Um modelo animal é necessário decifrar o papel de células tumorais (CTC) em promover a colonização de pulmão durante a metástase do cancro em circulação. Aqui, nós estabelecemos e realizou com sucesso um na vivo do ensaio para teste especificamente a exigência de assembly de fibronectina poliméricos (polyFN) na CTC para a colonização de pulmão.
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Artigo de método
O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação
Neste artigo
Resumo
Resumo
Metástase é a principal causa de morte por cancro. O papel da circulação de células tumorais (CTC) na promoção de metástases, em que colonização pulmonar por CTC criticamente contribui para primeiros processos de pulmão metastático, foi investigado vigorosamente. Como tal, os modelos animais são a única abordagem que capta o processo completo sistêmico de metástase. Dado que os problemas ocorrem em projetos experimentais anteriores para analisar as contribuições da CTC para extravasamento dos vasos sanguíneos, estabelecemos um ensaio de colonização de pulmão na vivo em que uma célula de longo-prazo-fluorescência-tracer, carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE), era usado para rotular células tumorais suspenso e perfusão pulmonar foi realizada para limpar não especìfica preso CTC antes da remoção do pulmão, imagem latente confocal e quantificação. Polimérica fibronectina (polyFN) montada em superfícies CTC foi encontrada para mediar a colonização de pulmão no estabelecimento final de tecidos de tumor metastático. Aqui, para testar especificamente o requisito de assembly polyFN no CTC para a colonização de pulmão e extravasamento, realizamos a curto prazo suspenso de ensaios de colonização pulmonar em que células de carcinoma de pulmão Lewis (LLCs) expressam estàvel FN-shRNA (shFN) ou scramble-shRNA (shScr) e pre-rotulado com 20 μM de CFSE por via intravenosa foram inoculadas em camundongos C57BL/6. Temos demonstrado com sucesso que as habilidades de shFN células LLC para colonizar os pulmões do mouse foram significativamente reduzidas em comparação com células de shScr LLC. Portanto, esta metodologia a curto prazo pode ser amplamente aplicada para demonstrar especificamente a capacidade do CTC dentro a circulação para colonizar os pulmões.
Introdução
Metástase é a principal causa de morte de câncer1,2. Células tumorais derivadas de tecidos primários entram a circulação em suspensão e sobrevivem vários desafios hematogênica, por exemplo, anoikis, imunes agressões e danos devido à tensão de cisalhamento de pressão arterial ou restrições geométricas, antes de serem capazes de colonizar órgãos distantes, um passo fundamental a ditar o sucesso de metástase3,4,5,6. Portanto, atualmente foram desenvolvidos esforços vigorosos na....
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Protocolo
Todas as experiências em ratos foram realizadas de acordo com as orientações do nosso Instituto (guia de cuidados e uso de animais de laboratório, NCKU Medical College).
1. preparação dos instrumentos, meios de cultura e pratos
- Antes de iniciar os protocolos experimentais, obter suturas cirúrgicas estéril, seringas de 1 mL com agulha 26G/0,5 cm (para injeção de veia cauda), seringas de 3 mL com agulha de 24G/cm 3 (para perfusão do pulmão), modificado águia Media (DMEM de Dulbecco), solução do trypsin-EDTA (5 tripsina g/L e 0,53 mM), soro bovino fetal (FBS), 1X PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mm at2PHO4e 1,8 m....
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Resultados
Antes de realizar o ensaio de colonização de pulmão na vivo como ilustrado na figura 1A , para testar se polyFN em células tumorais suspenso Medeia colonização pulmonar e/ou extravasamento na facilitação de metástase, nós primeiro titulado diferentes concentrações de CFSE, um composto fluorescente que é a célula permeável e covalentemente conjuga intracelulares contendo amina moléculas26,27 e.......
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Discussão
Juntamente com longo prazo pulmonar colonização ensaios, a curto prazo, metodologia que utilizamos aqui para avaliar na vivo pulmonar colonização por CTC em órgãos distantes claramente revelada e diferenciado o papel específico de polyFN montado no CTC da colonização os pulmões, que em seguida levaram o extravasamento e processos metastáticos18,19,20,21. Apesar de rotulagem células com.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores desejam agradecer Dr. Chang Ming-Min e MS. Ya-Hsin Cheng pelo apoio técnico. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia de Taiwan (a maioria-103-2325-B-006-009, a maioria-104-2325-B-006-001, a maioria-105-2325-B-006-001 e MOST-106-2320-B-006-068-MY3) e o Ministério da saúde e bem-estar (MOHW106-TDU-B-211-144004). Agradecemos também o apoio do laboratório de pesquisa do núcleo da faculdade de medicina, Universidade Nacional de Cheng Kung, seu microscópio confocal multi fóton.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Albumina de soro bovino ( BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-9048-46-8 | |
| Bouin's Fluid | MCC(medical chemical corporation)/POISON | 456-A-1GL | |
| CFSE Proliferação Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Nome completo: Carboxifluoresceína éster succinimidílico |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-6381-92-6 | Para solução preparada de tripsina-EDTA (concentração final: 0.53mM) |
| Soro fetal bovino (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
| Lewis carcinoma de pulmão (LLC) | ATCC, Manassas, VA, EUA | CRL-1642 | |
| L-Glutamina, USP | (Gibco) ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7447-40-7 | Para preparado 1X PBS (concentração final: 2,7 mM) |
| Fosfato de potássio monobásico (KH2< / sub>PO4< / sub>) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7778-77-0 | Para preparado 1X PBS (concentração final: 1,8 mM) |
| Sódio cloreto (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7647-14-5 | Para preparado 1X PBS (concentração final: 137mM) |
| Fosfato de sódio dibásico (Na2< / sub>HPO < sub > 4< / sub>) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-10039-32-4 | Para preparado 1X PBS (concentração final: 10mM ) |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0,5 g misture com 100 mL 1X PBS |
| Tripsina | Sigma Aldrich | T4799 | Para solução preparada de tripsina-EDTA (concentração final: 5g/L) |
| Zoletil 50 | Virbac | Para diluir com 1X PBS | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento | |||
| Centrífuga de mesa compacta 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
| Prato de cultura (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | ||
| Seringa descartável (com agulha) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0,5 cm;1 ml | |
| Misturador de ponta a ponta | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | Para recuperação de células suspensas |
| FACSCalibur (FACS) | BD biosciences | ||
| Fórceps | Dimeda | 10.102.14 | |
| Forma Direct Heat CO2 incubadora | Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
| Limitador de Mouse (Limitador Cilíndrico 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
| Microscópio Confocal Multifotônico BX61WI | Câmara | Olympus FV1000MPE | |
| Neubauer | Marienfeld-Superior | 640010 | |
| Tesoura cirúrgica | Dimeda | 08.370.11 | |
| Suturas cirúrgicas | UNIK SUTURAS CIRÚRGICAS MFG. CO. | NO. 0034 | Seda trançada preta; não absorvível (25YD; USP 4/0) |
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | Wuxi NEST Biotechnology Co. | ||
| Tubo Greiner de 15 mL | Greiner bio-one | 188271 |
Referências
- Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K.
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Reimpressões e permissões
