Aqui nós apresentamos um protocolo para aumentar a produção da Quimera sem o uso de novos equipamentos. Uma mudança de orientação simples do embrião para injeção pode aumentar o número de embriões produzidos e potencialmente reduzir a linha do tempo de transmissão da linha germinal.
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Artigo de método
Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em um esforço para aumentar a eficiência na criação de ratos geneticamente modificados através de metodologias de célula ES, apresentamos uma adaptação para o atual protocolo de injeção de blastocisto. Aqui nós relatamos que uma simples rotação do embrião e injeção através de massa celular de Trans-interior (TICM) aumentou a porcentagem de ratos quiméricoes de 31% para 50%, sem nenhum equipamento adicional ou formação mais especializada. e mais uns 26 diferentes clones, e 35 totais clones foram injetados ao longo de um período de 9 meses. Não houve nenhuma diferença significativa entre as técnicas tradicionais de injeção e TICM na taxa de gravidez ou taxa de recuperação de embriões. Portanto, sem qualquer alteração importante no processo de injeção e um simples posicionamento do blastocisto e injetando através do ICM, liberando as células ES na cavidade blastocoel pode potencialmente aumentar a quantidade de produção quimérico e subsequente transmissão da linha germinal.
Introdução
Por quase 25 anos, a criação de camundongos geneticamente alvo tem sido um processo lento, muitas vezes prejudicado por um gargalo na fase de microinjeção de blastocistos ES celular para a geração de germline transmitindo quimeras. Recentes avanços, incluindo CRISPR/Cas91,2 direcionamento em pilhas do ES e elevado-throughput ES celulares consórcios de geração como KOMP, melhoraram a geração/disponibilidade de células ES geneticamente modificadas. No entanto, a geração de quimeras germline continua a ser um gargalo na criação de ratos geneticamente modificados destas células de ES3,4. Projetos de geração de célula do elevado-throughput ES tem sido atormentados por alta variabilidade na qualidade de célula ES, que é fundamental para a criação bem sucedida do germline quimeras. Além disso, algumas das linhas celulares ES comumente utilizadas são conhecidas por aneuploidia alta e difícil produção do germline quimeras competente5.
Muitos métodos têm sido desenvolvidos para a criação de ratos com uma quimera ou superior, ou completamente ES células derivadas ratos6,7,8,9,10. Enquanto cada um desses sistemas tem seus próprios méritos, eles também têm suas falhas. A geração de quimeras tetraploide, enquanto gerar células de ES 100% derivado de ratos, é ineficiente e geralmente limitado a linhas outbred 5,6. Novos métodos de injeção de mórula podem gerar alta porcentagem de quimeras, quase 100%, mas geralmente requerem equipamento adicional significativo (lasers ou piezos) e formação de10,11. Nos laboratórios onde estas técnicas já estão em vigor, esta nova metodologia pode não ser necessária.
O objetivo do presente estudo foi encontrar um método que usa técnicas comuns e equipamentos disponíveis para aumentar a taxa de geração de Quimera, aumentando a chance de transmissão do germline do alelo mutante para estabelecer a colônia de rato subsequentes.
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Protocolo
Todas as operações foram feitas como parte da operação normal da instalação NIEHS Knock Out Mouse Core. Todos os ratos foram mantidos em um 12:12 ciclo h luz: escuro e foram alimentar uma dieta de NIH-31 e água ad libitum. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com o Comité de utilização do nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental e cuidado Animal.
1. preparação animal
- Raça de ratos do doador, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J ratos fêmeas em 8-10 semanas de idade naturalmente a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J camundongos machos entre 8 e 26 semanas de idade. Verificar visualmente se conecta na manhã seguinte (E0.5).
- Raça de ratos destinatários, Swiss Webster ratos fêmeas entre 6 e 9 semanas de idade são naturalmente criados para camundongos machos de Swiss Webster vasectomizados. Verificar visualmente se conecta na manhã seguinte (E0.5).
2. preparação da pilha ES
- Para as células de AB2.2 ES 129-derieved, cultura de células em DMEM suplementado com 15% FBS, 1% glutamina, 1% Penn/estreptococos e 0,1% β-Mercaptoetanol. Cultura de todas as outras células ES segundo as instruções do fornecedor de celular ES, usando seus protocolos recomendados.
