Artigo de método

Medição de deformabilidade e heterogeneidade de glóbulos vermelhos no sangue por Ektacytometry

DOI:

10.3791/56910

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12 de janeiro de 2018

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1Department of Pediatrics, Saint Louis University School of Medicine, 2Molecular and Clinical Nutrition Section, Digestive Diseases Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 3Molecular and Clinical Hematology Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 4Sickle Cell Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 5Edward A. Doisy Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saint Louis University School of Medicine, 6Red Cell Physiology Laboratory, New York Blood Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui nós apresentamos técnicas para medir a deformabilidade eritrócitos e heterogeneidade celular por ektacytometry. Estas técnicas são aplicáveis às investigações gerais de deformabilidade eritrócitos e investigações específicas de doenças do sangue caracterizadas pela presença de eritrócitos rígidas e deformáveis em circulação, tais como anemia falciforme.

Resumo

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Deformabilidade eritrócitos diminuída é característica de vários distúrbios. Em alguns casos, o grau de deformabilidade defeituoso pode prever a severidade da doença ou a ocorrência de complicações sérias. Ektacytometry usa a laser viscosidade de difração para medir a deformabilidade dos glóbulos vermelhos, sujeitos a crescente tensão de cisalhamento ou um gradiente osmótico em um valor constante de tensão de cisalhamento aplicada. No entanto, medições de deformabilidade direto são difíceis de interpretar quando medindo sangue heterogênea que se caracteriza pela presença de eritrócitos rígidas e deformáveis. Isto é devido à incapacidade das células rígidas para alinhar corretamente em resposta à tensão de cisalhamento e resulta em um padrão de difração distorcida, marcado por uma exagerada diminuição da deformabilidade aparente. Medição do grau de distorção fornece um indicador da heterogeneidade das hemácias no sangue. Na anemia falciforme, isto está correlacionado com a porcentagem de células rígidas, que reflete a concentração de hemoglobina e a composição da hemoglobina das hemácias. Além de medir a deformabilidade, ektacytometry gradiente osmótico fornece informações sobre a fragilidade osmótica e o status de hidratação de eritrócitos. Estes parâmetros também refletem a composição da hemoglobina das células vermelhas do sangue de pacientes de anemia falciforme. Ektacytometry mede deformabilidade em populações de células vermelhas e não, portanto, fornecer informações sobre a deformabilidade ou propriedades mecânicas de eritrócitos individuais. Independentemente disso, o objetivo das técnicas descritas neste documento é fornecer um método conveniente e confiável para medir a deformabilidade e heterogeneidade celular do sangue. Estas técnicas podem ser úteis para monitorar mudanças temporais, bem como a progressão da doença e resposta à intervenção terapêutica em diversos transtornos. A anemia falciforme é um exemplo bem caracterizado. Outros distúrbios potenciais onde medidas de deformabilidade eritrócitos e/ou heterogeneidade são de interesse incluem o armazenamento de sangue, diabetes, infecção Plasmodium , deficiência de ferro e as anemias hemolítica devido a defeitos de membrana.

