Um cinética baseada em fluorescência Ca2 + mobilização ensaio para identificar agonistas do Receptor acoplado à proteína G, antagonistas e moduladores alostéricos

Resumo

O ensaio de celular descrito destina-se a identificação do receptor do chemokine do CXC 4 (CXCR4)-interação agentes que inibem ou estimulam, competitivos ou qual alostericamente, o intracelular Ca^{2 +} lançamento iniciado pela ativação de CXCR4.

Resumo

G receptores (GPCRs) são de grande importância para a indústria farmacêutica como eles estão envolvidos em muitas doenças humanas e incluem metas bem validadas para a intervenção terapêutica. Descoberta de compostos de chumbo, incluindo pequenas moléculas sintéticas, que inibem especificamente a função do receptor, é um passo inicial importante no desenvolvimento de drogas e se baseia em ensaios de cell-based sensíveis, específicos e robustos. Aqui, descrevemos um ensaio cinético de celular com um visor fluorescente projetado principalmente para identificar os antagonistas de receptores específicos que inibem o intracelular Ca^{2 +} lançamento evocado mediante a ativação do receptor chemokine CXC 4 (CXCR4) por seu ligante endógeno, o ligante de chemokine CXC 12 (CXCL12). A principal vantagem deste método é que ele também permite o rastreio dos compostos dotados de propriedades intrínsecas de agonísticos (ou seja, compostos, provocando um aumento de Ca^{2 +} concentração intracelular na ausência de CXCL12) ou compostos função do receptor através da interação com sítios de ligação alostéricos de modulação (ou seja, moduladores alostéricos positivos e negativos (PAMs e NAMs, respectivamente)). No lado de baixo, autofluorescent compostos podem interferir com a leitura do ensaio, prejudicando, assim, interpretação de dados fiáveis. Muito provavelmente este ensaio pode ser implementado, com mínimas adaptações, como um ensaio de descoberta de medicamentos genéricos para muitos outros GPCRs cuja a ativação leva à liberação de Ca intracelular^{2 +}.

Introdução

GPCRs são uma importante superfamília de proteínas de superfície celular que ativam cascatas de transdução de sinal com ligação ligante extracelular. Eles podem ser ativados por uma grande variedade de estímulos, incluindo hormônios proteicos, peptídeos, aminas biogênicas e lipídios, o que resulta no início de diversas vias de sinalização intracelulares e respostas biológicas eventualmente^1,2 . Além disso, GPCRs estão envolvidos em muitos, se não todos, processos fisiológicos e de desenvolvimento e muitas doenças humanas são associadas com superexpressão de sinalização ou receptor GPCR disfuncional. GPCRs são,....

Protocolo

Nota: Todos os passos descritos nas seções 1 e 2 são realizados em condições estéreis em um fluxo laminar.

1. manutenção do u-87. Células CD4.hCXCR4

1. Crescem as células em frascos de cultura T75 em 37 ° C e 5% CO₂ em uma incubadora umidificada.
   Nota: A linha celular em vitro utilizada neste protocolo é uma linhagem de células de glioblastoma u-87 estàvel expressando cluster de diferenciação 4 (CD4) e humanos CXCR4 e tem sido descrito anteriormente¹⁷. Expressão de superfície celular de CD4 e CXCR4 é continuamente monitorado por citometria de fluxo e os níveis de expressão permanecem con....

Resultados

O efeito da estimulação CXCL12 na mobilização^{2 +} Ca intracelular no u-87. CD4.CXCR4⁺ e u-87. Células CD4 foi avaliada com o ensaio de Ca^{2 +} mobilização. Em vez de 20 µ l de composto de teste que normalmente seria adicionado durante a primeira etapa de pipetagem do protocolo (Figura 1), buffer de ensaio foi adicionado para o fluo-2AM carregado u-87. CD4.CXCR4⁺ células numa placa de medição. Durante a segunda etapa de.......

Discussão

O Ca^{2 +}-ensaio de mobilização aqui descrito anteriormente foi mostrado para ser uma ferramenta valiosa para identificar e caracterizar os antagonistas dos receptores CXCR4¹⁷de direcionamento. No entanto, prevê-se que este método pode ser mais geralmente aplicado a um grupo grande de outros GPCRs que desencadeiam um citosólico Ca^{2 +} lançamento após a sua ativação, conforme ilustrado pelo receptor relacionados chemokine CCR5. Considerando que, no caso de CCR5 poderiam ser aplic.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fluo-2 AM	Abcam	ab142775	corante sensível fluorescente Ca2+
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G	ácido plurônico
Gelatina	Sigma	G9391
AMD3100	Sigma	A5602-5 mg	específico CXCR4 antagonista
Maraviroc	gentil presente de	medicamento antirretroviral AnorMed
Ligante de quimiocina CXCL12	PeproTech	300-28A
Ligante de quimiocina CCL5	PeproTech	300-06
Soro bovino fetal (FBS)	Gibco (Life Technologies)	10270-106
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma	A1933-25G
Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco (Life Technologies)	41965-039
HBSS (10 x), cálcio, magnésio, sem vermelho de fenol	Gibco (Life Technologies)	14065-049
HEPES (1 M)	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol	Gibco (Life Technologies)	25200-056
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Tubos Falcon, 50 mL	Greiner Bio-One	227 261
Balão de cultura de tecidos (T75)	Corning	353024
Placa preta, 96 poços, fundo transparente, com tampa	Costar/Fisher Scientific	10530753	(96 poços), para semeadura de células
Placas de polipropileno (PP)	Placas Thermo Scientific (VWR)	732-2661	usadas para preparar as placas compostas e quimiocinas placas, fundo redondo
FLIPR Tetra sistema de triagem celular de alto rendimento	Dispositivos Moleculares		Leitor de placas fluorescentes com cabeça pipetadora integrada e câmera ICCD
Módulo LED FLIPR Tetra 470 - 495 nm	Dispositivos Moleculares	0200-6128	Diodos emissores de luz para excitação do corante sensível fluorescente Ca2+
Filtro de Emissão FLIPR Tetra 515 - 575 nm	Dispositivos Moleculares	0200-6203	filtro de emissão compatível com o corante fluorescente
FLIPR Tetra 96 Head	Molecular Devices	0310-4536	Cabeça pipetadora de 96 poços, integrada no leitor de placas fluorescentes
Pacote	ScreenWorks Molecular Devices		usado para análise e visualização de dados no analisador
Microplacas de poliestireno preto de fundo transparente plano de 96 poços Corning CellBIN, com tampa, placas de ensaio pré-revestidas	Corning	3340	que podem representar uma alternativa para o revestimento manual da placa de ensaio.

, antagonista CCR5 Placa de ensaio de software de viabilidade celular FLIPR Tetra Vi-CELL Beckman Coulter de 96 poços