Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

Resumo

Organoids cerebrais representam um novo sistema de modelo para investigar mais cedo cérebro humano desenvolvimento em vitro. Este artigo fornece a metodologia detalhada para gerar eficientemente organoids dorsal homogênea do prosencéfalo-tipo de células-tronco pluripotentes induzidas humano incluindo passos críticos de caracterização e validação.

Resumo

O córtex humano é altamente expandido e apresenta uma estrutura complexa com áreas funcionais específicas, fornecendo a função cerebral, tais como a cognição. Esforços para estudar o desenvolvimento do córtex cerebral humano tem sido limitados pela disponibilidade de sistemas modelo. Traduzir os resultados de estudos de roedores para o sistema humano é restrito por diferenças de espécies e estudos sobre tecidos humanos primários são dificultados pela falta de disponibilidade de tecidos, bem como as preocupações éticas. Recente desenvolvimento na tecnologia de células-tronco (PSC) pluripotentes humanas incluem a geração de tridimensional (3D) auto-organização organotypic sistemas de cultura, que imitam a uma certa medida cérebro humano específico desenvolvimento em vitro. Atualmente, vários protocolos estão disponíveis para a geração de todo o cérebro ou organoids específicas de região do cérebro. O método para a geração de organoids homogênea e reprodutíveis prosencéfalo-tipo de induzido CPS (iPSC), que nós previamente estabelecido e descreve aqui, combina a capacidade intrínseca do PSC para se auto-organizar com diferenciação guiada em direção a linhagem neuroectodérmico anterior e matriz de incorporação para apoiar a formação de um neuroepithelium contínuo. Mais especificamente, este protocolo envolve: (1) a geração de agregados de iPSC, incluindo a conversão de iPSC colônias para uma cultura de monocamada confluente; (2) a indução de neuroectoderma anterior; (3) a incorporação de agregados neuroectodérmico em um andaime de matriz; (4) a geração de prosencéfalo-tipo organoids de neuroectodérmico agregados; e (5) a fixação e a validação do prosencéfalo-tipo organoids. Como tal, este protocolo fornece um sistema facilmente aplicável para a geração de tecido de cortical iPSC-derivado padronizada e reprodutível estruturas em vitro.

Introdução

O cérebro humano é claramente um dos órgãos mais complexos e é responsável por todas as capacidades intelectuais humanas. Assim, uma compreensão mais profunda do desenvolvimento do cérebro humano específico é um pré-requisito fundamental para a compreensão das habilidades cognitivas humanas. Tradicionalmente, os animais transgénicos serviram como organismos modelo para estudar o desenvolvimento do cérebro. Estes modelos fornecidos insight fundamental sobre os princípios do desenvolvimento do cérebro. Agora sabemos que uma característica comum do desenvolvimento do cérebro em todos os mamíferos é uma coreografia precisa de proliferação do progenitor, neurogênese e migração neuronal. Existem, no entanto, diferenças estruturais significativas entre os cérebros dos organismos-modelo, como roedores e seres humanos, especialmente no neocórtex. Os principais mecanismos que têm sido propostos para contribuir para a evolução cortical de primatas são uma maior proliferação de células estaminais e progenitoras, bem como a geração de células de glia radial exterior (oRGCs), que só muito raramente são encontrados em roedores^{1 ,2,3}.

Métodos para o desenvolvimento do córtex cerebral humano modelo incluem a geração de células progenitoras tele-encefálico PSC-derivados e os neurônios de projeção do córtex cerebral como culturas monocamada. Estas padronizado diferenciação protocolos repetição de certos aspectos do desenvolvimento cortical humano, tais como a ordem temporal estereotipada da neurogênese cortical⁴. Eles, no entanto, deixam a desejar quando se trata da recapitulação dos processos de desenvolvimento de organogênese como modelação espacial e morfogênese. Desenvolvimentos mais recentes na biologia de células-tronco levaram ao estabelecimento das culturas de organoides 3D de EPS, que estão revolucionando a pesquisa de em vitro organogênese humana. Utilizando a capacidade das EPS para se auto-organizar em estruturas organotypic, vários organoids, que reflectem a chaves propriedades estruturais e funcionais dos órgãos, incluindo os de rim, intestino, o olho e o cérebro foram estabelecidas⁵. Tais organoids contêm vários subtipos celulares específicas do órgão, que agrupam e organizam espacialmente muito semelhante para os órgãos em desenvolvimento na vivo^5,6. Além disso, composição celular, relação de linhagem e gene estudos de rede usando a sequenciação do ARN monocelulares revelaram que organoids cerebrais humanos fielmente recapitular os principais aspectos do desenvolvimento humano fetal neocórtex, tais como programas de expressão do gene ^{7 , 8}. uma grande desvantagem, que impediu a sua ampla aplicação até agora, foi, no entanto, a grandes variações de lotes e heterogeneidade de organoides organoides-para⁹.