Introdução

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Ektacytometry fornece uma medida conveniente de deformabilidade eritrócitos em resposta a alterações na tensão de cisalhamento (medida em Pascal (Pa)), ou suspendendo a osmolalidade média. Parâmetros pertinentes de deformabilidade eritrócitos incluem o índice de alongamento máximo (Max de El), uma medida da máxima da deformabilidade de uma célula vermelha em resposta à crescente tensão de cisalhamento e a tensão de cisalhamento ½ (SS ½), a tensão de cisalhamento necessária para alcançar o máximo de metade deformabilidade. 1 ektacytometry gradiente osmótico tem vários parâmetros informativos. Estes incluem o índice de alongamento mínimo (EI Min), uma medida da proporção de superfície e o volume e a osmolalidade em que ocorre (O Min), que é uma medida de fragilidade osmótica. EI Max e a osmolalidade em que ocorre (O (EI Max)) fornecem informações sobre a área de superfície da membrana flexibilidade e celular. Alongamento máximo metade no braço hipertônico do gradiente osmótico é representado pela EI hiper. EI hiper e a osmolalidade em que ele ocorre, O hiper, fornecem informações sobre a viscosidade intracelular da célula vermelha que é determinada pela concentração de hemoglobina. 2 , 3 medição deformabilidade em sangue heterogêneo é complicada pelo fato de que células rígidas, tais como glóbulos vermelhos falciformes, não alinhar corretamente com a direção do fluxo, tais como células deformáveis em resposta ao aumento da tensão de cisalhamento. Em vez de produzir uma imagem de difração característicos de elíptico, rígidas células produzem um padrão esférico que resulta em um padrão de difração em forma de diamante quando sobrepostos sobre a elipse produzida pelas células deformáveis. 4 , 5 , 6 o padrão esférico foi mostrado para corresponder a células falciformes irreversíveis, realizando ektacytometry em frações isoladas das células após centrifugação de densidade. 6 o cálculo do índice de alongamento inclui medidas de ambos os longa e curta eixo da elipse; uma forma de diamante, portanto, produz uma diminuição aparente no alongamento, aumentando a largura do eixo curto. 7 anteriormente mostrou que o grau de distorção do padrão de difração está correlacionado com a porcentagem de hemoglobina falciforme (HbS) e a percentagem de células falciformes no sangue de pacientes com anemia falciforme. 5 o grau de distorção do padrão de difração pode ser obtido por análises matemáticas complexas. 8 pode também ser obtido ajustando a abertura da abertura da câmera sobre o ektacytometer ou nível de cinza do encaixe software para alterar a altura do padrão de difração. 5 no entanto, detalhes sobre como ajustar o nível de cinza não estão bem definidos e a abertura da câmera não é facilmente acessível sobre a geração mais recente de ektacytometer o comercialmente disponível. Para contornar esses problemas, o ganho facilmente acessível câmera pode ser usado para ajustar alturas padrão de difração. 9 usar esse método para estimar a heterogeneidade celular, o grau de distorção do padrão de difração pode ser correlacionado com a porcentagem de hemoglobina fetal no sangue de pacientes com anemia falciforme. 10 vários parâmetros ektacytometry gradiente osmótico da mesma forma são correlacionados com a porcentagem de fetal ou foice de hemoglobina no sangue de pacientes com anemia falciforme. Correlações de distorção da padrão de difração provavelmente refletem a contribuição da composição da hemoglobina para a percentagem de células rígidas, não deformável. De interesse adicional, o perfil de toda ektacytometry gradiente osmótico sofre alterações de bifásico que correspondem à percentagem de células densas em circulação durante a crise falciforme. 11

Ektacytometry também é útil no estudo de várias outras doenças. Ektacytometry gradiente osmótico é diagnóstico para os distúrbios de membrana eritrócitos herdadas, como esferocitose hereditária, elliptocytosis hereditária e pyropoikilocytosis hereditária. 3 , 12 , 13 , 14 deformabilidade diminuição ocorre na deficiência de ferro. 15 caracterização da lesão de"armazenamento" de sangue empregou ektacytometry e futuros estudos investigando tanto a natureza da lesão e intervenções para prevenir a sua formação durante o armazenamento de sangue bancado são susceptíveis de beneficiar o técnicas aqui apresentadas. 16 diminuição eritrócitos deformabilidade também tem sido correlacionada com doença microvascular em diabetes. 17 estudos recentes vinculando hiperglicemia, concentrações de ascorbato de eritrócitos e fragilidade osmótica sugerem que estes fatores podem ser importantes no desenvolvimento da doença microvascular. 18 Ektacytometry estudos estão em andamento para investigar esta hipótese (Parrow e Levine, dados não publicados). Infecção da malária do sangue palco é outro interessante Avenida das investigações de deformabilidade eritrócitos. Deformabilidade celular de Plasmodium falciparum infectados células vermelhas do sangue diminui drasticamente durante as 48 horas de maturação intracelular do parasita de palco anel palco schizont. Evidências indicam que esta diminuição da deformabilidade é revertida após a maturação do parasita. A reversão coincide com o lançamento de eritrócitos infectados na circulação. Diminuição da deformabilidade é pensada para ser mediado por proteínas de Plasmodium que promovem o sequestro da célula vermelha. 19 estes estudos representam uma pequena amostra das condições clinicamente importantes, onde a medição deformabilidade eritrocitária e parâmetros de gradientes osmóticos são relevantes. Existem várias áreas adicionais de estudo.

