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Estimulação do nervo cavernoso e gravação de pressão Intracavernous em um rato

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DOI:

10.3791/56807

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23 de abril de 2018

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1Biomedical Laboratory and the Research Unit of Urology, Department of Clinical Research, University of Southern Denmark, 2Department of Surgery, University of Vermont, 3Research Unit of Urology, Department of Clinical Research, University of Southern Denmark, 4Department of Urology, Odense University Hospital

Neste artigo

Resumo

Este estudo descreve um procedimento cirúrgico simplificado e técnica para a realização de estimulação do nervo cavernoso com o isolamento do nervo-eletrodo complexas usando cola de silicone e medição de pressão intracavernous.

Resumo

A estimulação do nervo cavernoso (CN) e a medida da pressão intracavernous (ICP) têm sido amplamente utilizados para testar e avaliar terapias para disfunção erétil. No entanto, os métodos usados variam entre laboratórios e armadilhas continuam a existir. O objetivo deste estudo foi descrever uma técnica cirúrgica que fornece um modelo confiável e reprodutível. Ao expor o músculo isquiocavernoso no seu ponto de inserção na tuberosidade isquial, as crus penianas podem ser canuladas com dissecção mínima e prejuízo para as estruturas envolvidas na função erétil. Estimulação repetida da NC, sem a necessidade de elevação e de secagem, foi alcançada por meio de um eléctrodo de prata bipolar µm 125 e cola de silicone biocompatível para isolar o complexo de eletrodo-nervo. Esse método impede a neurapraxia reduzindo o alongamento e secagem do nervo e fornece o completo isolamento do nervo, eliminando vazamento elétrico e impedindo a estimulação das vias alternativas.

Introdução

Estudo in vivo da função erétil em animais experimentais começou em 1863 com o trabalho experimental pioneiro de Eckhard1. Eletroestimulação dos nervos pélvicos foi usada para induzir o aumento da pressão Intracraniana em cães. Ao longo doséculo 20, protocolos experimentais similares foram usados em animais maiores, como cães, macacos, gatos e coelhos. Avaliando a função erétil em um rato foi desenvolvida pelo Quinlan et al , em 1989,2. O método já foi modificado e atualizado por vários outros grupos34. Hoje, o rato é o mais amplamente utilizado modelo animal para estudar a patologia da disfunção erétil e avaliando as opções de tratamento emergente. As principais etapas do processo incluem, gravação de pressão arterial sistêmica, usando uma linha na artéria carótida, canulação o peniana crus para medida de pressão Intracraniana e estimulação da NC para induzir um aumento da pressão Intracraniana. Embora diversos pesquisadores refinaram o modelo, sua reprodutibilidade continua a ser um problema, e resultados variáveis têm sido relatados por laboratórios diferentes. Várias armadilhas ainda persistem.

Anteriores artigos5,6,7,8,9,10 descrevem o uso de exposição completa do pênis com Desluvamento de pênis para canulação do corpo cavernoso. Isto não é uma abordagem ideal como manipulação e dissecação interrupções causa lesão às estruturas, que são essenciais para a função erétil. A dissecação da NC tem sido bem descrito10,11, mas a estimulação do nervo não é o ideal, devido a vários fatores que poderiam afetar os resultados experimentais. A técnica de estimulação CN inclui levantamento do nervo no tecido circundante puxando o eletrodo bipolar gancho, que é posicionado ao redor do nervo, e o nervo antes cada estimulação de secagem. Isso pode levar a vários graus de dano do nervo e escapamento corrente elétrico, resultando em uma resposta diminuída ou falso aumento a pressão Intracraniana através da estimulação dos caminhos alternativos , por exemplo, os músculos do assoalho pélvico, bexiga e gastrointestinal trato de12. Todos esses fatores limitam de reprodutibilidade.

Durante nosso estudo, observamos que a profundidade e o tipo de anestesia tem um profundo efeito sobre a pressão Intracraniana. Os anestésicos usados são pentobarbital de sódio, xilazina/cetamina ou cetamina/midazolam injeção ou inalação de oxigênio/isoflurano.

