Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

Resumo

Neste protocolo, baculovirus é produzido pelo transfection transiente de baculovirus plasmídeo em células Sf9 e amplificado em uma cultura de suspensão livre de soro. O sobrenadante é purificado por cromatografia de afinidade de heparina e mais concentrado por ultracentrifugação. Este protocolo é útil para a produção e purificação de baculovirus para aplicação de terapia de gene.

Resumo

Baculovirus tem sido tradicionalmente usada para a produção de proteínas recombinantes e vacina. No entanto, mais recentemente, baculovirus está emergindo como um vetor promissor para aplicação de terapia de gene. Aqui, baculovirus é produzido por transfecção transiente o baculovirus do ADN do plasmídeo (bacmid) numa cultura de Sf9 células aderente. Baculovirus posteriormente é expandido em Sf9 células em uma cultura livre de soro suspensão até obter o volume desejado. Em seguida é purificado da cultura sobrenadante usando cromatografia de afinidade de heparina. Sobrenadante de vírus é carregado na coluna de heparina, que se liga a partículas de baculovirus no sobrenadante devido a afinidade de heparina para baculovirus envelop glicoproteína. A coluna é lavada com um buffer para remover contaminantes e baculovirus é eluída da coluna com um buffer de elevado-sal. O eluato é diluído a uma concentração de sal isotônica e baculovirus partículas estão mais concentradas usando ultracentrifugação. Usando esse método, baculovirus pode ser concentrado até 500-fold com uma recuperação de 25% de partículas infecciosas. Embora o protocolo descrito aqui demonstra a produção e purificação do baculovirus de culturas até 1 L, o método pode ser dimensionado-se em uma cultura fechada-sistema de suspensão para produzir um vetor de grau clínico para aplicação de terapia de gene.

Introdução

Baculoviridae é usado principalmente para a produção de proteínas recombinantes e vacinas em lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9 células de insetos usando recombinante Autographa californica vírus de poliedrose nuclear multicapsid (AcMNPV) ^{1 , 2 , 3 , 4}. mais recentemente, está emergindo como um vetor promissor para gene terapia aplicação⁵. Ele é conhecido por ter um amplo acolhimento e tecido tropismo, infecta células quiescentes e proliferação, é não-patogênicas e não integrar o anfitrião crom....

Protocolo

Veja a Figura 1 para uma ilustração resumindo o protocolo.

1. purificação de Baculovirus plasmídeo

1. Crescer a cultura bacteriana contendo baculoviral Plasmideo DNA (bacmid)¹⁴ em 200 mL de caldo LB com antibióticos; canamicina (50 µ g/mL), tetraciclina (10 µ g/mL) e gentamicina (7 µ g/mL), para 16 h a 37 ° C, em um cenário de agitador orbital a 300 rpm.
2. Purificar o bacmid DNA da cultura bacteriana usando lise alcalina padrão protocolo¹⁵e dissolver o bacmid em tampão TE.

2. produção de Baculovirus

1. Célula....

Resultados

O protocolo apresentado é em um diagrama de fluxo (Figura 1). As etapas incluem o transfection transiente de Sf9 células com bacmid DNA para produzir baculovirus em cultura aderente em uma placa, a subsequente amplificação em cultura de suspensão isento de soro, tratamento de nuclease e clarificação por centrifugação e filtração, e a purificação usando a cromatografia de afinidade de heparina seguido de concentração com ultracentrifugação.

Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve a produção de baculovirus no Sf9 células em cultura de suspensão e purificação de baculovirus usando uma cromatografia de afinidade de heparina. Os parâmetros usados neste protocolo maximizar o rendimento e minimizar a inactivação de baculovirus infecciosas. O protocolo fornecido aqui mostra que uma recuperação significativamente melhorada de baculovirus partículas em comparação com as recuperações alcançado por outros⁹.

Devido ao t.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
de	cromatografia	28976337 de saúde Akta Avant 150	GE
POROS Heparina 50 µ m Coluna	ThermoFisher Scientific	4333414	Coluna de heparina
Ultracentrífuga	Beckman-Coulter	Item não catalogado	Concentra vírus em alta velocidade
Polyallomer Tubo de ultracentrífuga	Beckman-Coulter	326823	Concentra vírus em alta velocidade
Incubadora de agitador orbital MaxQ 8000	ThermoFisher Scientific	Item não catalogado	Agitador para cultura em suspensão
250 mL Frascos Erlenmeyer	ThermoFisher Scientific	238071	Frasco para cultura em suspensão
L Frascos Erlenmeyer	ThermoFisher Scientific	238072	Frasco para cultura em suspensão
Microscópio (Olympus CKX41)	Olympus	Item não catalogado	Monitoramento e contagem de células
Centrífuga de mesa	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	Para esclarecimento do sobrenadante de Baculovirus
50 ml Tubo cônico	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	Para coleta de sobrenadante de Baculovirus
Placa de 6 poços	ThermoFisher Scientific	07-200-80	Placa tratada para cultura de tecidos
Placa de 10 cm	ThermoFisher Scientific	08-772E	Placa tratada para cultura de tecidos
Stericup-HV, 0.45  µ m, PVDF	EMD-Millipore	SCHVU05RE	Unidade de filtração
Canamicina	ThermoFisher Scientific	15160-054
Tetraciclina	Sigma-Aldrich	T7660
Gentamicina	ThermoFisher Scientific	15750-060
Kit de vetores Bac-to-Bac	ThermoFisher Scientific	10360-014	Sistema de expressão de baculovírus
DH10B-T1R  Célula competente	ThermoFisher Scientific	12331-013	Célula competente para
tampão	Item interno	não catalogado	10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0.
Kit Plasmid Maxiprep	ThermoFisher Scientific	K2100-06	Para purificação de bacmid
Células Sf9	ThermoFisher Scientific	11496-015	Células de insetos
Grace' s Meio de cultura de células de insetos	ThermoFisher Scientific	11605-094	Meio de transfecção
PBS	ThermoFisher Scientific	20012227	Lavagem de células, diluindo amostras
HyClone SFX-Meio de células de insetos	GE Healthcare	SH30278.02	Meio de crescimento de células de insetos sem soro
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	Enzima para degradar DNA e RNA
DNA de plasmídeo de baculovírus (bacmid)	Item interno	não catalogado	Bacmid para produção de baculovírus
Cellfectin II	ThermoFisher Scientific	10362	Reagente de transfecção para células de insetos
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A4737	estabiliza o baculovírus
Cryovial	Thomas Scientific	1222C24	Para armazenamento de baculovírus
Linha celular HT1080	Linha celular de fibroblastos ATCC	CCL-121
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Crescimento tampão de
lavagem		Tampão interno Não catalogado 20	mmol/l tampão fosfato contendo 150 mmol/l cloreto
de sódio Tampão de eluição	Interno	Item não catalogado	20 mmol/l tampão fosfato contendo 1,5 mol/l cloreto de sódio
Tampão de limpeza de coluna		interno não catalogado	Tampão fosfato 20 mmol/l contendo 2,0 mol/l cloreto
de sódioÁgua estéril	Item não catalogado		interno Para limpeza Akta Avant
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	1.09137	Para limpeza Akta Avant
Etanol	Sigma-Aldrich	E7073	Para limpeza Akta Avant

Sistema 1 bacmid TE Item