Técnicas alternativas para medir deformabilidade eritrócitos incluem Pinça óptica (também conhecida como armadilhas do laser), que utilizam as propriedades físicas dos fótons para esticar as células vermelhas do única em uma ou mais direções. 20 esta técnica tem a vantagem de medir a deformabilidade dos eritrócitos único, mas alguma incerteza na calibração de força produziu considerável variabilidade através de de estudos 21 e análise de dados pode ser trabalhosa a menos automatizado. 22 aspiração micropipeta, que utiliza pressão negativa para aspirar um eritrócito para uma micropipeta, também tem sido usada para medir a deformabilidade das células vermelhas. 7 , 23 medições múltiplas, tais como a pressão necessária para aspirar os eritrócitos, são possíveis com cada medida definem características diferentes da célula vermelha. 23 , microscopia de força atômica é uma técnica de alta resolução que mede a rigidez da membrana através da quantificação de deflexão de feixe de laser como um indicador da deflexão do cantilever, ao longo da superfície de uma célula vermelha. 24 estas técnicas fornecem informações sobre eritrócitos individuais, não são facilmente adaptados para medir mudanças nas populações de células vermelhas do sangue e, em geral, exigem conhecimentos técnicos consideráveis.

O desejo de experimentar tanto individual e populações de células simultaneamente tem levado a avanços na automação e o desenvolvimento de microfluídica e métodos baseados em matriz. Como ektacytometry, rheoscopy medidas de deformabilidade em função da tensão de cisalhamento, mas imagens são adquiridas diretamente através do microscópio. 25 para maiores Coloque-através de análises, imagem latente da pilha automatizado foi empregado para produzir distribuições de deformabilidade usando o rheoscope. 26 heterogeneidade celular pode ser quantificada por esse método se estiverem disponíveis dados de um assunto de controle saudável. 27 técnicas de microfluídica também permitem altas Coloque-através de análises de células únicas; vários projetos utilizando adaptações de filtração, analisadores de trânsito de célula28 ,29 , que mede o tempo necessário para um fluxo de eritrócitos através um micropore e alternativas que medem a pressão necessária para o trânsito de eritrócitos bastante que tempo 30 foram desenvolvidos. Outra plataforma para alta Coloque-através de análise de células individuais é o chip de matriz única célula microchamber, que tem a vantagem adicional de permitir para jusante caracterização baseada em fluorescência das células. 31 embora cada uma dessas técnicas é potencialmente útil e pode ser superior para aplicações específicas, as vantagens comparativas de ektacytometry inclui sensibilidade, facilidade de uso e precisão. 32 a última geração de ektacytometers comercialmente disponível também possuem versatilidade considerável no número de ensaios que podem ser executadas.

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Protocolo

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Todas as disciplinas neste estudo deram consentimento escrito em conformidade com a declaração de Helsínquia e os protocolos nacionais institutos de saúde institucional Review Board aprovado.

1. ligar o ektacytometer

  1. Conecte o tubo de solução de limpeza para as soluções de polivinilpirrolidona (PVP) de baixa e alta osmolar. Tenha cuidado para conectar-se a 0 osmolar à baixa osmolar solução a 500 osmolar tubo e para a solução de alta osmolar.
    Nota: A solução PVP osmolar baixa deve ter uma osmolalidade entre 35 e 55 milliosmoles por quilograma (mOsm/kg), um pH de 7.25-7,45 a 25 ° C e uma viscosidade entre 27,0 e 33,0 centipoise (cP) a 37,0 ± 0,5 ° C. A solução PVP osmolar elevado deve ter uma osmolalidade entre 764 e 804 mOsm/kg, um pH de 7.25-7,45 a 25 ° C e uma medida de viscosidade de cP 27,0 33,0 37,0 ° 0,5 ° C.
  2. Certifique-se de que o bob é reduzido completamente no copo. Inicie o programa e acione a máquina (Hardware verificar | IO do instrumento). Permitir que o instrumento completar o ciclo de escorva. Uma vez que o ciclo está completo, levante o bob fora do copo e seque completamente o bob e o copo com um fiapo de baixo tecido de limpeza.
    Nota: Água residual irá lisar eritrócitos, produzindo interferência.

