Preparação ideal de formol fixada amostras para peptídeo baseado Matrix assistida por espectrometria de massa de ionização/dessorção Laser Imaging fluxos de trabalho

Summary

Este protocolo descreve um método reprodutível e confiável para preparação de formol fixada tecido destinado a espectrometria de massa de imagens baseada em sublimação.

Abstract

O uso de laser assistida por matriz dessorção/ionização, espectrometria de massa (MALDI MSI) de imagem rapidamente expandiu-se, uma vez que esta técnica analisa uma série de biomoléculas de drogas e lipídios para os N-glicanos. Embora existam várias técnicas de preparação de amostra, detectar peptídeos formol preservados os tecidos continua a ser um dos mais difíceis desafios para este tipo de análise de espectrometria de massa. Por esta razão, temos criado e otimizado de uma metodologia robusta que preserva as informações espaciais contidas dentro da amostra, enquanto a suscitar o maior número de peptídeos ionizáveis. Nós também ter mirado para alcançar este objectivo de forma simples e rentável, eliminando assim o possível erro viés ou preparação, que pode ocorrer quando usando automatizado instrumentação. O resultado final é um protocolo reprodutível e de baixo custo.

Introduction

Espectrometria de massa de ionização/dessorção do laser assistida por matriz (MALDI MSI) de imagem tem sido utilizada como uma técnica de imagem com base para duas décadas^1,2, analisando uma série de biomoléculas incluindo: lipídios³, peptídeos^{2 ,4}, proteínas de^2,5, metabólitos^6,7, os N-glicanos⁸e moléculas sintéticas tais como drogas terapêuticas^9,10. O número de publicações, demonstrando a utilidade desta técnica tem crescido significativamente ao longo da última década,^6,11,12,13. Certas moléculas, como lipídios, são relativamente fáceis de analisar através de MALDI MSI, como eles ionizam facilmente devido à sua natureza química e, portanto, requerem pouca preparação prévia³. No entanto, para alvos mais difíceis, como peptídeos, as etapas necessárias para ionizar eficazmente estas moléculas são extensos e complicados geralmente¹⁴. Atualmente, existem poucas publicações que visam endereço ou demonstram reprodutibilidade nas metodologias que são utilizadas para preparar o tecido para esta técnica visual original¹⁵. Por esta razão, nós temos compilado observações e implementado otimizações em um único, fácil de implementar, metodologia que não requer pouca ou nenhuma modificação, para a análise de peptídeos formol um reticulado tecido fonte¹⁴.

Neste manuscrito, descrevemos uma metodologia reproduzível validada, de baixo custo para a detecção e mapeamento espacial de peptídeos, gerados a partir de congelados fixada em formol (FFF) e fixada em formol parafina (FFPE) cortes histologicos. Esta metodologia não exigem ou dependem de qualquer instrumentação especializada³. Especificamente, abordamos os muitos aspectos especializados da preparação da amostra necessário para analisar os peptídeos; etapas como antígeno recuperação¹⁶ e revestimento de matriz. Nosso protocolo também utiliza equipamento barato e reagentes, tornando esta metodologia acessível para uma comunidade mais alargada, que seria incapaz de pagar os aparelhos robóticos alternativo¹⁷.

O raciocínio por trás do desenvolvimento de um método de preparação de amostra manual foi dupla: em primeiro lugar, o uso de um Sublimador cria um revestimento consistente e homogêneo dos cristais de matriz que são ~ 1 µm no comprimento¹⁸, algo inatingível com pulverização mais comuns técnicas. Em segundo lugar, o conjunto relativamente pequeno de custos: o custo total do aparelho personalizado foi <$ 1500 AUD. Notamos que, em termos de custo-eficácia, o preço por exemplo é muito mais barato quando não há nenhuma maquinaria robótica envolvidos. O uso de sublimação foi relatado anteriormente, no entanto, para o melhor de nosso conhecimento, metodologias passo a passo que descrevem este processo e preparação da amostra não tem sido relatadas nem descritas na literatura.

Este protocolo destina-se a auxiliar os pesquisadores que têm acesso a um espectrômetro de massa MALDI e que têm a intenção de gerar informação espacial em relação a uma bio-molécula de interesse¹⁹. Em essência, MALDI MSI é uma forma de histológica de rastreio que não depende de anticorpos ou manchas².

