de célula (com uma densidade celular final de 5 x 106 células/mL).
  4. Cuidadosamente, injetar 1 x106 células de tumor CFSE-etiquetadas em 200 µ l de DMEM na veia de cauda de rato, que deve ser apresentada em uma retenção de rato.
    Nota: Durante a injeção, se a agulha é colocada diretamente no lúmen da veia da cauda, células tumorais devem ser facilmente entregues na circulação sem a necessidade de dar o máximo na seringa. Se é difícil para as células do tumor através de empurrar, eles provavelmente foram injetados fora da veia da cauda, no espaço subcutâneo.
  5. Dividir os ratos que receberam por via intravenosa as células do tumor CFSE-etiquetadas em dois grupos: um grupo passará por perfusão pulmonar, seguida por microscopia confocal e quantificação do ImageJ em ensaio de colonização o pulmão e o outro será deixada sozinho para 4-5 semanas na colonização de pulmão de longo prazo do ensaio.
  6. Em 20, 38 ou 45 h e com 1 x 106 células de tumor injetadas por via intravenosa durante uma titulação de curso e dose-dependente do tempo, anestesiamos tumor-rolamento ratos com 50-75 mg/kg zoletil 50, que é um bem aceita e adequada anesthetizer23.
    Nota: Uso veterinário pomada olhos de ratos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
  7. Corte longitudinalmente a pele e subcutâneo do abdome para a região do peito com uma tesoura cirúrgica. Abra a cavidade pleural com tesoura cirúrgica e fórceps para expor totalmente o coração e os pulmões.
    Nota: Tenha cuidado para evitar cortar os vasos sanguíneos.
  8. Amarre a veia cava superior (SVC) e a veia cava inferior (VCI) com suturas cirúrgicas estéril para evitar o refluxo da solução de perfusão durante a perfusão pulmonar.
  9. Corte a parede do ventrículo esquerdo com uma tesoura cirúrgica para abrir uma fissura (cerca de 2-4 mm) para drenar a solução de perfusão dos pulmões.
  10. Injetar o ventrículo direito com uma seringa de 3 mL 1X PBS e remover a solução drenada com sucção constante durante a perfusão pulmonar até aos pulmões recorrer de uma cor avermelhada completamente pálido.

5. confocal imagem microscópica e a análise de células tumorais de pulmão-colonizado

  1. Remover os pulmões agora-pálido da cavidade pleural e separar os cinco lóbulos cortando os ligamentos da traqueia e do tecido conjuntivo com de tesoura e pinça cirúrgica24.
  2. Prepare um suporte de maca-como pulmão como mostrado na Figura 3B enrolando uma sutura de nylon em torno de duas hastes de metal para produzir uma textura reticulada, com um espaço entre as duas hastes para a colocação dos lobos do pulmão. Defina o titular do pulmão em um prato de 6 cm.
    Nota: O titular do pulmão será usado para estabilizar os lóbulos pulmonares debaixo da lente objetiva de um microscópio confocal.
  3. Apresentar e fixar os lóbulos pulmonares na textura reticulada do titular do pulmão. Cubra e Umedeça os lóbulos pulmonares com 1X PBS.
  4. O prato de 6cm cultura, abrigando os lóbulos pulmonares no suporte do pulmão para microscopia confocal para capturar imagens de fluorescência gravando as células do tumor de pulmão-colonização de assunto.
  5. Para a imagem latente, usar lentes objetivas (5 X, MPLN, Nd: 0.1, WD: 20, ar).
  6. Gire a roda de filtro para NIBA (excitação/emissão; 470-495 nm/510-550 nm) e com 488 nm laser para excitar CFSE, claramente visualizar imagens de pontos de fluorescência dos lóbulos pulmonares.
  7. Gire a roda de filtro para R690 (para MaiTai HP DeepSee laser) para digitalizar com 2.0 µs/pixel digitalização acelerar e otimizar o HV, ganho e deslocamento níveis.
  8. Capturar imagens de fluorescência (512 x 512 pixels) usando o software de microscópio com um 10 µs/pixel, velocidade de digitalização.
  9. Quantificar e analisar estatisticamente as imagens microscópicas usando o ImageJ e GraphPad software como descrito anteriormente,21.

6. a longo prazo os ensaios de colonização do pulmão

Nota: Repita os passos 4.1 através de 4.5.

  1. Sacrificar os ratos após inoculação de células de tumor por 4-5 semanas e consertar seus pulmões com líquido de Bouin25 para 1 a 2 dias.
  2. Quantificar e analisar estatisticamente os nódulos de tumor dos pulmões de ratos com software21.

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Resultados

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Antes de realizar o ensaio de colonização de pulmão na vivo como ilustrado na figura 1A , para testar se polyFN em células tumorais suspenso Medeia colonização pulmonar e/ou extravasamento na facilitação de metástase, nós primeiro titulado diferentes concentrações de CFSE, um composto fluorescente que é a célula permeável e covalentemente conjuga intracelulares contendo amina moléculas26,27 e...