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para um sistema de cultura de organoides prosencéfalo-tipo simples e padronizada. A principal característica deste sistema é que ele eficientemente e reproducibly gera PSC-derivado organoids da identidade tele-encefálico dorsal quase exclusiva. O protocolo é baseado sobre os métodos utilizados em nossos últimos Relatórios de célula papel¹⁰. Combina a capacidade de auto-organização das iPSCs com indução seletiva de neuroepithelium cortical e robustamente pode gerar culturas homogêneas de tecido tele-encefálico dorsal cedo dentro de 3 semanas. O protocolo baseia-se a sinalização de SMAD relatado anteriormente e a estratégia de inibição de Wnt que orienta a diferenciação do PSC para o anterior neuroectodérmico linhagem^11,12 em combinação com matriz de incorporação, que promove a formação de estruturas de grande e contínuo neuroepithelial¹³. Nós usaram com sucesso o método descrito em várias linhas de iPSC, com vários clones por indivíduo. Nós mostramos que este sistema é adequado para aplicações a jusante, em que a reprodutibilidade e homogeneidade são muito importantes, tais como modelagem de doença. Quando aplicando o protocolo iPSCs provenientes de pacientes que sofrem de uma grave malformação cortical, pudemos recapitular as características patológicas da doença em vitro e identificar novos mecanismos moleculares levando a fenotípica altera¹⁰. Sugerimos que o protocolo de organoides descritos pode ser utilizado para fechar a lacuna entre as culturas de monocamada cortical PSC-derivado de reducionista e estudos em vivo , e que representa um sistema fiável e estável baseada em célula modelo para simular mais cedo desenvolvimento cortical humano na saúde e na doença, fora do corpo humano.

Protocolo

1. geração de agregados de iPSC

1. Geração de culturas de célula única monocamada de colônias de iPSC
   1. Prepare um prato de 6-poços de extrato (BME) revestido de membrana basal. Descongelar o BME no gelo a 4 ° C, durante 2-3h, dilui-lo com modificado águia médio F12 de frio Dulbecco (DMEM-F12; 01:50 diluição), cobrir a placa com 1ml/bem da solução diluída BME e armazenar a placa durante a noite a 4 ° C.
   2. Aspire o meio e lave colônias de iPSC intacta de pelo menos 2 poços de uma placa de 6 com 0,5 mM de EDTA na salina tamponada fosfato (PBS) duas vezes antes de incubação colónias com 0,5 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS por 4 min em temperatura ambiente (RT). Aspirar a solução de EDTA e delicadamente, separe as colônias lavando-os no fundo do prato com 5 mL de meio DMEM-F12. Pelota-lhes por centrifugação (4 min x 1.200 g em RT) e cobrá-los em um tubo de 15 mL.
      Nota: iPSCs reprogramado de fibroblastos comercialmente disponíveis tem sido usado com sucesso¹⁰.
   3. Aspirar o sobrenadante e incubar as colônias de iPSC com 500 µ l de reagente de célula-dissociação para 6 min a 37 ° C.
   4. Pipetar a suspensão celular várias vezes suavemente para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL para invadir células únicas restantes aglomerados de células.
   5. Adicione 4 mL de DMEM-F12 para a suspensão de células para diluir o reagente de célula-dissociação.
   6. Girar as células para baixo a 1.200 x g durante 4 min em RT
   7. Ressuspender as células em 2 mL de iPSC suplementado com 5 µM Y-27632 e semente de células em um poço de uma placa de 6 BME revestido.
      Nota: Utilize o meio de iPSC especificado na Tabela de materiais para culturas de iPSC uma monocamada de célula única.
   8. No dia seguinte, substitua o meio fresco iPSC médio falta Y-27632. A partir daí, continue a cultura das células, alterando o meio todos os dias até iPSCs são 100% confluente. Dependendo da linhagem celular e a confluência dos poços de partida, isto vai demorar entre 2 a 4 dias.
   9. Uma vez confluente, passagem as iPSCs. Aspire médio e aplicar 500 µ l de reagente de dissociação de célula nas células.
   10. Incube as celulas por 5-10 min a 37 ° C. Suavemente agitar a placa para separar as células.
   11. Lavam-se as células do poço usando 2 mL de DMEM-F12 e cobrá-los em um tubo de 15 mL. Adicione DMEM-F12 para um volume total de 5 mL.
   12. Gire para baixo as células a 1.200 x g durante 4 min em RT e aspirar o sobrenadante.
   13. As células da semente em iPSC suplementado com 5 µM, Y-27632 em um 1:2 a proporção de 1:4 em um BME revestido placa 6 (2 mL/poço do meio).
   14. Continue a cultura as células por 2-5 dias e alterar iPSC médio falta Y-27632 todos os dias. Uma vez confluente, passagem iPSCs (1.1.4-1.1.8 de passos).
       Nota: O iPSCs pelo menos 2 passagens da cultura como uma monocamada na meio de iPSC especificado na Tabela de materiais antes de usá-los para a geração de iPSC agregados para permitir que as células para se adaptar as condições de cultura.
2. Usam as culturas de iPSC monocamada quando são confluente de 70-90% para a geração de agregados de iPSC.
   Nota: iPSC adaptado para as condições de cultura como células únicas são menos propensas ao estresse que leva à morte celular durante o procedimento de dissociação e agregação. Culturas de iPSC monocamada precisam exibir morfologia típica pluripotentes sem evidência de diferenciação. Teste as culturas em uma base regular para a contaminação de micoplasma. Trabalhar apenas com culturas de iPSC livre de micoplasma.
   1. Aspire o meio de cultura de um poço de uma placa de 6 e aplicar 500 µ l de reagente de dissociação de célula nas células.
   2. Incube as celulas por 5-10 min a 37 ° C. Suavemente agitar a placa para separar as células.
   3. Lavam-se células do poço usando 2 mL de DMEM-F12 e cobrá-los em um tubo de 15 mL. Adicione DMEM-F12 para um volume total de 10 mL.
   4. Para a contagem de células, tome 25 µ l da suspensão de células e misturá-lo com 25 µ l de trypan azul para marcar as células mortas. Conte as células vivas, utilizando uma câmara de contagem.
   5. Colete suficiente células (4.500 por agregação de iPSC) da suspensão de células em um tubo de 15 mL.
   6. Gire para baixo as células a 1.200 x g durante 4 min em RT e aspirar o sobrenadante.
   7. Ressuspender as células em um volume adequado de iPSC suplementado com 50 µM Y-27632 obter 4.500 células vivas por 150 µ l.
      Nota: Usando uma alta concentração de Y-27632 (50 µM) é fundamental para a sobrevivência das iPSCs.
   8. Placa de 150 µ l em cada um bem de uma baixo-anexo 96 poços U-parte inferior da placa e coloque-o na incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂.
      Nota: Ao gerar agregados de iPSC, considere-se que pelo menos 6 organoids são necessários para o controle de qualidade no dia 20 (ver secção 5).

