Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem

Resumo

Imagem tecido retinal pode fornecer informações de célula única que não podem ser obtidas por métodos bioquímicos tradicionais. Este protocolo descreve a preparação de fatias da retina de zebrafish para a imagem latente confocal. Indicador de corantes permitem a visualização de numerosos processos biológicos em tipos distintos de células da retina ou fluorescente geneticamente codificado sensores.

Resumo

A retina é um tecido complexo que inicia e integra os primeiros passos da visão. Disfunção das células da retina é uma marca registrada de muitas doenças ofuscante, e terapias futuras dependem de entendimentos fundamentais sobre como diferentes da retina células funcionam normalmente. Ganhar essa informação com métodos bioquímicos provou difícil porque as contribuições dos tipos de célula específica são diminuídas no meio de células da retina. Imagem da retina ao vivo pode fornecer uma visão dos numerosos processos biológicos em nível subcelular, graças a um número crescente de biosensores fluorescentes geneticamente codificados. No entanto, esta técnica tem sido limitada a girinos e larvas de peixe-zebra, as camadas da retina ultraperiféricas da retina isolada, ou imagens de resolução mais baixa da retina em animais vivos. Aqui nós apresentamos um método para gerar ao vivo ex vivo da retina fatias de adultos do zebrafish para geração de imagens ao vivo através de microscopia confocal. Esta preparação rende fatias transversais com todas as camadas da retina e a maioria dos tipos de células visíveis para a realização de experimentos de imagiologia confocal usando a perfusão. Zebrafish transgênicos expressando proteínas fluorescentes ou biossensores em tipos específicos de células da retina ou organelas são usados para extrair informação de célula única de uma retina intacta. Além disso, as fatias da retina podem ser carregadas com corantes fluorescentes indicador, adicionando à versatilidade do método. Este protocolo foi desenvolvido para imagem Ca^{2 +} dentro do zebrafish cones fotorreceptores, mas com marcadores adequadas poderia ser adaptado para medir Ca^{2 +} ou metabolitos em células Müller, células bipolares e horizontais, micróglia, células de amacrine ou da retina células ganglionares. O epithelium retinal do pigment é removido do fatias assim que este método não é adequado para estudar esse tipo de célula. Com prática, é possível gerar seriais fatias de um animal para múltiplas experiências. Esta técnica adaptável fornece uma ferramenta poderosa para responder às muitas perguntas sobre biologia celular da retina, Ca^{2 +}e homeostase de energia.

Introdução

O peixe-zebra (Danio rerio) tem-se amplamente utilizado em pesquisa científica básica e médica¹, devido ao seu tamanho pequeno, rápido desenvolvimento e sistemas de órgãos de vertebrados. A transparência natural das larvas de zebrafish combinada com métodos estabelecidos por transgênese permitiram a visualização detalhada dos processos celulares em um animal vivo. Um número de biosensores fluorescentes geneticamente codificados têm sido alvo de células específicas do zebrafish para detectar Ca^{2 + 2}, peróxido de hidrogênio³, apoptotic ativação⁴ e ATP

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Washington institucional Animal cuidados e Comissão de utilização.

1. preparar o equipamento e animais

Nota: O epithelium retinal do pigment (RPE) é uma folha escura de tecido circundante fora da retina cuja pigmentação pode obscurecer as características da retina e danificar o tecido quando confocal de imagem ex vivo. Na escuridão, o RPE de zebrafish está retraída longe da retina; escuridão se adaptar peixe para facilitar a futura remoção do RPE da retina antes de fatiar e a imagem latente.

1. Transferir peixes de um tanque de....

Resultados

Posicionamento estável e orientação transversal de fatias são chave para o sucesso de imagem com injeção ou perfusão de agentes farmacológicos. Cuidadosamente examine e reposicionar fatias antes da imagem latente confocal conforme necessário para garantir que todas as camadas da retina são visíveis (Figura 2A, fatia ii). Se uma fatia é girada ligeiramente para a frente (Fig. 2A, fatia iii), feixes de segmentos exteriores será vis.......