Aqui nós descrevemos um método simplificado de cirúrgico e fornecer dados para apoiar a padronização do protocolo experimental.

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Protocolo

Os animais estavam alojados na Universidade do Sul da Dinamarca animais cuidados instalação conforme as normas institucionais. Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com o guia de institutos nacionais de saúde para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Este é um procedimento de cirurgia aguda, não-sobrevivência.

1. preparação da tubulação, eletrodo e instrumentos para o procedimento cirúrgico

  1. Utilizar os seguintes instrumentos microcirúrgicos: tesoura cirúrgica, angulada micro tesoura, uma pinça de tecido, um par de Dumont #7 e #5 curvo micro fórceps, um porta-agulha micro e afastadores.
    Nota: Como se trata de um processo agudo, os instrumentos não precisam ser esterilizados. Após o uso, limpar e limpar as pontas com etanol a 70%.
  2. Mergulhe o tubo em etanol a 70% e em seguida, lave-o com estéril 0,9% NaCl com 100 heparina U/mL antes da utilização. Deixe o tubo preenchido para evitar a introdução de bolhas de ar no sistema.
  3. Corte um pedaço de comprimento de 20-30 cm de tubo de polietileno (PE)-50 tornar-se um cateter para a medição de pressão Intracraniana. Certifique-se de que o tubo é tão curto quanto possível reduzir a pressão de umedecimento.
  4. Dobre um estéril 24G agulha de lado até que a agulha quebra no meio. Conectar-se a peça com o chanfro à extremidade distal do tubo de PE para inserção nas crus penianas. Insira a outra metade para o hub de conexão para o transdutor de pressão. Encha o sistema com soro fisiológico heparinizado (100 U/mL).
  5. Para tornar o bipolar eletrodo revestido de Teflon, corte duas 125 µm prata fios de igual comprimento. Use um pedaço de fita para prender os fios para a borda da mesa e encadeie-os. Posteriormente, anexe o eletrodo para uma placa preta.
  6. Faça uma pequena incisão para o Teflon e use #5 micro fórceps para tira um 4-5 mm de comprimento do revestimento de Teflon das pontas dos eletrodos. Corte as pontas com um bisturi para atingir o mesmo comprimento e criar ganchos, dobrando as extremidades em torno da borda sem corte de uma lâmina de bisturi.
  7. Fita do eletrodo com o fim estendendo ligeiramente ao longo da borda da placa preta com os ganchos apontando para cima. Misture a cola de silicone em uma placa de plástico para 10 s e envoltório cola uma bolha em torno do eletrodo 1-2 mm do gancho.
  8. Deixe-o secar por aproximadamente 5 min antes do uso (Figura 1). Tira o Teflon de uma seção mais na outra extremidade, para permitir a conexão ao estimulador.
    Nota: Com re-fazer os ganchos na extremidade distal, o eletrodo pode ser reutilizado muitas vezes.

2. preparação do Animal

  1. Depois de anestesiar o animal, raspe a metade inferior do abdome, pescoço e períneo. Esfregue o animal com álcool 70%, seguido de iodo-povidona três vezes. Coloque o rato sobre uma almofada aquecida cirúrgica em posição supina. Aplicar a pomada de veterinário e passar a anestesia para um cone de nariz com 2,5% isoflurano e 0,8 L/min de oxigênio como o portador.
    Nota: Ajuste o nível de isoflurano e oxigênio para atingir um nível aceitável de anestesia.

3. pré-operatória preparação

  1. Executar todo o procedimento cirúrgico sob um microscópio de operação: uma ampliação variando de 3,15 X 20 X é suficiente. Use luvas e manter um ambiente limpo durante a cirurgia. Coloque o rato sobre um pano.