2. indução de neuroectoderma Anterior

1. Acompanhar de perto as alterações da morfologia dos agregados iPSC todos os dias sob o microscópio de cultura de tecidos utilizando um 4 X ou lente de poder X 10. Observe-se no dia 1, agregados de células com bordas claras. Continue a agregados de iPSC cultura na incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂.
   Nota: Um certo número de células/poço morto é normal e não afectará a geração de organoides.
2. Alimente os agregados de iPSC, a partir de dia 2 e continuando com todos os outros dias, aspirando suavemente aproximadamente 2/3 do meio sem perturbar os agregados de células na parte inferior. Adicione um adicionais 100 µ l de meio de iPSC falta Y-27632.
   Nota: Dentro de 4 a 6 dias os agregados de células serão 350-450 µm de diâmetro e apresentam bordas lisas.
3. Nesta fase, piscina a célula agrega com uma ponta de pipeta corte 100 µ l em um prato de baixo-anexo 6 cm (máximo de 20 agregados/prato) meio de indução cortical contendo DMEM-F12 com suplemento de N2 (1: 200), suplemento de B27 (1: 100), glicose (0,2 mg/mL), cíclico adenosina monofosfato (cAMP; 0,15 µ g/mL), 0,5% não aminoácidos essenciais (timina), 1% L-alanil-L-glutamina, heparina (10 µ g/mL) e os compostos LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) e inibidor da resposta de Wnt-1 (IWR-1) (10 µ g/mL). Alimente os agregados celulares, alterando o meio de indução cortical 3 dias depois transferi-las para o prato de 6 cm.
4. Acompanhar de perto as alterações morfológicas durante a indução cortical sob o microscópio de cultura de tecido usando uma lente de poder X 4.
   Nota: Depois de 4-5 dias no meio de indução cortical, bordas dos agregados celulares devem começar a alegrar-se na superfície, indicando neuroectodérmico diferenciação. Nesta fase, a organização radial de um epitélio pseudoestratificado emerge. Prossiga para a seção 3 para incorporar os agregados de células em uma matriz BME.