2. medir a deformabilidade em função do aumento da tensão de cisalhamento

  1. Obter sangue (menor que 1 mL é adequada para realizar estas técnicas com Replica) no tubo de ensaio contendo anticoagulante apropriado.
    Nota: EDTA é preferido por heparina, porque tem menos influência sobre parâmetros de hemorheological. 33 sangue manter à temperatura ambiente se as medições são realizadas dentro de 6 horas de sangue de desenhar.
  2. Misture suavemente a amostra de sangue total antes de testar o frasco várias vezes por inversão. Adicione 25 µ l de sangue total para 5 mL de solução PVP iso-osmolar pipetando, tampar o frasco e misture suavemente várias vezes por inversão. A solução PVP iso-osmolar deveria ter uma osmolalidade entre 284 e 304 mOsm/kg, um pH de 7,3-7,4 a 25 ° C e uma viscosidade de cP 27,0 33,0 37,0 ± 0,5 ° C.
  3. Sobre o software escolha deformabilidade do menu principal. Criar uma nova análise e adicionar detalhes experimentais (deformabilidade | Adicionar detalhes desejados | Okey).
    1. Levante a tampa para ektacytometer, verifique se o bob é totalmente abaixado no copo e o copo está se transformando.
    2. Adicione 1 mL de solução PVP sangue para o espaço entre o copo e bob pipetando.
    3. Levante o bob ligeiramente para derrubar as amostras. Espere até todas as bolhas têm saído a solução e, em seguida, feche a tampa para o ektacytometer. Se necessário, pressione o botão de aspiração para ajudar a remover as bolhas.
  4. Ajuste o ganho de 200 movendo a seta ao longo da barra de rolagem no software (ver nota). Quando a temperatura é estável a 37 ° C e a imagem de difração é estável, pressione Iniciar (Iniciar).
    Nota: Para muitos estudos, uma imagem boa de difração pode ser obtida (hemoglobina concentração > 12,0 g / dL, volume corpuscular médio de 80-96 fL e concentração de hemoglobina corpuscular média de 33-36 g/dL) de sangue saudável, com o ganho de câmera definido para 200. Para estudos de sangue da anemia falciforme, ajustar o ganho da câmera para gerar uma imagem de difração de 4,5 cm tem sido sugerido como a configuração padrão para permitir a comparação de resultados através de estudos e laboratórios. 9
  5. Observe os padrões de difração como progride de aquisição de dados para garantir que eles permaneçam circular, elíptica ou em forma de diamante. Quando a aquisição de dados é concluída, salvar ou imprimir o relatório (arquivo | Salvar ou arquivo | Impressão). EI Max e SS ½ valores serão relatados automaticamente, juntamente com os índices de alongamento correspondente ao usuário especificado ou padrão tensões de cisalhamento. Dados serão também salvos automaticamente pelo software.
  6. No final, pressione a opção limpa na caixa de diálogo no monitor do computador (Clean). Depois que a amostra é aspirada, enxágue o espaço entre o copo e bob por esguichar água desionizada para o espaço, enquanto o instrumento permanece no ciclo de limpeza. Concluído o ciclo limpo, levantar o bob fora do copo e seque completamente o bob e o copo com um fiapo de baixo limpeza tecido (crítica: água Residual irá lisar eritrócitos, produzindo interferência).
  7. Clique no botão do Menu principal do software para retornar à página principal (Main Menu).