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Discussão

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Juntamente com longo prazo pulmonar colonização ensaios, a curto prazo, metodologia que utilizamos aqui para avaliar na vivo pulmonar colonização por CTC em órgãos distantes claramente revelada e diferenciado o papel específico de polyFN montado no CTC da colonização os pulmões, que em seguida levaram o extravasamento e processos metastáticos18,19,20,21. Apesar de rotulagem células com...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Os autores desejam agradecer Dr. Chang Ming-Min e MS. Ya-Hsin Cheng pelo apoio técnico. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia de Taiwan (a maioria-103-2325-B-006-009, a maioria-104-2325-B-006-001, a maioria-105-2325-B-006-001 e MOST-106-2320-B-006-068-MY3) e o Ministério da saúde e bem-estar (MOHW106-TDU-B-211-144004). Agradecemos também o apoio do laboratório de pesquisa do núcleo da faculdade de medicina, Universidade Nacional de Cheng Kung, seu microscópio confocal multi fóton.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material
Albumina de soro bovino ( BSA)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-9048-46-8
Bouin's FluidMCC(medical chemical corporation)/POISON456-A-1GL
CFSE Proliferação Dyeebiosciences65-0850-85Nome completo: Carboxifluoresceína éster succinimidílico
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) (Gibco)ThermoFisher Scientific12100-061
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-6381-92-6Para solução preparada de tripsina-EDTA (concentração final: 0.53mM) 
Soro fetal bovino (FBS)(Gibco)ThermoFisher Scientific10437-028
Lewis carcinoma de pulmão (LLC)ATCC, Manassas, VA, EUACRL-1642
L-Glutamina, USP (Gibco) ThermoFisher Scientific21051-024
Cloreto de potássio (KCl)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-7447-40-7Para preparado 1X PBS (concentração final: 2,7 mM)
Fosfato de potássio monobásico (KH2< / sub>PO4< / sub>)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-7778-77-0Para preparado 1X PBS (concentração final: 1,8 mM)
Sódio cloreto (NaCl)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-7647-14-5Para preparado 1X PBS (concentração final: 137mM)
Fosfato de sódio dibásico (Na2< / sub>HPO < sub > 4< / sub>)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-10039-32-4Para preparado 1X PBS (concentração final: 10mM )
Trypan BlueSigma AldrichT61460,5 g misture com 100 mL 1X PBS
TripsinaSigma AldrichT4799Para solução preparada de tripsina-EDTA (concentração final: 5g/L)
Zoletil 50VirbacPara diluir com 1X PBS 
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento
Centrífuga de mesa compacta 2420KUBOTA Co.2420
Prato de cultura (6cm)Wuxi NEST Biotechnology Co.
Seringa descartável (com agulha)Perfect Medical Industry Co.24G/3 cm;3 ml & 26G/0,5 cm;1 ml
Misturador de ponta a pontaC.T.I YOUNG CHENNTS-20Para recuperação de células suspensas 
FACSCalibur (FACS)BD biosciences
FórcepsDimeda10.102.14
Forma Direct Heat CO2 incubadoraThermo Fisher Scientific Inc.HEPA CLASS 100
Limitador de Mouse (Limitador Cilíndrico 15-30 gm)Stoelting51338
Microscópio Confocal Multifotônico BX61WICâmaraOlympus FV1000MPE
NeubauerMarienfeld-Superior640010
Tesoura cirúrgicaDimeda08.370.11
Suturas cirúrgicas UNIK SUTURAS CIRÚRGICAS MFG. CO.NO. 0034Seda trançada preta; não absorvível (25YD; USP 4/0)
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLWuxi NEST Biotechnology Co.
Tubo Greiner de 15 mLGreiner bio-one188271
705001 de contagem 615001

Referências

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  1. Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
  4. Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  5. Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687(2017).
  6. Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
  7. Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  8. Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44(2016).
  9. Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
  10. Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
  11. Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
  12. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680(2016).
  13. van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
  14. Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
  15. Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
  16. von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
  17. Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
  18. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
  19. Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
  20. Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
  21. Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72(2017).
  22. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
  23. Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
  24. Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162(2012).
  25. Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
  26. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  27. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  28. Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
  29. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  30. Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
  31. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  32. Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344(2017).
  33. Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152(2016).
  34. Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555(2016).
  35. Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
  36. Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
  37. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  38. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  39. Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
  40. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  41. Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
  42. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  43. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  44. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  45. Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30(2014).
  46. Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
  47. Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678(2015).
  48. Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
  49. Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
  50. Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
  51. Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796(2015).
  52. Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
  53. Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
  54. Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
  55. Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
  56. Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
  57. Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
  58. Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
  59. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  60. Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
  61. Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
  62. Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18(2012).

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