4. músculo isquiocavernoso dissecação para a medição de pressão Intracraniana

  1. Usar um bisturi, tesoura reta, e Dumont #7 curvo micro fórceps para fazer um 1 cm vertical pele incisão lateral de 5 mm para a linha média, começando a nível da base do pênis e estendendo-se para baixo (Figura 2A). Use um cotonete e separe com cuidado a fáscia lateral para o escroto (Figura 2B). Depois de dissecar a fáscia, anexar retractores e palpar com um algodão-com ponta-swap para encontrar a tuberosidade (Figura 2).
  2. Dissecar através do tecido adiposo medial deste ponto até o músculo isquiocavernoso é visualizado (Figura 3A). Usar um par de Dumont #7 curvo micro fórceps e longitudinalmente, separar o músculo. A túnica albugínea aparecerá como uma estrutura branca brilhante (Figura 3B). Usando micro fórceps e uma micro tesoura, expor a túnica albugínea adequadamente para ver o seu curso (Figura 3).
  3. Após a calibração das configurações de sistemas, inserir tubos através da pele no períneo, certificando-se de que está paralelo as crus do pênis (Figura 4). Deixe a linha no lugar e manter a incisão húmidas com soro fisiológico.

5. CN dissecação para estimulação

  1. Fazer um 2 cm mais baixo, incisão abdominal através da pele, usando, em primeiro lugar, um bisturi e então um par de tesouras reta e micro fórceps. Criar uma correspondente incisão através da fáscia ao longo da linea alba e o tecido muscular subjacente para expor a bexiga e a próstata.
  2. Use retractores para conseguir boa exposição. Use cotonetes de algodão-dica para separar a próstata do tecido adiposo para obter uma visualização clara do gânglio pélvica principal (MPG) e CN, correndo sobre o aspecto dorsolateral da próstata (Figura 5).
  3. Após a visualização do MPG e a CN, cuidadosamente incise a fáscia sobrejacente nervo distal para o MPG de 2 a 5 mm com tesoura micro em ângulo (Figura 6a). Com o uso de fórceps micro #5, espalhar o tecido de cada lado do nervo e por baixo dela para libertar uma parte longa de 4mm (Figura 6b) e deslize uma sutura de 9-0 sob o nervo (Figura 6C).
  4. Eleve o nervo ligeiramente com a ajuda da sutura (Figura 7a) para facilitar a colocação dos ganchos do eletrodo bipolar em torno do nervo (Figura 7b). Deixe a mistura um assistente a cola de silicone de dois componentes com a ponta de uma insulina agulha para 5 s. seca o nervo e aplique a cola na área ao redor dos ganchos e o nervo (Figura 7 c, d). Mantenha o nervo elevado puxando levemente o eletrodo para cerca de 1 min permitir que a cola secar.
  5. Remova os afastadores, exceto os afastadores no lado direito, para evitar qualquer puxando ou torção do eléctrodo. Molhe os órgãos expostos com salina e leigo gaze embebida em soro fisiológico sobre a incisão.

6. cavernoso corpo canulação para a medição de pressão Intracraniana

  1. Restaure a visualização da túnica albugínea usando afastadores. Certifique-se não anexar os afastadores para o músculo isquiocavernoso como ele irá distorcer as crus.
  2. Fixe a agulha e lavar o tubo com soro fisiológico heparinizado antes de introduzi-lo na túnica albugínea. Manter a túnica albugínea esticada, usando Dumont #7 curvo micro fórceps em uma mão (não-dominante), mantendo a túnica albugínea e o resto do músculo sobrejacente distal ao ponto de inserção. Segure a agulha com pinça micro direto na outra mão dominante e certifique-se de apresentá-lo paralelo com o curso do corpo cavernoso (Figura 8).
  3. Introduza a agulha de 5-8 mm o corpo cavernoso. Lavar o tubo e pressione as crus para testar a linha (Figura 9). Certifique-se de que não existem fugas. Fixe o tubo à mesa com fita para evitar puxar acidental na linha. Remova os afastadores.