3. medição heterogeneidade celular

  1. Misture suavemente a amostra de sangue total antes de testar o frasco várias vezes por inversão. Pipetar 25 µ l de sangue total para um novo frasco de 5 mL de iso-osmolar solução PVP, tampar o frasco e misture suavemente, invertendo-se até obter uma mistura homogênea.
  2. Escolha a deformabilidade do menu principal. Criar uma nova análise e adicionar detalhes experimentais (deformabilidade | Adicionar detalhes desejados | Okey).
    1. Levante a tampa para ektacytometer, verifique se o bob é totalmente abaixado no copo e o copo está se transformando.
    2. Pipetar 1 mL da solução de sangue de PVP para o espaço entre o copo e bob.
    3. Espere até todas as bolhas têm saído a solução e, em seguida, feche a tampa para o ektacytometer.
    4. Certifique-se de que uma imagem de difração estável está presente na tela. Ajuste o ganho da câmera movendo a seta junto a barra de rolagem no software até produz um 3,8 cm de altura de difração. Use uma régua para verificar a altura da imagem na tela do computador.
  3. Quando a temperatura é estável a 37 ° C e a imagem de difração é estável, pressione Iniciar (Iniciar).
  4. Observe os padrões de difração como progride de aquisição de dados para garantir que eles permaneçam circular, elíptica ou em forma de diamante. Quando a aquisição de dados é concluída, salvar ou imprimir o relatório (arquivo | Salvar ou arquivo | Impressão).
  5. No final, pressione a opção limpa na caixa de diálogo no monitor do computador (limpar). Depois que a amostra é aspirada, enxágue o espaço entre o copo e bob por esguichar água desionizada de uma garrafa de esguicho nele, enquanto o instrumento permanece no ciclo de limpeza. Concluído o ciclo limpo, levantar o bob fora do copo e seque completamente o bob e o copo com um fiapo de baixo limpeza tecido (crítica: água Residual irá lisar eritrócitos, produzindo interferência).
  6. Repita os passos 2.1-2.5 e ajustar o ganho da câmera para obter uma altura de padrão de difração de 4,5 cm (passo 2.2).
  7. Repita os passos 2.1-2.5 e ajustar o ganho da câmera para obter uma altura de padrão de difração de 5,4 cm (passo 2.2).
  8. No final, clique no botão de menu principal para retornar à página principal do software (Menu principal).
  9. Para determinar o grau de distorção de padrão de difração baseado no EI Max como uma porcentagem, use a seguinte equação (a mesma equação pode ser realizada com os dados a partir da altura de padrão de difração de 4,5 cm se desejado):
    figure-protocol-1
  10. Da mesma forma, para determinar o grau de difração distorção padrão com base em SS1/2 uso a mesma equação com o valor relatado do SS1/2:
    figure-protocol-2

4. osmótica ektacytometry gradiente

  1. Obter amostra conforme descrito no ponto 1.1. Misture suavemente a amostra de sangue total antes de testar várias vezes por inversão. Adicionar 250 µ l de sangue total para 5 mL frasco PVP de iso-osmolar pipetando, tampar o frasco e misture suavemente, invertendo-se até obter uma mistura homogênea.
  2. Escolha osmoscan no menu principal (Osmoscan). Coloque o frasco que contém o sangue, solução PVP por baixo da agulha do lado esquerdo da máquina. Abaixe a agulha até que toque o fundo do frasco. Certifique-se de tubulação está correctamente ligada às soluções para a produção de gradiente osmolar de baixa e alta. Feche a tampa para o ektacytometer e abra a porta na metade inferior, para que você pode assistir o sangue entrar no tubo.
  3. Pressione nova análise e tipo em detalhes experimentais (Osmoscan | Nova análise | Inserir os dados desejados | Okey). Ajuste o ganho da câmera para 200 movendo a seta controlá-la no software e deixe a máquina funcionar até sangue é visto entrando a Taça do tubo sob o instrumento.
    1. Uma vez que o sangue entrou a taça e uma imagem do padrão de difração estável é na tela do computador, iniciar aquisição de dados pressionando o começo agora botão na caixa de diálogo (começar agora).
  4. Permitir que o ektacytometer adquirir dados até aproximadamente 500 mOsm/kg e, em seguida, pare o instrumento. Salvar ou imprimir o relatório (arquivo | Salvar ou arquivo | Impressão). Dados também salvará automaticamente.
  5. Remova o frasco de PVP-sangue velho. Substituí-lo com um frasco limpo contendo água desionizada. Coloque-o debaixo da agulha, traga a agulha para baixo assim que toca o fundo do frasco e pressione o botão de enxágue na caixa de diálogo para enxaguar o sistema gradiente (enxaguar).
  6. Uma vez concluída a lavagem, pressione a opção limpa na caixa de diálogo no monitor do computador (Clean). Concluído o ciclo limpo, levantar o bob fora do copo e seque completamente o bob e o copo com um fiapo de baixo limpeza tecido (crítica: água Residual irá lisar eritrócitos, produzindo interferência).
    Nota: O relatório de osmoscan fornece índices de alongamento através do gradiente osmótico. EI Min O (EI Min), EI Max, O (El Max), EI hiper e O hiper são gerados automaticamente e incluídas no relatório. É o intervalo de ektacytometry gradiente osmótico parâmetros obtidos de sangue de 9 voluntários saudáveis: EI Min 0.12-0.196 unidades arbitrárias (u.a.); O Min 117-144 mOsm/kg; EI Max 0.551-0.573 u.a.; Ó (EI Max) 272-312 mOsm/kg; EI 0.278 hiper-0.286; O hiper 454-505 mOsm/kg.

