Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir em massa-silenciamento murino células NK usando um sistema de diferenciação de alimentador-livre para estudo mecanicista em vitro e em vivo.

Resumo

Natural killer (NK) células pertencem ao sistema imunitário inato e são uma primeira linha de defesa imunológica contra o cancro; no entanto, eles são suprimidos no microambiente do tumor e o mecanismo subjacente ainda é desconhecido. A falta de uma fonte confiável e consistente de células NK limita o progresso da investigação da imunidade de célula NK. Aqui, nós relatamos um sistema em vitro que pode fornecer alta qualidade e quantidade de medula óssea-derivado murino células NK sob uma condição livre de alimentador. Mais importante, demonstramos também que com êxito silenciamento de genes mediada por siRNA inibe a maturação de células NK E4bp4 dependentes usando este sistema. Assim, esta célula NK romance em vitro diferenciar o sistema é uma solução de biomaterial para pesquisa de imunidade.

Introdução

Progressão de câncer é largamente dependente do tumor microambiente^1,2, incluindo o anfitrião-derivado de immunocytes, por exemplo, as células NK. Vários estudos demonstraram que as células NK intratumoral são negativamente correlacionadas com a progressão de tumor^3,4. Além disso, estudos clínicos mostraram que a terapia com células NK adotiva é uma estratégia possível para câncer^5,6,7,8,9. Imunoterapia baseada em célula NK recentemente foi sugerida como uma opção terapêutica para tumores sólidos, mas os desafios Existem devido a secreção de citocinas imunossupressoras e downregulation de ativação de ligantes no microambiente de tumores sólidos ^10,11. Transformar o fator de crescimento-β (TGF-β) tem sido sugerido um papel na carcinogênese supressiva, mas paradoxalmente as células cancerosas também produzem TGF-β1 para apoiar o tumor desenvolvimento^{12,13,14 , 15}. sinalização do TGF-β pode suprimir a atividade citolítica de células NK via receptividade de interferon para baixo-regulação e mediada por CD16 interferon-gama (IFN-γ) produção em vitro^{16,17, 18}.

Apesar de interrupção de TGF-β sinalização no microambiente do tumor pode ser um caminho possível para eliminar cânceres, bloquear completamente a sinalização do TGF-β causará doenças autoimunes, devido à sua função de anti-inflamatórios, como evidenciado pela evolução da efeitos colaterais adversos incluindo inflamação sistêmica, defeitos cardiovasculares e auto-imunidade mouse modelos¹⁹. Assim, entender o mecanismo de trabalho de TGF-β-mediada imunossupressão conduzirá à identificação de um alvo terapêutico acessível para tratamento de câncer.

Para elucidar os eventos moleculares necessários para o desenvolvimento de células NK, Williams et al estabeleceu um sistema in vitro para diferenciar as células-tronco hematopoiéticas murino de medula óssea em NK células²⁰. Este sistema facilita em grande parte o estudo mecanicista do desenvolvimento de célula NK, incluindo a identificação dos progenitores romance de NK células²¹. No entanto, os progenitores da medula óssea devem ser cultivados no sistema com células estromais OP9 de apoio como um alimentador camada^20,21, e esta população celular heterogênea em grande parte limita a aplicação adicional de desregulação gene ferramentas (p. ex., silenciamento de genes mediada por siRNA) especificamente aplicada às células NK diferenciadoras.

Aqui, descrevemos um sistema alimentador-livre que se desenvolveu ainda mais, modificando o sistema in vitro de Williams et al.²⁰. Em nosso sistema, as células de alimentador estromais OP9 não são necessárias, e em vez disso OP9 médio condicional é usado sem afetar a diferenciação da NK células in vitroe isto recentemente nos levam a descobrir que o TGF-β é capaz de promover a progressão do câncer através de suprimir o desenvolvimento de células NK E4bp4-dependente no tumor microambiente²². Este novo sistema com sucesso fornece um método livre de plano de fundo para elucidar o mecanismo molecular do desenvolvimento de células NK em condições específicas (por exemplo, elevada TGF-β1, silenciamento de genes mediada por siRNA, etc.) em vitro.

Protocolo

O protocolo para obtenção e diferenciando NK derivadas da medula óssea, células (BM-NK) é baseado em métodos anteriormente publicados^20,21,22. Todos os procedimentos com ratos foram aprovados pelo Animal ética Experimental Comité (AEEC) da universidade chinesa de Hong Kong.

1. preparação do OP9 médio condicional

1. Cultura a linhagem de células de estroma murino OP9 em alfa-MEM, contendo 20% FBS, 100 U/mL penicilina G e estreptomicina 100 µ g/mL, a 37 ° C numa atmosfera de ar/CO₂ umidificada (95%: 5%).
   1. Conte as células com um hemocytometer, então semente 2 x 10⁶ células OP9 para cada frasco de cultura² 75cm com 15 mL de meio. Cultura por 48 h.
   2. Quando a cultura atinge 80% confluência, lave o frasco com 10 mL de PBS e adicionar 20 mL de meio de alfa-MEM liso (sem FBS e antibióticos) por balão.
2. Coletar o OP9 meio de condição do frasco de cultura em 24h, limpar os escombros de célula com filtro de polietersulfona (PES) 0,25 µm e preservar a 4 ° C (uso dentro de 2 semanas).

