Artigo de método

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

15.5K vistas

⸱

DOI:

10.3791/57019

⸱

9 de abril de 2018

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

Neste artigo

Resumo

Neste protocolo, baculovirus é produzido pelo transfection transiente de baculovirus plasmídeo em células Sf9 e amplificado em uma cultura de suspensão livre de soro. O sobrenadante é purificado por cromatografia de afinidade de heparina e mais concentrado por ultracentrifugação. Este protocolo é útil para a produção e purificação de baculovirus para aplicação de terapia de gene.

Resumo

Baculovirus tem sido tradicionalmente usada para a produção de proteínas recombinantes e vacina. No entanto, mais recentemente, baculovirus está emergindo como um vetor promissor para aplicação de terapia de gene. Aqui, baculovirus é produzido por transfecção transiente o baculovirus do ADN do plasmídeo (bacmid) numa cultura de Sf9 células aderente. Baculovirus posteriormente é expandido em Sf9 células em uma cultura livre de soro suspensão até obter o volume desejado. Em seguida é purificado da cultura sobrenadante usando cromatografia de afinidade de heparina. Sobrenadante de vírus é carregado na coluna de heparina, que se liga a partículas de baculovirus no sobrenadante devido a afinidade de heparina para baculovirus envelop glicoproteína. A coluna é lavada com um buffer para remover contaminantes e baculovirus é eluída da coluna com um buffer de elevado-sal. O eluato é diluído a uma concentração de sal isotônica e baculovirus partículas estão mais concentradas usando ultracentrifugação. Usando esse método, baculovirus pode ser concentrado até 500-fold com uma recuperação de 25% de partículas infecciosas. Embora o protocolo descrito aqui demonstra a produção e purificação do baculovirus de culturas até 1 L, o método pode ser dimensionado-se em uma cultura fechada-sistema de suspensão para produzir um vetor de grau clínico para aplicação de terapia de gene.

Introdução

Baculoviridae é usado principalmente para a produção de proteínas recombinantes e vacinas em lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9 células de insetos usando recombinante Autographa californica vírus de poliedrose nuclear multicapsid (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. mais recentemente, está emergindo como um vetor promissor para gene terapia aplicação5. Ele é conhecido por ter um amplo acolhimento e tecido tropismo, infecta células quiescentes e proliferação, é não-patogênicas e não integrar o anfitrião cromossoma4,5,6. Além disso, baculovirus pode ser produzida em cultura de suspensão isento de soro que é escalável e permite o sistema fechado de processamento para produção futura Clínica1.

A pureza de baculovirus partículas é importante para a realização eficaz transdução minimizando a citotoxicidade7,8,9. Baculovirus pode ser concentrados por ultracentrifugação ou filtragem de fluxo tangencial (TFF) com impacto limitado na sua infecciosidade. No entanto, estes procedimentos não só concentrar partículas de vírus mas também restos celulares e proteínas de Sf9 cultura, que pode ser tóxico em vitro (observação pessoal) e podem induzir a inflamação ou uma resposta imune quando usado na vivo. Para evitar isso, especialmente quando usando altamente concentradas ações de vírus, baculovirus infecciosas precisa ser purificado e separado da contaminação de partículas.

Vários métodos têm sido relatados para a purificação e concentração de baculovirus vetores10,11,12. As abordagens disponíveis, cromatografia de afinidade de heparina permite um nível elevado de etapa única de purificação com a baixa concentração de proteínas12a contaminar. O método baseia-se na identificação do sulfato de heparan como receptor para baculovirus13,14. Depois de carregar Sf9 sobrenadante de célula na coluna e vinculação de baculovirus, a coluna pode ser lavada com buffer (isotônico) fisiológico para remover as partículas contaminantes frouxamente acopladas ou não acopladas. Desde que a ligação a heparina é reversível, baculovirus partículas podem ser eluídas com um buffer de sal elevado, o que dilui-se imediatamente a concentração de sal (isotônica) fisiológica para evitar inativação por choque osmótica12. Além disso, a produção de baculovirus, bem como captura na e eluição da coluna de cromatografia, pode ser realizada usando um processo do sistema fechado que é compatível com o atual boas práticas de fabricação (cGMP).