3. incorporação de neuroectodérmico agrega em um andaime de Matrix

1. Descongele o BME no gelo a 4 ° C, durante 2-3 h alíquota BME não diluído em quantidades suficientes.
2. Prepare uma folha de filme plástico de parafina para o procedimento de incorporação. Corte o filme plástico parafina usando uma tesoura esterilizada em 4 x 4 cm grande pedaços, coloque um pedaço de plástico filme de parafina sobre uma bandeja de ponta vazia 100 µ l para 100 dicas µ l e pressione com um dedo protegido por luva para que pequenas covinhas na folha de filme plástico parafina são criadas (1 di mple/célula agregada necessária). Limpar o filme plástico de parafina com etanol a 70% e a irradiação com luz UV (potência: 15 watts, comprimento de onda: 435 nm) sob o banco fechado estéril por 30 min.
3. Transferi cada agregado de célula para uma covinha da folha de filme plástico parafina usando uma dica de corte de 100 µ l com 1,5 a 2 mm de diâmetro de abertura. No caso que dois agregados de células são fundidos, não separá-los, mas transferi-los juntos para uma covinha.
4. Aspire suavemente o meio circundante os agregados de células usando uma ponta da pipeta sem cortes 100 µ l.
   Nota: Tenha cuidado para não chupar os agregados de células na ponta, pois isto danificará os agregados.
5. Adicione 40 µ l de BME não diluído para cada agregado de células.
6. Posição de cada célula agregada no meio o BME drop usando uma ponta de pipeta de 100 µ l sem cortes.
   Nota: Tenha muito cuidado para não prejudicar o desenvolvimento neuroepithelium com a ponta da pipeta.
7. Cuidadosamente, transferir a folha de filme plástico parafina usando Pinças esterilizadas em uma placa de Petri de 10 cm (ou outro prato de cultura de células suficientes) e colocar a cápsula na incubadora para 15-20 min permitir que o BME solidificar.
8. Enquanto isso, prepare um prato de baixo-anexo 6 cm contendo 5 mL de meio de indução cortical.
9. Após a polimerização do BME, remova as gotículas contendo os agregados de células da folha de filme plástico de parafina. Vire o filme plástico parafina usando Pinças esterilizadas e apertar suavemente os agregados de células para o ligeiramente inclinado (cerca de 30 °) prato de baixo-anexo 6 cm até as gotas caem fora da folha de filme plástico de parafina. Transferi um máximo de 16 agregados de células para uma placa de 6 cm.
10. Continuar a incubar os agregados de células a 37 ° C.

4. geração de prosencéfalo-tipo Organoids de agregados neuroectodérmico

1. Um dia após a incorporação em uma matriz BME, coloque pratos de cultura organoides num agitador de cultura celular balanço com um ângulo de inclinação de 5 ° e 14 rpm, instaladas em uma incubadora de cultura de células.
2. Monitor organoids todos os dias. Neuroepithelial homogênea laço-como estruturas desenvolvem gradualmente após incorporação numa matriz BME.
3. Quando neuroepithelial loop estruturas são visíveis, mudar o meio meio de diferenciação de organoides contendo DMEM-F12 com suplemento de N2 (1: 200), suplemento de B27 (1: 100), glicose (0,2 mg/mL), acampamento (0,15 µ g/mL), 0,5% de timina, 1% L-alanil-L-glutamina, insulina (2,5 µ g/mL)
4. Substitua o meio de diferenciação de organoides cada 3-4 dias até o ponto de tempo diferenciação desejado é atingido. Em seguida, organoids de correção (ver secção 5).
   Nota: Ocasionalmente, o tecido pode exibir botões de tecido opticamente translúcido sem estruturas de loop. Embora este não é o ideal, isso não está afetando o desenvolvimento das estruturas corticais. O organoids pode ser cultivado em meio de diferenciação de organoides por até 40 dias. Para períodos de cultura estendida (40-100 dias) o meio de diferenciação de organoides pode ser suplementado com 01:50 BME para aumentar a complexidade do tecido e com BDNF e GDNF para permitir neuronal sobrevivência e maturação^14,15.

5. fixação e validação do prosencéfalo-tipo Organoids

1. Para a validação, colete 6 organoids no dia 20. Use 3 organoids para o isolamento de mRNA e análises PCR. Transferi os 3 organoids adicionais para uma placa de 24 contendo PBS usando uma ponta de pipeta de 1ml de corte com uma abertura de 3-3,5 mm para fixação e análises immunocytochemical sequencial.
2. Lave o organoids duas vezes por cuidadosamente por aspiração a PBS e substituí-lo com PBS fresco utilizando uma pipeta de 5 mL. Corrigi o organoids por 15 min no frio paraformaldeído 4% (PFA) (pH 7,4).
   Atenção: Cuidado com o que o PFA é um conhecido agente cancerígeno humano. Todo trabalho deve ser feito em uma coifa química usando luvas de nitrilo. Recomenda-se usar óculos de segurança. Formaldeído pode causar danos irreversíveis para a córnea.
3. O PFA, Aspire cuidadosamente e lavar três vezes usando temperatura PBS por 10 min.
4. Substituir a PBS com solução de sacarose a 30% (wt/vol, baseada em PBS) e armazenar as amostras em 4 ° C, para permitir que organoids a desidratar. Organoids pode ser armazenado por até 7 dias até o processamento adicional.
5. Um dia após a fixação, pre-manche a organoids desidratado adicionando trypan azul em aproximadamente 01:50 por 10 min permitir a visualização da organoids durante o procedimento de cryosectioning.
6. Prepare o suporte de encastre com 10% de sacarose, gelatina de 7,5% wt/vol em PBS e aquecê-lo a 75 ° C, até que é líquido.
7. Substitua 30% solução de sacarose com medium de incorporação e transferir a placa de 24 em uma placa de aquecimento (60 ° C) por 15 min equilibrar o organoids.
8. Cubra o fundo dos moldes com uma camada de mídia incorporação incorporação e colocá-los no gelo para polimerizar.
9. Transferência do organoids da placa de 24 poços para a incorporação de moldes contendo o meio de encastre polimerizado, adicionar meio incorporação adicional em cima para que as organoids são cobertas e coloque o molde rapidamente em um 100% etanol/gelo congelamento (banho temperatura deve ser entre -30 a-50 ° C) pelo menos 1 min para para-choque.
10. Coloque o molde com pinças em gelo seco temporariamente e qualquer loja que eles a-80 ° C ou diretamente proceder com cryosectioning.
11. Organoids de Cryosection a 20 µm de espessura e coletar as seções em corrediças do microscópio, mantendo faixa da ordem de seções nos slides (absorção sequencial). Permitem que as seções secar em slides por várias horas, antes de armazená-los a-80 ° C ou executar diretamente immunocytochemical coloração.