2. isolamento de células de medula óssea de rato

1. Eutanásia em um rato de C57BL/6J de 12 semanas de idade com uma overdose de pentobarbitone (100 mg/kg, injeção intraperitoneal). Confirmar a morte pela falta de respiração, em seguida, colher os ossos fêmur com um corte de faca cirúrgica para as junções entre os ossos e remover os restantes músculos com a lâmina riscando suave.
2. Coloque os ossos em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo refrigerado estéril alfa-MEM e em seguida, execute as seguintes etapas em uma armário de biossegurança.
3. Descartar o meio de alfa-MEM e enxágue os ossos com etanol a 70% por 30 s.
4. Lave os ossos com PBS estéril gelada duas vezes para limpar o restante do etanol.
5. Transfira os ossos de uma argamassa contendo 5 mL de PBS gelado e suavemente fragmentam os ossos com um pilão (não pulverizá-los).
6. Agite suavemente os ossos e agitando o pilão para liberar as células da medula óssea para a PBS. Recolha as células de medula óssea contendo PBS para um novo tubo de centrifugação de 50 mL.
7. Repita a etapa 2.6 para quatro vezes, até que os fragmentos de osso se tornar sólido branco na cor.
8. Centrifugar o tubo a 465 x g por 5 min a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante.
9. Resuspenda o pellet com 18 mL de água destilada estéril e deixá-lo ficar por 30 s para remover células vermelhas do sangue.
10. Adicionar 2 mL de gelado 10 X PBS para parar a reação, em seguida filtrar a mistura através de um filtro de célula de 70 µm para remover os lisados glóbulos vermelhos.
11. Centrifugar o tubo a 465 x g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet com 20 mL de PBS gelado.
12. Lave as células, repetindo o passo 2.11 uma segunda vez.
13. Transferir o centrifugado para uma 100mm Petri estéril com 10 mL de OP9 médio condicional da etapa 1.2 suplementado com 20% FBS e uma mistura de 0,5 ng/mL murino IL-7, 30 ng/mL mouse SCF e flt3L murino de 100 U/mL.
14. Incubar o prato a 37 ° C com 5% de CO₂ por 2 h. transferência das células não anexadas em um novo recipiente de cultura em uma densidade de 5 x 10⁵ viável células/mL (contagem por hemocytometer com azul trypan exclusão de células) com a mesma fórmula média como na etapa 2.13 e incubar a 37 ° C com 5% de CO₂.
15. No dia 4, alterar a condição de cultura para OP9 condicional meio suplementado com 20% FBS e 2.000 U/mL de murino Il-2.
16. Atualizar o meio de cultura a cada 3 dias; células NK maduras podem ser obtidas por 7 dias e qualificadas como na seção 4.

3. mediada por siRNA Gene Silencing de diferenciar as células NK

1. Premix o controle siRNA ou absurdo (NC) com um agente de Transfeccao de acordo com o manual do produto.
2. Execute o passo 3.1 em qualquer ponto do tempo desde o dia 0.
3. Adicionar a 50 nM de siRNA ou mistura de NC para as células da etapa 2.14.
4. Repita o passo 3.1 em cada refresco médio (por exemplo, dia 0, 4 e 7) até o ponto de extremidade experimental.

4. análise da diferenciação de células NK usando citometria de fluxo

1. Em um ponto de tempo apropriado, recolher a suspensão de diferenciar as células e lave com PBS gelado.
2. Fixe as células com buffer de fixação da célula de acordo com o manual do produto.
3. Lavar as células fixas com PBS gelado e depois Ressuspender 1 x 10⁶ células em 100 µ l de fluxo Cytometry coloração Buffer contendo Cy3 anti-ratinho conjugada com NKp46 e anticorpos CD244 anti-rato PE-conjugados em uma diluição de 1: 100.
4. Manche a amostra no escuro à temperatura ambiente por 2 h.
5. Resuspenda as amostras coradas com 300 µ l de PBS, em seguida, adquirir dados de FACS e analisar com Cytobank plataforma²⁰ (http://cytobank.org/).

Resultados

Obtêm-se resultados representativos do protocolo descrito a seguir. Células de suspensão total da medula óssea foram cultivadas sob o sistema de diferenciação de alimentador-livre durante 11 dias; observou-se aumento significativo da taxa de proliferação de dia 7, em comparação com o número de células totais no dia 0 (Figura 1A). Células NK maduras com alta relação nuclear para o citoplasma e morfologia de citoplasma rico em grânulos foram en...

Discussão

No presente trabalho, descrevemos um método novo para produzir derivados de medula óssea murino NK células in vitro. O alimentador de célula no sistema original^21,22 é substituído com sucesso pelo meio condicional de células OP9, que em grande parte, aumentou a estabilidade do sistema de diferenciação. Além disso, o sistema pode produzir quantidade elevada, e a pureza da NK maduro células para em vitro , bem como na vivo ensaios, o que ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha celular OP9		ATCC ATCC® CRL-2749™
MEM α, sem nucleosídeos	Gibco	22561021
Soro Fetal Bovino	Gibco	10500064
PBS, pH 7,4	Gibco	10010049
Murino Recombinante IL-7	PEPROTECH	217-17
Murino Recombinante SCF	PEPROTECH	250-03
Murino Recombinante Flt3-Ligante	PEPROTECH	250-31L
Recombinante Murino IL-2	PEPROTECH	212-12
Lipofectamin RNAiMAX Transfecção Reagente	Invitrogen	1377815
Tampão de Fixação de IC	eBioscience	00-8222-49
Tampão de Coloração por Citometria de Fluxo	eBioscience	00-4222-26
Anti-camundongo conjugado com PE CD244	eBioscience	12-2441-83
Anti-camundongo conjugado com Cy3 NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Controle sem sentido (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA contra camundongo E4BP4 mRNA	Ribobio N	/ A	5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3 & principal;