7. estimulação da NC

  1. Com o programa de gravação (por exemplo, Spike 2) continuamente executando, gravar tanto a pressão arterial média e intracavernous.
  2. Definir os seguintes parâmetros em um estimulador (por exemplo, instrumentos de grama SD9, consulte Tabela de materiais) para a estimulação de CN: atual em 1,5 mA, frequência de 16 Hz, tensão de 3 V e largura de pulso em 5 ms. aplicar 50 s de estimulação com um mínimo de 1 min de descanso entre estímulos.
    Nota: As estimulações primeiras geralmente resultam em resposta diminuída (Figura 10).

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Resultados

O uso deste protocolo com as configurações recomendadas de estimulação, sob anestesia por inalação com oxigênio de 2,0% de isoflurano 0,8 L/min, deve produzir resultados como mostrado na Figura 11 e Figura12, onde há vários de costas estímulos entre 75-80 mm Hg. Figura 13 mostra a mesma resposta estável sobre uma estimulação de 20 min com a resposta estável em 73-77 mm Hg. o teste da linha para m...

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Discussão

O principal objetivo deste estudo foi descrever uma técnica cirúrgica simplificada de canulação peniana crus para gravação de ICP e isolamento da NC para eletroestimulação. Nós introduzimos modificações para a dissecação do corpo cavernoso para simplificar a cirurgia e proporcionar gravações reprodutíveis do aumento do ICP com estimulação de CN. Com uma incisão de pele vertical de 1 cm, lateral para a base do pênis, usando a tuberosidade palpável como orientação, atingimos boa exposição do isquiocavernoso muscular e a tú...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores têm sem agradecimentos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Adson fórcepsFine Science Tool11006-12
Dumont # 7 fórcepsFine Science Tool11271-30
Dumont # 5 fórcepsFine Science Tool11273-20
ToughCut Mayo tesouraFine Science Tool14110-15
Miniatura Vannas Spring scissorFine Science Tool15006-09
Ferramenta de ciência finade hemostato ultrafino13020-12
Ferramenta de ciência finade hemostato crile13004-14
Kwik-Sil AdesivoWorld Precision InstrumentsKWIK-SIL
Fio de prata revestido de teflon 0,125 mmInstrumentos de precisão mundialAGT0510
Retratores de fio elásticofeitos sob medida
Lâmina de bisturiFine Science Tool10023-00
PE-50 tubulaçãoWarner Instruments64-0753
23 G AgulhaKruuse121272
SD-9 Estimulador de pulso quadradoSomatco1077/183
Transdutor e cabo de pressão arterialWorld Precision InstrumentsBLPR2
Raucotupf Aplicadores com ponta de algodãoLohmann-Raucher11966
Bastões oculares Pro-ophtaLohmann-Raucher16515
NaCl 0,9 % 100 mLFarmácia
HeparinaFarmácia
25 mL SeringaHospital Universitário
Pomada para os olhos veterinários - ViscotearsFarmácia
localfios de prata Science Products GmbH, Heidelberg, Alemanha
Cola de SilícioKwik-Sil, Instrumentos de Precisão Mundial, Sarasota, FL, EUA
locallocalOdense

Referências

  1. Eckhard, C. Untersuchungen über die Erektion des Hundes In: Beiträge zur Anatomie und Physiologie. , Vol. Band III Giessen: Ferber 123-166 (1863).
  2. Quinlan, D. M., Nelson, R. J., Partin, A. W., Mostwin, J. L., Walsh, P. C. The rat as a model for the study of penile erection. J Urol. 141 (3), 656-661 (1989).
  3. Heaton, J. P., Varrin, S. J., Morales, A. The characterization of a bio-assay of erectile function in a rat model. J Urol. 145 (5), 1099-1102 (1991).
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  14. Mullerad, M., Donohue, J. F., Li, P. S., Scardino, P. T., Mulhall, J. P. Functional sequelae of cavernous nerve injury in the rat: is there model dependency. J Sex Med. 3 (1), 77-83 (2006).
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