Resultados

O protocolo de organoides padronizada prosencéfalo-tipo descrito aqui normalmente gera culturas organoides altamente homogênea de quase exclusivamente a identidade cortical dorsal de iPSCs humana dentro de 20 dias de cultivo (protocolo descrito na Figura 1 A). recomenda-se executar várias etapas de controle de qualidade durante o curso do tempo do protocolo, definido aqui como: 'ir' (continuar o processo de diferenciação) e 'Go' (culturas de qualidade inferior, é recomendável para finalizar o lote) (Figura 1 ). Também é aconselhável para documentar cada etapa de controle de qualidade bem tomando notas e imagens.

O primeiro passo crítico na geração de prosencéfalo-tipo organoids é começar com culturas de iPSC de alta qualidade. É importante que iPSCs não contêm frações maiores de células diferenciadas. Utilize apenas culturas de iPSC que apresentam como uma monocamada homogênea de células indiferenciadas na população inicial (Figuras 1B, C). Além disso, é fundamental começar com o número de células determinado para agregação de iPSC. A primeira inspeção detalhada dos agregados iPSC deve ser realizada no dia 2. Nesta fase, os agregados devem ter formado compacto células gustativas com bordas lisas ('ir') Considerando que agregados aparecendo irregulares ou agregados com cavidades devem ser descartado ('abortar') (figuras 1, E). O próximo passo de controle de qualidade deve ser realizado no dia 10 do protocolo. Neste ponto do tempo, os agregados de células devem mostrar tecido suave e opticamente translúcido na superfície exterior, representando a indução de neuroectoderma ('ir'), Considerando que a ausência de tais tecidos indica suboptimal indução neural ('Go') (figuras 1F, G ). Apenas os agregados que exibem uma superfície translúcida (Figura 1F) devem ser incorporados em matriz BME. Uma vez incorporado, o organoids cortical desenvolverá neuroepithelial contínuo laço-como estruturas, que irão expandir rapidamente. Analise a eficiência da indução cortical no dia 15 e dia 20 por investigar se o organoids tem desenvolvida polarizada ectoderma neural conforme demonstrado na Figura 1H, J ('ir'). No caso que organoids não desenvolveram tais botões neuroepithelial ('Go' conforme ilustrado na Figura 1,I, K), criticamente, rever as etapas de controle de qualidade realizados para solução de problemas. Quando firmemente seguir o protocolo, altamente padronizados organoides lotes será gerado (figuras 2A, B), que mostrará a homogeneidade ≥ 90% em polarizada formação neural ectoderma dentro e entre lotes (Figura 2C). Um erro comum, levando à eficiência variável de formação polarizada ectoderma neural é aumentar o número de célula inicial para agregação de iPSC, ou começar com baixa qualidade iPSC culturas tais como micoplasma contaminados culturas ou culturas que contêm células diferenciadas.

Uma validação detalhada da identidade tele-encefálico dorsal do organoids gerado deve ser realizada no dia 20. Para esse fim, 3 organoids deve ser fixo e utilizados para análises de imunofluorescência. Loops de neuroepithelial estratificada(Figura 3)expressam o marcador de células-tronco neurais Sox2 (Figura 3B, D), os marcadores do prosencéfalo Pax6 e Otx2 (figuras 3, E) e o marcador cortical dorsal Emx1 (Figura 3 F). essas voltas corticais caracterizam-se ainda mais por uma localização apical de N-caderina e ZO-1 (figuras 3, H), células de glia radial zona ventricular (vRGC)-derivado de microtúbulos, que se estende desde o apical à parte basal do (estruturas Figura 3 eu), e localizada apical dividindo pilhas que mancha positivas para vimentina fosforilada (p-vimentina, Figura 3J). Morte celular pode estar presente dentro das estruturas organoides. Central apoptose é normal e não afeta o desenvolvimento do tecido cortical. Além disso, 3 organoids deve ser usados para avaliar a homogeneidade do protocolo por análises de expressão do gene. Prosencéfalo-tipo organoids mostrar a expressão dos marcadores prosencéfalo dorsal (FoxG1, Otx2, Emx1), enquanto expressão do mesencéfalo (FoxA2, Pax5) e os marcadores rombencéfalo (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) não é detectável (Figura 3K).