Discussão

Ex vivo por imagens do zebrafish frescos fatias da retina tem provado para ser uma ferramenta versátil para estudar fotorreceptoras biologia^20,21,22e é o única que permite a análise de células individuais em um maduro, totalmente diferenciada de retina. Com prática, é possível realizar várias experiências com tecido de um único peixe, mesmo usando seriais fatias da mesma região da retina. Além dos desafios e sugestões r.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
peixe-zebra	Universidade de Washington South Lake Union Aquatics Facility		estoques mantidos internamente como linhas transgênicas estáveis
vaselina	Fisher Scientific	19-090-843	para seringa de vaselina
Seringa de ponta deslizante de 3 mL	Fisher Scientific	14-823-436	para seringa de vaselina
20g Agulha de ponta deslizante de 3,8 cm	Fisher Scientific	14-826-5B	para vaselina seringa
simples 7 cm X 2,5 cm lâmina de microscópio	Fisher Scientific	12-550-A3	para dissecção ocular, câmara de fatiamento
Seche Vite esmalte transparente	Amazon	B00150LT40	para câmara de fatiamento
18 mm X 18 mm #1 lamínulas de vidro	Fisher Scientific	12-542A	para escadas de imagem
cera dental sem sabor	Amazon	B01K8WNL5A	para escadas de imagem
lâminas de barbear de dupla borda	Stoelting	51427	para fatiamento de tecido fatiador de
tecido com micrômetro digital	Stoelting	51415	para papel de filtro de fatiamento de tecido
- celulose mista gradeada branca, 13 mm de diâmetro, 0,45 µ tamanho de poro	m EMD Millipore	HAWG01300	papel de filtro para montagem de retinas
placa de Petri de 10 cm	Fisher Scientific	FB0875712	para eutanásia de peixes, dissecação, montagem de escada de imagem
15 cm aplicador de madeira de ponta lisa Fisher	Scientific	23-400-112	para ferramenta de laço de olhal de fio
30g (0,25 mm de diâmetro) fio de tungstênio	Fisher Scientific	AA10408G6	para ferramenta de laço de olho de fio
D-glicose	Sigma Aldrich	G8270	componente de solução de estoque de
suplemento L-lactato de sódio	Sigma Aldrich	L7022	componente de solução de estoque de suplemento
piruvato de sódio	Sigma Aldrich	P2256	componente de solução de estoque de suplemento
L-glutamina	Sigma	Aldrich G3126	componente de solução de estoque de suplemento
L-glutationa, reduzido	Sigma Aldrich	G4251	componente da solução estoque do suplemento
Ácido L-ascórbico	Sigma Aldrich	A5960	componente da solução estoque do suplemento
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	componente da solução de Ringer
KCl	Sigma Aldrich	P9333	componente da solução
de RingerCaCl2 · 2H2O	Sigma Aldrich	C3881	componente da solução de Ringer
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S8282	componente da solução de Ringer
MgCl2 · 6H2O	Sigma	Aldrich M0250	componente da solução de Ringer
HEPES	Sigma Componente Aldrich	H3375	da solução de Ringer
Base Tris Fisher	Scientific	BP152	componente de solução de Ringer livre de Na+
6 N HCl	Fisher Scientific	02-003-063	componente de solução de Ringer livre de Na+-free
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5655	componente de solução de Ringer livre de Na+ solução de Ringer
Tubo de centrífuga cônico de 50 mL	Recipiente Denville Scientific	C1062-P	para solução de Ringer
Tesoura Vannas - lâminas angulares de 5 mm	World Precision Instruments	501790	micro-tesoura para dissecção da ocular
Pinças suíças - #5, 11 cm, retas, pontas de 0,06 X 0,07 mm	World Precision Instruments	504510	pinça fina para dissecção da ocular e manipulação de fatias
lâminas de barbear de borda única	Fisher Scientific	12-640	para dissecção da ocular e aparar papel de filtro
EMD Pinça de filtro Millipore	XX6200006P	Fisher Scientific	para manuseio de papel de filtro úmido
C12 558/568 BODIPY	Fisher Scientific	D3835	cora núcleos de células vivas; incubar 5 e micro; g/mL por 15 min à temperatura ambiente
iodeto de propídio (PI)	Fisher Scientific	P3566	cora núcleos de células mortas; incubar 5 µ g/mL por 20 min em temperatura ambiente
Hoechst 33342	Fisher Scientific	62249	cora núcleos de células vivas; incubar 5 µ g/mL por 20 min à temperatura ambiente
Tetrametilrodamina, éster metílico (TMRM)	Fisher Scientific	T668	cora mitocôndrias funcionais, carregadas negativamente; incubar 1 nM por 30 min em câmara
perfusão tecidual	[-SY]Cell MicroControls BT-1-18/BT-1-18BV para	injeção ou perfusão
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)Amino)-2-Desoxiglicose (NBDG)	Fisher Scientific	N13195	fluorescente glicose análogo administrado oralmente ao peixe-zebra 30 min antes da eutanásia
Microscópio confocal de varredura a laser Olympus	Olympus	FV1000	para visualização de fluorescência de fatias com resolução de célula única
Cianeto de carbonila 3-clorofenilhidrazona (CCCP)	Sigma Aldrich	C2759	reagente experimental que elimina a respiração mitocondrial; trate as fatias até uma concentração final de 1 µ
M posicionador de aspirador miniatura	Cell MicroControls	FL-1	para coletor de perfusão
perfusão, coletor de borbulhador de gás, válvula de fluxo, suporte de seringa de 60cc	Warner Instruments	vários	para perfusão

Pinça plana de à temperatura ambiente Câmara de imagem Microscópio confocal de