Protocol

Atenção: Todas as precauções de segurança devem ser seguidas quando efectuar este procedimento, incluindo a utilização de equipamento de protecção adequado (EPI) (por exemplo, aventais, luvas de nitrila, óculos de segurança, etc)

1. preparação de reagentes e equipamentos

1. Preparação das soluções
   1. Para preparar 500 mL de fluido do Carnoy, misturar 100% de etanol (EtOH), clorofórmio e ácido acético em um 6: proporção de 3:1 v/v/v num frasco Schott de vidro limpo.
   2. Para tornar o líquido nitrocelulose (NC), dissolva a membrana NC (comumente usada na mancha ocidental) em acetona pura, por agitação suave, a uma concentração final de 40 mg/mL.
2. Preparação de slides NC revestido
   1. Uso uma técnica semelhante ao usado para a preparação de sangue mancha para exame histológico²⁰ preparar NC revestido slides.
   2. Pipete 40 µ l de líquido NC sobre uma borda de uma lâmina de microscópio de óxido de estanho (ITO) índio condutora. Usando um microscópio de vidro normal, arraste o slide para criar um revestimento de película fina até o NC sob tensão superficial.
   3. Permitir que o NC secar em temperatura ambiente por 20 s e então loja até necessários à temperatura ambiente. Armazenamento das amostras sob essas condições pode ser por tempo indeterminado, desde que os tecidos são mantidos e livre de poeira.
      Nota: Este método de preparação é mais conhecido como "filme fino" e irá produzir um revestimento uniforme que depende da viscosidade do NC, bem como a falta de tensão de superfície de auto-nível no slide. O único cuidado que deve ser tomado quando preparar os slides não está se movendo muito rapidamente, que irá criar estrias de NC, ao invés de uma cobertura completa.
      Cuidado: Como NC líquido seca muito rapidamente, é essencial trabalhar rapidamente para evitar a secagem a solução antes que tenha sido corretamente se espalhasse. Deve também ter cuidado ao manipular NC em estado líquido, como é um composto altamente energético e não deve contatar uma fonte de ignição para evitar a explosão incendiária. NC também sofre transições endotérmicos ao secar e pode causar queimaduras de frias, se permitiu entrar em contacto prolongado com a pele ou as mãos enluvadas. Para minimizar todos os riscos, apenas pequenas quantidades devem ser preparadas em cada momento (< 1 mL é recomendado). Depois de seco é estável à temperatura ambiente. No entanto, NC pode permanecer explosiva quando presente em grandes quantidades.
3. Criação de câmaras de vapor personalizado
   1. Corte um pedaço de papel mata-borrão grosso com uma tesoura grande o suficiente para caber no fundo metade de um prato de petri de plástico padrão (94 mm de diâmetro e 3 mm de espessura).
   2. Corte o papel, deixando uma faixa retangular no centro, o mesmo tamanho como uma lâmina de microscópio, deixando excesso suficiente para que o papel vai manter sua posição na caixa de Petri (complementar a Figura 1).

2. preparação de cortes de tecido

1. FFPE tecido²¹.
   1. Selecione a seção em 12 µm espessura em um banco padrão montado micrótomo e flutuar de montagem para o NC pré-revestido ITO slides e bloco de tecido desejado.
   2. Mergulhe os slides em xilol fresca para remover a parafina residual por 2 min e repita a operação uma segunda vez.
      Nota: Se o bloco de parafina é especialmente penetrante ou o tecido é relativamente pequeno em comparação com o bloco de parafina, as amostras podem ser aquecidas a 60 ° C para derreter a maioria embora antes da lavagem em xilol.
   3. Lavar as amostras deparaffinized submergindo os slides em uma série de solvente classificado: 70% v/v EtOH/água, 100% EtOH, fluido de Carnoy, 100% EtOH, água ultra pura e 100% EtOH. A duração de cada submersão deve ser de 30 s, com exceção de fluido do Carnoy, que deve durar 2 min.
      Cuidado: Do Carnoy fluido e xileno devem ser armazenados e utilizados em uma coifa, como eles são altamente tóxicos se inalado.
2. Tecido congelado fixada em formol (FFF)
   Nota: As amostras devem já congeladas, apropriadamente de acordo com o tipo de amostra.
   1. Equilibrar o bloco de tecido na temperatura de funcionamento do micrótomo para 20 min²².
      Nota: A temperatura de equilíbrio é depende do tipo de tecido.
   2. Seção o tecido usando um micrótomo em 12 montagem µm e descongelar as seções em um NC pré-preparadas revestido ITO deslize.
   3. Armazene os slides num exsicador de vácuo no banco no escuro.
      Nota: As amostras podem ser armazenadas por várias semanas sob essas condições.
   4. Lave as amostras em uma série de solvente classificada como afirmado por tecido FFPE (2.1.3).
      Nota: Não há nenhuma necessidade para uma etapa de deparaffinisation xileno como a amostra não é incorporada.