3. embrião coleção
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Dissecação de animais
- Preparar vários pratos de 60 mm, aproximadamente 1 por 5 ratos mais 3 extra, com mídia de coleção de explosão de 10 mL (BCM) (10% FBS em DMEM), e um 4 bom prato com 0,5 mL BCM por bem. Equilibrar a 37 ° C, 5% de CO2.
- Eutanásia em B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J camundongos fêmeas no E3.5 usando asfixia de CO2 , com um caudal de 10%.
- Após a eutanásia, coloque os ratos na posição supina e molhar o abdômen completamente com etanol a 70%.
- Façam a primeira incisão através da pele somente, no ponto médio do abdômen, fazendo a abertura tão ampla quanto possível. Em seguida abra através da parede abdominal, fazendo a incisão tão ampla quanto possível.
Nota: A fazer isto em dois passos ajuda a reduzir ou eliminar a contaminação da pele. - Começando com um ovário e segurando do tecido do ovário com fórceps rombudo, remover cuidadosamente o ovário, oviduto e útero, tomar cuidado extra para manter o tecido adiposo a um mínimo. Remova o útero como uma única unidade, ou como chifres individuais, com nenhuma mudança no procedimento a seguir.
- Após a remoção, coloque o útero em um prato de 60 mm que contém a mídia de coleção de explosão.
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Remoção do embrião
- Preparar uma seringa de 10ml cheia de BCM e se encaixam com uma agulha de 25 G.
- Um útero de cada vez, removê-los do prato de exploração do BCM, exterminá-los em um lenço de papel para remover o excesso de sangue e coloque em um prato de 60 mm em um pequeno aumento, microscópio de dissecção.
- Mantendo cuidadosamente e suavemente o útero, logo abaixo da extremidade distal (perto do oviduto) com pinça de dissecação, introduza a agulha para o centro do útero em como paralelo um avião quanto possível. Insira a agulha passando as pontas da pinça.
- Aplicar alguma pressão a pinça para segurar o útero para a agulha e expulsar aproximadamente 1 mL de BCM através do corno do útero.
Nota: Tenha cuidado neste passo, como muita pressão na seringa causará um fluxo incontrolável de mídia, muitas vezes deixando o prato. - Após a lavagem do útero, útero todo até 5 por prato de 60 mm, coloque o prato de volta na incubadora até coleção.
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Colheita de embriões
- Usando uma pipeta de vidro estirado de mão e um aparelho de pipeta de boca, recolha blastocistos sob um escopo de dissecação, situado entre 25 X e 35 X. (Figura 1).
Nota: Aparelho de pipeta boca consiste em 30-40 cm de tubo flexível, abaixo dos 5 mm identificação inserir um 1, 000 ponta da pipeta µ l, aponte primeiro em para uma extremidade e apor a pipeta de vidro nele. Adicione um filtro de seringa para a outra extremidade, com um anexo 1 cc seringa barril, sem atuador, para atuar como um pedaço da boca. - Retirar pratos da incubadora e usando um padrão de grade, examinam cada parte do prato para embriões. Os embriões são escolhidos acima individualmente e coloque sobre a gota de BCM em um prato secundário.
- Após a coleta de todos os pratos, lavar os embriões mais uma vez em uma gota de BCM fresco e coloque no prato bem 4 para aguardar a injeção.
- Usando uma pipeta de vidro estirado de mão e um aparelho de pipeta de boca, recolha blastocistos sob um escopo de dissecação, situado entre 25 X e 35 X. (Figura 1).
4. o embrião injeção
- Pegar as células ES individualmente com a agulha de injeção com base na confirmação.
- Preparar um prato de injeção pela adição de 5-7 mL de mídia de injeção (DMEM, 10% FBS e 20 mM HEPES) para um prato de injeção de fundo de vidro. As injeções são feitas à temperatura ambiente.
- Usando microinjector um ar ou óleo, aplica vácuo para a agulha de injeção para desenhar células ES no. Tome cuidado para manter-se como pouco espaço quanto possível entre as células. Conte as células ES aqui, ou na etapa de injeção.
