Apresentamos um método de análise microfluidic de linhagens de células bacterianas individuais usando Bacillus subtilis como exemplo. O método supera deficiências dos métodos tradicionais de análise em microbiologia, permitindo a observação de centenas de gerações de células sob condições de crescimento firmemente controlável e uniforme.
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Artigo de método
Célula única Microfluidic análise de Bacillus subtilis
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microfluidic tecnologia supera muitas das limitações que os métodos analíticos tradicionais em microbiologia. Ao contrário de métodos de cultura de massa, oferece resolução de célula única e longa observação vezes abrangendo centenas de gerações; ao contrário de agarose baseada em almofada microscopia, tem condições de crescimento uniforme que podem ser rigidamente controladas. Porque o fluxo contínuo de meio de cultura isola as células em um dispositivo microfluidic de variações imprevisíveis no ambiente químico local causada pelo crescimento celular e metabolismo, autênticas alterações na expressão gênica e crescimento celular em resposta a estímulos específicos podem ser observados com mais confiança. Bacillus subtilis é usado aqui como uma espécie de bactéria modelo para demonstrar uma máquina de"mãe"-digite o método para análise de celular. Mostramos como construir e interpretar um dispositivo microfluidic, carregá-lo com células, iniciar a geração de imagens microscópica e expor as células a um estímulo, passando de um meio para outro. Um repórter de stress-responsivo é usado como um exemplo para revelar o tipo de dados que podem ser obtidos por esse método. Nós também brevemente discutir aplicações desse método para outros tipos de experimentos, tais como análise de esporulação bacteriana.
Introdução
Uma das características mais marcantes da vida na terra é sua grande resiliência e variedade. Um objetivo central da biologia molecular é entender a lógica pela qual células usam genes e proteínas para maximizar seu crescimento e aptidão sob uma ampla variedade de condições ambientais. Para atingir este objetivo, os cientistas devem ser capazes de observar com confiança como células individuais crescem, dividem e expressam seus genes sob um determinado conjunto de condições, observando como as células respondem às alterações subsequentes no seu ambiente. No entanto, os métodos analíticos tradicionais em microbiologia têm limitações técnicas que afetam os tipos de perg....
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Protocolo
1. PDMS dispositivo Casting
- Em um ambiente livre de poeira, mistura de polímero PDMS e agente de cura, na proporção de 10:1 e desgaseificar sob vácuo durante pelo menos 10 minutos.
- Coloque um mestre de silício (ou mesmo uma réplica de epóxi ou poliuretano) num pedaço de papel alumínio ininterrupta em uma placa de Petri de poliestireno. Despeje a mistura PDMS a desgaseificado sobre o mestre a uma profundidade de aproximadamente 5 mm. Degas a placa de Petri de pelo menos 10 min. Use uma ligeira corrente de ar para quebrar as bolhas de superfície.
Nota: As dimensões do dispositivo dois-tiered utilizados são fornecidas no acompanha arquivo CAD.
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Resultados
Bem sucedida célula inicial de carregamento, avaliada por microscopia de contraste de fase, antes de fixar o encanamento microfluidic o dispositivo, seria considerada como tendo todos ou quase todos os canais do lado microfluidic contendo uma ou mais células bacterianas ( Figura 3A). Carga ideal mostraria várias células em cada canal, mas canais, no entanto, vão encher de células devido a crescimento celular durante o período de equilíbrio (
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Discussão
Este protocolo de microfluídica é flexível, em que muitos dos passos podem ser modificados para otimizar o seu uso com uma determinada espécie ou cepa ou para uma finalidade específica. Com efeito, neste protocolo, fizemos modificações para o original de "máquina de mãe" conceito4 para otimizar seu uso com b. subtilis. Muitas vezes, as trincheiras em que as células estão confinadas constituem um recurso de camada única, Considerando que neste protocolo usamos trincheiras da dois-camada ce.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este projecto foi financiado pelo National Institutes of Health, sob GM018568. Este protocolo foi realizado em parte no centro para sistemas de nanoescala (CNS), um membro do nacional nanotecnologia coordenada infra-estrutura de rede (NNCI), que é apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob prêmio NSF n º 1541959. CNS é parte da Universidade de Harvard. Muitos agradecimentos são devidos a Thomas Norman e Nathan Senhor por seu trabalho em conceber e fabricar o modelo mestre, usado para os dispositivos mostrados aqui e na construção da versão original do aparelho. Também agradecemos a Johan Paulsson por sua valiosa colaboração assessoria e agradecer aos membros de seu....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de elastômero de silicone Sylgard 184 | Dow Corning | (240)4019862 | Isso é chamado de PDMS no protocolo. Existem 2 componentes que são misturados na proporção de 10:1 |
| punção de biópsia de 0,75 mm | Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm Vidro de cobertura nº 1,5 | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | Instrumento PE-50 | usado para ligar PDMS ao vidro usando tratamento de plasma de oxigênio |
| Tubulação flexível Tygon ID 0,02", OD 0,06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | Para a parte principal da tubulação, por exemplo, presa às agulhas |
| Tubulação de silicone, 0,04" ID, 0,085" OD | Tubulação de silicone padrão HelixMark | 60-795-05 | Para válvulas de aperto e conexão de junção em Y |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Usado como agente de passivação |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | Para carregar o dispositivo com meio e células |
| Filtro de seringa Acrodisc de 32 mm com 5-μ m Supor membrana | Pall Life Sciences | 4560 | Para filtrar culturas antes do carregamento do dispositivo |
| Agulhas rombas de 21 ga, | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| com farpas da série 200, tubulação de identificação de 1/16", polipropileno | Nordson Medical | Y210-6005 | A empresa é AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E microscópio invertido | Nikon | Esta unidade foi descontinuada pelo fabricante e é substituída pela Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis cepa NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | cepa parental de tipo selvagem modificada para uso nos experimentos mostrados neste protocolo |
| Forno de convecção por gravidade | VWR | 414005-106 | para cura PDMS e cozimento montado dispositivos |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | pode ser usado para unir um wafer de silício a uma placa de apoio de alumínio |
| Fita adesiva Scotch, 3/4" de largura | 3M | para limpar a poeira dos dispositivos PDMS e para colocar sobre recursos para aumentar a visibilidade (denotado "fita de escritório" ou "fita adesiva" no protocolo) | |
| Estereomicroscópio | Nikon | SMZ800N | listado aqui como um exemplo; quase qualquer estereomicroscópio fará |
| álcool isopropílico | Sigma-Aldrich | W292907 | Para limpar a tampa de vidro |
| Bomba de serra, 6 canais | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | uma marca de lenços umedecidos sem poeira |
Referências
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al.
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Reimpressões e permissões