Lotes de organoids de controle de qualidade podem ser usados para diversas aplicações, como as análises do avião divisão de células gliais radiais apicais. Para o efeito, sugerimos realizar dupla coloração usando anticorpos contra p-vimentina e Tpx2 (Figura 3-J). P-vimentina é fosforilada por CDK1 durante a mitose e situa-se no núcleo, marcando, assim, todos os núcleos na fase mitótica¹⁶. Tpx2 é uma proteína associada do microtubule que pode visualizar o fuso mitótico e os processos apicais durante a migração nuclear interkinetic^17,18. Usando estes marcadores, três aspectos da divisão de vRGC podem em princípio ser analisados: (I) se celular divisão tem lugar no lado apical, (II) se o plano de divisão é vertical alinhada (indicando simétrica divisão celular), horizontal ou oblíquo ( indicando a divisão celular assimétrica) da superfície apical, e (III) se microtubule organizar centros formam-se normalmente.

Organoids podem ser também mais diferenciados em estruturas mais complexas de tecido cortical organizada e estratificada. Estruturas corticais dentro dia 35 ± 2 organoids são compostas de uma zona ventricular (VZ)-, uma interior e exterior zona subventricular (SVZ), bem como uma placa cortical (CP) - como área. Dentro o VZ e o interior e exterior SVZ, vRGCs, progenitores intermediários (IPs) e células reminiscentes de oRGCs podem ser identificadas. Além disso, a formação inicial de um córtex em camadas pode ser observada na área de CP-como com neurônios corticais profundas expressando Tbr1 e Ctip2 dentro e neurônios corticais superiores, expressando Satb2, bem como células Reelin-expressando no¹⁰regiões exteriores.

Figura 1 : Visão esquemática do protocolo de organoides e ilustração de 'ir' e 'Go' critérios. (A) visão geral esquemática do protocolo. Médio de CI: meio de indução cortical; CD: meio de diferenciação cortical. (B–C) Imagem de uma ideal cultura monocamada confluente iPSC de 90% (B) e uma cultura de não-apropriado iPSC exibindo diferenciação (C). (D–E) Um agregado de iPSC ideal em tamanho, a densidade celular e a aparência de superfície (D) e dois agregados de células 'Go', exibindo qualquer célula poupa cavidades (E, agregado superior) ou irregular das bordas (E, agregado inferior) dois dias agregação de célula seguinte. (F–G) Agregados de células exibindo bordas translúcidas e suaves (F) e agregados de células falta óptico (G) de compensação. A linha amarela é visualizando a área de interesse. (H–K) Uma óptima organoides com loops neuroepithelial contínuo (H, J) e um organoides que não conseguiram desenvolver radialmente organizaram neuroectoderma (eu, K) fotografada no dia 15 e 20, respectivamente. Barras de escala, B-C-500 µm; D-K 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Homogeneidade e reprodutibilidade do protocolo prosencéfalo-tipo organoides. (–B) Imagens representativas do brilhante-campo de organoids de um lote no dia 15 (A) e dia 26 (B). (C) análises quantitativas de organoids no dia 20. Organoids que exibem na superfície exterior de um neuroepithelium, reconhecível em campo claro como opticamente clara superficial tecido com uma fronteira clara e evidência da arquitetura celular radial foram quantificados (n = 3 por linha de iPSC pelo menos 16 organoids por experiência). Escala de barras, A-b: 500 µm. barras de erro ± SD. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Validação do prosencéfalo-tipo organoids no dia 20. (A–J) Caracterização de Immunocytochemical de organoids. Organoids organizar em vários loops neuroepithelial (A, counterstained com DAPI). Estratificada organizadas células dentro do expresso de laços neuroepithelial o marcador de células-tronco neurais Sox2 (B, D), os marcadores do prosencéfalo Pax6 (C, D) e Otx2 (E), bem como o marcador do prosencéfalo dorsal Emx1 (F). Estruturas de loop cortical exibiram um cinto fino junção aderente lado apical no máximo com o acúmulo de N-caderina (G) e proteínas de occludens zona 1 (ZO-1; H). microtubule de RGCs Ventricular redes (manchadas pelo α-tubulina acetilada, Ac-banheira) estendem-se desde o apical à parte basal das estruturas de loop (eu). Pilhas proliferating expressando p-vimentina (p-Vim) estão localizadas na superfície apical. Fusos mitóticos estão manchados pelo Tpx2. maior ampliação imagem representativa de um vertical e um plano de divisão horizontal são mostrados à direita (J). (K) análise de RT-PCR para os fatores de transcrição específicas da região no dia 20 de dois conjuntos independentes de organoids derivado de 2 linhas diferentes de iPSC. FB: controle cérebro fetal; AB: controle cérebro de um adulto. Barras de escala, A-D 200 µm; E-eu 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Epítopo	Diluição
Sox2	1 - 300
Pax6	1 - 500
Otx2	1 - 500
Emx1	1 - 50
N-caderina	1 - 500
ZO-1	1 - 100
P-vimentina	1 - 1000
Tpx2	1 - 500
Α-tubulina acetilada	1 - 500
Alexa488 anti-ms	1 - 1000
Alexa488 anti-rb	1 - 1000
Alexa555 anti-ms	1 - 1000
Alexa555 anti-rb	1 - 1000