3. metileno Crosslink hidrólise

1. Carrega os slides de amostra (FFF ou FFPE) em uma caixa de plástico slide que está cheio até o topo de 20 mmol tris-HCl (pH 8,8). Feche a caixa e coloque-o em um banho de água, contendo 500 mL de água, permitindo que a caixa para tocar o fundo. Então aquecê-lo por 15 min a 120 ° C em uma panela de pressão que pode atingir uma pressão de operação de 70 kPa.
2. Remover as lâminas, permitir-lhes esfriar e deixe-os secar à temperatura ambiente por 15 min.

4. tecido digestão

1. Quando hidrolisada, casaco as amostras com 10 µ l de solução de tripsina (1 mg/mL) em água ultra pura, por pipetagem 10 µ l da solução para a borda da seção de tecido em seguida, usando a mesma ponta da pipeta, arraste toda a superfície do tecido sob a superfície da gota tensão.
   Nota: Evite riscar a superfície do tecido com a ponta da pipeta e sobre espalhando a enzima para além das fronteiras das bordas do tecido.
2. Permitir que as amostras secar à temperatura ambiente.
3. Depois de seco, monte as amostras dentro da parte superior da câmara de vapor anteriormente construído (tecido voltada para baixo) com fita de autoclave em qualquer borda do slide (complementar a Figura 2).
4. Pipete 600 µ l de uma solução contendo uma mistura de 1:1 v/v de bicarbonato de amónio acetonitrilo e 50 mM 100% cuidadosamente sobre o dedo de papel mata-borrão na parte inferior da caixa de Petri, até o dedo parece ser uniformemente molhado.
5. Coloque a metade superior da câmara de vapor na parte inferior metade, garantindo o slide de dedo e amostra de papel alinhar perfeitamente e selar a câmara em torno de seu Equador com película de parafina.
6. Deixe a amostra durante a noite em uma incubadora de 37 ° C para permitir a digestão completa.

5. matrix revestimento através de sublimação

1. Uma vez digerido, pese o slide de exemplo em um equilíbrio de microanalytical de 5 dígitos.
2. Montar o slide para o arrefecimento dedo do aparato de sublimação e fixe-a com fita de cobre, da mesma forma como descrito para a câmara de vapor (complementar a Figura 3).
   Nota: Para garantir que o slide é contatado uniformemente pelo dedo refrigeração, uma camada de fita de cobre é colocada na parte inferior do dedo refrigerando para nivelar a superfície. Isso garante que o slide é uniformemente resfriado que leva ao mesmo deposição de matriz.
3. Coloque 300 mg de matriz de ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos (CHCA) em um prato de petri de vidro na parte inferior da câmara e se espalhar uniformemente para criar uma fina camada de cristais de matriz.
4. Montar o Sublimador e prenda as duas metades com a braçadeira de ferradura. Suspenda o montado unidade 15-20 cm acima de um banho de areia, pré-aquecido a 220 ° C, colocando-o em um anel de metal ligado a um stand da retorta.
5. Ligue a câmara à fonte de vácuo, envolver-se o vácuo e permitir que estabilizar até mTorr ~ 25 por 5 min.
6. Embalar o dedo refrigerando para o topo com gelo e adicionar 50 mL de água. Permitir que o aparelho para se contentar com um mais 5 min antes de prosseguir.
7. Abaixe a câmara para a superfície da areia, garantindo que a areia completamente entra em contato com o fundo da câmara e deixá-lo por 45 min criar um revestimento ideal de 0,22 mg/cm²
   PRECAUÇÃO: Deve ter cuidado ao manipular produtos vidreiros em alto vácuo, como qualquer dano ao aparelho, quando evacuado, pode resultar em uma falha catastrófica da câmara de vidro.
8. Depois de 45 min, remova a câmara do banho de areia, levantando-se do anel metálico e a câmara de ventilação.
   Nota: Uma vez que a câmara tem sido ventilada, o slide deve ser removido muito rapidamente como água no ar começa a condensar no slide dedo e amostra de congelação.
9. Remover o slide e pesá-lo para assegurar o revestimento desejado foi alcançado.
   Nota: Se foi conseguido revestimento insuficiente, simplesmente repita o processo de sublimação para o slide até a espessura de revestimento desejado tenha sido alcançada.

6. recristalização

1. Uma vez sublimada, monte o slide de amostra para dentro da parte superior da câmara de vapor anteriormente construído, como descrito (tecido anterior voltada para baixo).
2. Pipete 600 µ l de uma solução contendo uma mistura de 1:1 (v/v) de 100% acetonitrila e 0,1% v/v ácido trifluoroacético em água cuidadosamente sobre o papel mata-borrão na parte inferior da caixa de Petri para assegurar um revestimento mesmo.
3. Montar a câmara, garantindo o slide papel de guia e microscópio alinhar perfeitamente e deixar em uma incubadora de 37 ° C por 1 h.
   Cuidado: Não veda a câmara.
   Nota: Uma vez recristalizado, normalmente amarelo hue da matriz deve mudar para branco, olhar menos brilhante e aparecem muito mesmo. Isso indica que a recristalização foi executada corretamente.
4. A amostra está agora pronta para análise.