- Selecione as células ES que são de médio a pequeno no tamanho em comparação com a população em geral de células, com uma superfície lisa e sem defeitos óbvios, tais como vacúolos.
Nota: As populações de células ES variam grandemente em qualidade morfológica, e os padrões usados precisará ajustar com eles.
- Injete embriões com aproximadamente 15 células ES (Figura 1).
- Anexar uma pipeta de exploração dica para uma segunda microinjector de ar e posicionar um embrião perto da abertura do titular. Aplica vácuo para fixar o embrião para o titular.
- Ajuste para o eixo z movendo a pipeta de exploração cima ou para baixo para que o embrião é apenas tocar o slide, seguido por bem, focando a zona. Em seguida, ajuste o eixo Z da agulha de injeção para que as células ES perto da ponta estão em foco.
- Ajuste o embrião agora empurrando suavemente desde a agulha de injeção na parte superior ou inferior, girando-o para colocar o ICM na posição desejada.
- Insira a agulha de injeção através da zona e o ICM ou o trofoblasto, usando uma pressão firme, mas controlada. Exercendo uma ligeira pressão para o microinjector da agulha de injeção para ajudar a manter o blastocoel de entrar em colapso.
- Uma vez que a agulha penetrou o blastocoel, aplica pressão do microinjector para transferir células ES para o blastocoel do embrião. Pausar brevemente como o bisel da agulha começa a sair o embrião para permitir que a pressão no embrião para voltar ao normal, mantendo ainda as células.
Nota: Referência a células ES grupo foram injetada normalmente, seguindo um tradicional ES celular injeção protocolo9, tomando cuidado para não tocar o ICM. Pilhas do ES também foram injetadas através do ICM, empurrando a agulha diretamente através do ICM (TICM) (Figura 2filme suplementar).
5. transferência de eEmbryos
- Transferência de embriões de camundongos Swiss Webster em E2.5, usando um dispositivo de transferência de embriões não-cirúrgico, por procedimentos de fabricação. Este procedimento não-cirúrgico requer sem anestesia ou cuidado especial no pós-operatório. Ratos de casa individualmente após a transferência de embriões e pela entrega e desmame subsequentes.
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Resultados
Tratamento de linha celular como o efeito aleatório, um modelo linear de efeitos mistos foi usado para analisar os dados no software (por exemplo, SAS (versão 9.2)). Cada análise controlada para o número de embriões transferidos e a linha celular. A segunda análise também controlada para o número de filhotes que sobreviveram.
Para este estudo, cada linha celular do ES e o clone foi injetado em ambos com tradicionais e técnicas T...
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Discussão
Isso tem sido pensado que qualquer perturbação do ICM pode levar à mortalidade, na verdade, protocolos atuais de microinjeção de blastocisto ainda alertam para este12,13. O que mostramos aqui é que microinjeção através do ICM não é prejudicial para o embrião e aumenta o rendimento de quimeras.
O mecanismo exato para este efeito não foi identificado. No entanto, a ruptura mecânica do ICM, e o hipoblasto que acompanha, deve aumentar a in...
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Divulgações
Os autores têm sem interesses concorrentes para divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada [em parte] pelo programa de pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional de Ciências de saúde ambiental. Agradecimento especial a Shyamal Peddada para análise estatística. Gostaríamos também de agradecer Humphrey Yao, Gary Bird e Yuki Arao para revisão deste manuscrito, e Franco DeMayo por seu contínuo apoio e conselhos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulha de injeção de células ES | Humagen | MSC-20-0 | |
| Dispositivo NSET | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (tecnologias de vida) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (tecnologias de vida) | 10439-024 | os lotes devem ser testados individualmente quanto à compatibilidade de células ES. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulador | Leica | Micro manipulador | |
| micro injetor | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscópio | Leica | DM IRB | |
| 4 prato de poço | Thermo Scientific | 176740 | |
| Prato de 60 mm | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, EUA | 000058 | |
| Camundongos Swiss Webster | Taconic, EUA | Tac:SW | |
| Prato de Injeção | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
Referências
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Reimpressões e permissões