Tabela 1: Anticorpos para controle de qualidade de organoids no dia 20.

Primeira demão	Sequência de
Otx2 para a frente	tgcaggggttcttctgtgat
Otx2 reversa	agggtcagagcaattgacca
FoxG1 para a frente	ccctcccatttctgtacgttt
FoxG1 reversa	ctggcggctcttagagat
Emx1 para a frente	agacgcaggtgaaggtgtgg
Emx1 reversa	caggcaggcaggctctcc
FoxA2 para a frente	ccaccaccaaccccacaaaatg
FoxA2 reversa	tgcaacaccgtctccccaaagt
Pax5 para a frente	aggatgccgctgatggagtac
Pax5 reversa	tggaggagtgaatcagcttgg
HoxB2 para a frente	tttagccgttcgcttagagg
HoxB2 reversa	cggatagctggagacaggag
HoxA4 para a frente	ttcagcaaaatgccctctct
HoxA4 reversa	taggccagctccacagttct
HoxB4 em frente	acacccgctaacaaatgagg
HoxB4 reversa	gcacgaaagatgagggagag
HoxB6 para a frente	gaactgaggagcggactcac
HoxB6 reversa	ctgggatcagggagtcttca
18 anos para a frente	ttccttggaccggcgcaag
18s reversa	gccgcatcgccggtcgg

Tabela 2: Primer e sequências de cartilha para o perfil de expressão do gene.

Discussão

Cérebro organoids representam uma poderosa ferramenta para o estudo cérebro humano desenvolvimento em vitro como eles fornecem o fundo espécies relevantes e o complexo arranjo 3D de células em um contexto de tecido. Com isso, eles a ponte entre modelos animais não-humanos e técnicas de cultura de células de humana bidimensional monocamada reducionista. Suas aplicações são, no entanto, dificultadas pela falta de reprodutibilidade⁹. Nós desenvolvemos um protocolo de organoides prosencéfalo-tipo, que supera a grande variabilidade de amostra para amostra, combinando a capacidade de auto-organização de iPSC com sua acessibilidade para padronização de fatores. Especificamente, iPSCs foram agregados para promover a auto-organização e posteriormente inibir TGF-ß/SMAD sinalização para promover a diferenciação de córtex dorsal, expondo as culturas para um BMP (LDN-193189) e uma TGF-β tipo I inibidor do receptor (A83-01). Adicionalmente, um composto que inibe a via Wnt (IWR) para impedir a posteriorização foi aplicado. Em contraste com os protocolos de organoides cerebral 'intrínseca'¹⁹, que são baseados na auto-montagem sem controle externo, dando origem a organoids cérebro bastante heterogêneo e exibindo variações de lote grande (medido pelas eficiências de polarizado ectoderme neural formação¹⁵), o protocolo descrito aqui reproducibly gera homogênea prosencéfalo específicas organoids de iPSCs humana.

Estes organoids do prosencéfalo-tipo pode ser usados para uma variedade de aplicações, tais como estudos de desenvolvimento neurológico, estudos evolutivos, incluindo estudos de função do gene, modelagem de doença e, potencialmente, efeitos terapêuticos e testes de drogas. No entanto, o protocolo é mais adequado para examinar os aspectos iniciais do desenvolvimento cortical humano. Por exemplo usamos o prosencéfalo-tipo organoids para examinar aspectos humanos específicos de comportamento vRGC. Mais especificamente, alterações fisiopatológicas associadas com uma forma grave de lisencefalia, uma malformação cortical humana, caracterizada por uma quase ausência de dobramento cortical, foi abordada. Apenas certos aspectos desta doença podem ser modelados em camundongos, como o cérebro de rato é, naturalmente, lissencephalic. Ao aplicar o sistema de organoides lisencefalia paciente-derivado iPSCs, podemos confiantemente recapitular aspectos humanos específicos da doença e identificar mecanismos subjacentes. Mais especificamente, nós poderia demonstrar que paciente-derivado organoids mostram uma redução significativa no tamanho, causado por um interruptor de simétrica para a divisão celular assimétrica de vRGCs. Essa opção foi associada a alterações na organização da rede de microtúbulos dos vRGCs, uma interrupção da arquitetura do nicho VZ e alterou a expressão de moléculas de adesão celular, levando a uma deficiente ativação de N-caderina/β-catenina sinalização do eixo¹⁰. Nota: Regulamento de β-catenina-dependentes dos modos de divisão de vRGC foi sugerido para ser humanos específicos como superexpressão de β-catenina em ratos leva à expansão do córtex tangencial e posteriormente cortical²⁰de dobramento. Assim, nossos dados destacam que o sistema de organoides prosencéfalo-tipo representa uma ferramenta promissora para estudar de forma quantificável os aspectos humanos específicos do desenvolvimento cortical precoce em vitro.