7. instrumentação

1. Digitalize o slide em um scanner de mesa para criar uma imagem digital.
2. Carregar a amostra para o espectrômetro de massa e em seguida analisar usando a plataforma de software apropriado.
3. Analise as amostras no modo de reflectron íon positivo com uma escala em massa de 750-3.500 Da, com uma resolução de ponto é aplicável para o resultado desejado. Na maioria dos casos, 20-50 µm Largura de varredura é suficiente, no entanto, tão pouco quanto 10 µm podem ser usados¹⁵.
   Cuidado: MALDI UV lasers são uma fonte de radiação ionizante e não devem ser vistos diretamente. Certifique-se de que o laser está contido em instrumento de proteção antes da operação.

Results

Se seguidas corretamente, este protocolo produz imagens que representam claramente a morfologia bruta do tecido sem nenhum arranhão ou outras deformações (Figura 1). A validação ideal para uma preparação de amostra realizada corretamente, é a capacidade de distinguir entre diferentes estruturas físicas, alterando a molécula sendo vistos (Figura 2).

Um bom guia para dete...

Discussion

Este protocolo foi projetado para maximizar a geração de espécies moleculares ionizáveis, eliminando a deslocalização dos analitos. Fatores-chave envolvem usando os mesmos princípios de substituição, ao aplicar a matriz, digerindo a amostra, ou recristalização após sublimação²⁴; ou seja, que um mesmo deposição de vapor, de matriz ou caso contrário, precisa ser criado e mantido. Pipetagem lavagens de solventes para a recristalização e digestão, uniformemente debaixo da amostra, impede qualquer área...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micrótomo criogênico	Leica	CM3050	Para preparação e seção de tecido.
O microscópio do óxido de estanho do índio desliza	Bruker	8237001	Para a preparação e a seção do tecido.
Frascos Coplin	Sigma Aldrich	S5516	Para preparação e secção de tecido.
Panela de pressão	Kambrook	KPR620BSS	Para preparação e secção de tecido.
Sublimador	Chem Glass	NA	Para procedimento de sublimação. Semelhante em design ao CG-3038, no entanto, foi feito sob medida
Banho de areia	NA	NA	Para procedimento de sublimação. Areia de rio de grau fino mantida em folha de alumínio dobrada proveniente de fora, não de nenhuma empresa específica
Placa de Petri de vidro	Sigma Aldrich	CLS70165100	Para procedimento de sublimação.
Bomba de vácuo	NA	NA	Para procedimento de sublimação. Obtido como peça de reposição de um antigo espectrômetro de massa
Armadilha fria	Chem Glass	CG-4510-02	Para procedimento de sublimação.
Placa Quente	John Morris	EW-15956-32.	Para procedimento de sublimação.
Placa de Petri de plástico	Sigma Aldrich	Z717223	Para procedimento de sublimação.
37 &graus; C incubadora	NA	NA	Para procedimento de sublimação. Não aplicável, a incubadora não é estéril e tem mais de 30 anos
Papel mata-borrão	Sigma Aldrich	P7796	Para procedimento de sublimação.
Nitrocelulose	Sigma Aldrich	N8395	Para lavagem de slides.
Acetona	Sigma Aldrich	650501	Para lavagem de lâminas.
Xileno	Sigma Aldrich	214736	Para lavagem de slides.
100% EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	Para lavagem de slides.
70% EtOH	Sigma Aldrich	NA	Para lavagem de slides. Feito em laboratório com 95% de etanol em estoque
Clorofórmio	Sigma Aldrich	C2432	Para lavagem de slides.
Ácido acético glacial	Sigma Aldrich	ARK2183	Para lavagem de lâminas.
Tris HCL pH 8,8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	Para clivagem proteolítica. Pó feito a 1M seguido de equilíbrio com 32% de HCl a PH 8,8
Milli Q Água Ultrapura	Sigma Aldrich	NA	Para clivagem proteolítica. Purificação realizada em casa pelo sistema de purificação de água sartorious
Bircarbonato de amônio	Sigma Aldrich	A6141	Para clivagem proteolítica.
Tripsina	Sigma Aldrich	T0303	Para clivagem proteolítica.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	Para recristalização.
Acetonitrila	Sigma Aldrich	1.00029	Para recristalização.
Ácido Trifluoroacético (TFA)	Sigma Aldrich	302031	Para recristalização.