5. desligar o ektacytometer

  1. Limpe o aparelho corretamente antes de ele é parar.
    1. Para fazer isso, conecte o tubo das soluções osmolar de baixa e alta para o adaptador em y levando a solução de limpeza. Coloque um frasco contendo solução de limpeza abaixo da agulha do lado esquerdo da máquina e abaixe a agulha até que toque o fundo do frasco. Certifique-se de que o bob é reduzido completamente no copo.
    2. Fechar o software e a imprensa começam na extremidade dia limpa caixa de diálogo no monitor do computador (perto | Iniciar). Permitir que o instrumento percorrer limpeza completamente.
  2. Desconecte o tubo no frasco de resíduos e removê-lo do instrumento para descarte de resíduos. O bob seque completamente. Desliga a máquina.

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Resultados

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Os resultados do ektacytometry descritos neste manuscrito podem ser usados para medir a deformabilidade eritrócitos em qualquer condição. Um diagrama esquemático do conjunto geral acima de um ektacytometer é mostrado na Figura 1. Populações homogêneas de eritrócitos irão produzir um padrão de difração elíptica em resposta ao aumento da tensão de cisalhamento que pode ser usado para calcular o índice de alongamento, como mostrado na Figura...

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Discussão

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As ektacytometry técnicas descritas são simples e bem automatizado, garantindo resultados válidos e reproduzíveis. No entanto, existem algumas etapas críticas. Controle de temperatura adequada do sangue é importante. Armazenamento em temperatura ambiente por mais de oito horas pode afetar SS ½ valores. 34 garantir que a temperatura da máquina é estável a 37 ° C também é importante, como a viscosidade do meio de suspensão é dependente de temperatura. Sangue deve ser totalmente oxigenado para evitar...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa Intramural dos institutos nacionais de Diabetes, digestivo e doenças renais e nacional do coração, pulmão e sangue Instituto do institutos nacionais da saúde. As opiniões aqui expressadas são da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos institutos nacionais de saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
LoRRca MaxSis versão padrãoMecatrônicaLORC109000
LoRRca MaxSis Mecatrônica OsmoscanLORC109001
Solução de Polivinilpirrolidona (PVP) 0mOsmMecatrônicaQRR030910
Solução de Polivinilpirrolidona (PVP) 500mOsmMecatrônicaQRR030930
Solução de Polivinilpirrolidona (PVP) 5mL frascosMecatrônicaQRR030901
X limpoMecatrônicaQRR010946
P1000 MilliporeSigmaZ646555
P200MilliporeSigmaZ646547
P200MidSciAV200-H
Pontas de filtro P1250MidSciAV1250-H
KimwipesMidSci8091
Tubos eppendorf de 1,5 mLMidSciAVSS1700
frasco cônico de 15 mLMidSciC15R
Pontas de filtro Pontas de filtro

Referências

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