Um grande desafio para o futuro é manter a homogeneidade do organoids em períodos de tempo prolongado para atingir mais maduros fenótipos neuronais. Isso pode ser realizado por um ou mais dos seguintes: cultivo a organoids em um biorreator sistema¹⁴, aplicar flutuante moldes¹⁵, suplementando o meio de diferenciação com crescimento neural, ou fatores de sobrevivência neuronal. Finalmente, um aumento controlado da complexidade do cérebro pode ser alcançado pela fusão do prosencéfalo-tipo organoids com organoids cerebral de diferente identidade regional^21,22.

Tomados em conjunto, o protocolo de organoides de prosencéfalo-tipo apresentado aqui oferece uma ferramenta facilmente aplicável e confiável para a geração das primeiras estruturas corticais em vitro. O protocolo dá origem a tecido cortical precoce altamente homogêneo através de várias linhas de iPSC e pode ser utilizado para gerar confiantemente tecido cortical específicos do indivíduo. Assim, o sistema é particularmente apropriado para aplicações que exigem um alto grau de homogeneidade e reprodutibilidade como modelagem de doença.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
A83-01	StemGent	130-106-274	500 nM
B27 Suplemento	Gibco	17504-044	1 a 100
Extrato de membrana basal (por exemplo, Geltrex)	Gibco	A14132-02
Monofosfato de adenosina cíclico (cAMP)	Sigma-Aldrich	A9501	0,15 µ g / mL
Reagente de dissociação celular (TrypLE Express)	Gibco	12605028
Câmara de contagem, por exemplo, Fuchs-Rosenthal	Karl Hecht	40449001
D-Glucose	Carl Roth	HN06.3	0,2 mg / mL
DMEM-F12 L-Glutamina	Gibco	11320033
Moldes de incorporação (Tissue-Tek Cryomold)	Sakura Finetek	4565
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma-Aldrich	E6511	0.5 mM
Gelantin	Sigma-Aldrich	G1890
Heparina	Sigma-Aldrich	H3149-25KU	10 ug/mL
Inibidor da resposta WNT (IWR-1)	Enzo Life Science	BML-WN103-0005	10 ug/mL
Insulina	Sigma-Aldrich	91077C	2.5 µ g/mL
de meio IPSC para culturas monocamada (Pluripro)	Cell Guidance Systems	MK01
L-alanil-L-glutamina (GlutaMax)	Gibco	35050038	1%
Placas de baixa adesão de 6 cm	Labomedic	2081646L
Placas de baixa adesão de 10 cm	Labomedic	2081646O
LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-104-171	180 nM
N2 Suplemento	Gibco	17502-048	1 a 200
aminoácidos não essenciais	Gibco	11140035	0,50%
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148	4,00%
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	14190144
Filme plástico de parafina (Parafilm)	MARCA GMBH + CO KG	701606
Sistemas de orientação celular do inibidor Y-27632		SM02-100	5 µ M ou 50 µ M
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Tubos 15 mL	Corning Life Sciences	734-0451
Lâminas de microscópio, por exemplo, Superfrost Plus Lâminas de microscópio	Thermo Scientific	4951PLUS4
Placa de cultura de tecidos de 6 poços	Falcon	734-0019
Placa de cultura de tecidos de 24 poços	Falcon	734-0949
Mancha azul de tripano	Gibco	15250-061
Placa de revestimento de lipídio de 96 poços de ligação ultrabaixa A-U96	Amsbio	AMS.51011610
Anticorpos
Sox2 R	& D Systems	MAB2018
Pax6	Covance	PRB-278P-100
Otx2	R& D Systems	ab9566
Emx1	Sigma	HPA006421
N-caderina	BD	610921
ZO-1	Life Tech	61-7300
P-Vimentina	Biozol	D076-3
Tpx2	Novus Biologicals	NB500-179
Acetilado &alfa;-tubulina	NEB / CS	5335
Alexa488 anti ms	Invitrogen	A11001
Alexa488 anti rb	Invitrogen	A11008
Alexa555 anti ms	Invitrogen	A21424
Alexa555 anti rb	Invitrogen	A21429