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a manufatura, purificação e concentração de baculovirus infecciosas usando centrifugação e cromatografia de afinidade. Brevemente, produzimos baculovirus por transfecção de células Sf9 com um plasmídeo baculovirus em cultura aderente e expandir ainda mais o baculovirus infecciosas na cultura de suspensão livre de soro. Podemos purificar baculovirus usando cromatografia de afinidade de heparina e usar ultracentrifugação como etapa final para altamente concentrado do vetor para a aplicação de terapia de gene.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Veja a Figura 1 para uma ilustração resumindo o protocolo.

1. purificação de Baculovirus plasmídeo

  1. Crescer a cultura bacteriana contendo baculoviral Plasmideo DNA (bacmid)14 em 200 mL de caldo LB com antibióticos; canamicina (50 µ g/mL), tetraciclina (10 µ g/mL) e gentamicina (7 µ g/mL), para 16 h a 37 ° C, em um cenário de agitador orbital a 300 rpm.
  2. Purificar o bacmid DNA da cultura bacteriana usando lise alcalina padrão protocolo15e dissolver o bacmid em tampão TE.

2. produção de Baculovirus

  1. Células de cultura Sf9 em uma incubadora de agitador orbital a 135 rpm e 28 ° C, em um frasco de Erlenmeyer contendo meio de cultura livre de soro inseto1,2,3de policarbonato.
    Nota: Se Sf9 células são descongeladas de estoque congelado, deixe pelo menos duas semanas para as células para recuperar e digite a fase exponencial de crescimento.
  2. Conte as células de Sf9 colhidas na fase exponencial de crescimento com um hemocytometer após coloração com azul de Tripan. 1 x 106 células viáveis Sf9 por alvéolo em uma placa de cultura de tecidos tratados 6-poços em 2 mL do meio da semente. Permitir que a célula anexar por 1h a 28 ° C em uma incubadora.
  3. Substitua o meio de crescimento com 1 mL de meio de cultura de livre de soro unsupplemented Grace inseto.
  4. Transfect o bacmid de DNA nas células Sf9 usando o reagente de Transfeccao de células de inseto.
    1. Mix 8 µ l célula inseto reagente de transfeccao com 100 µ l de meio de inseto da Grace.
    2. Diluir 2 µ g de bacmid DNA em 100 µ l de meio unsupplemented de insetos e misture suavemente pela utilização do vortex.
    3. Combinar o DNA diluído com o reagente de Transfeccao de célula inseto diluídos e misture delicadamente. Incube durante 15 a 30 min à temperatura ambiente.
    4. Adicione a mistura de DNA-lipídico gota a gota sobre as células. Incube a 28 ° C em uma incubadora para aproximadamente 5h.
  5. Retire a mistura de transfecção de células e lavar as células com 2 mL de PBS.
  6. Adicionar 2 mL de meio de cultura de inseto e continuar a cultura a 28 ° C em uma incubadora, sem alterar a mídia.
    Nota: Se o bacmid contém uma proteína fluorescente, sua expressão pode ser detectado em transfeccao pós de células 48 h. Baculoviridae é produzido por células transfectadas de Sf9 e secretada para o meio de cultura que posteriormente infecta as células untransfected. A população de toda a célula torna-se infectado com baculovirus em 5 dias e mostra sinais de infecção viral, também chamado de efeito citopático. Estes incluem o diâmetro maior célula, vacúolos/grânulos no citoplasma, cessação do crescimento celular e células mortas ou lisadas estão presentes na cultura de pilha. No entanto, se a eficiência da transfecção ou infecção não é o ideal, a cultura não pode apresentar um efeito citopático óbvio. O efeito citopático pode ser visualizado com um microscópio de fase invertido na ampliação de X 200-400. Célula de Baculovirus infectado pode ser detectada pela coloração com de anticorpo anti-gp6411.
  7. Colheita de baculovirus sobrenadante 5 dias depois transfection e rótulo como o estoque de vírus1 P.
  8. Armazene o baculovirus sobrenadante, que é sensível à luz, no escuro, com 0,5% albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Armazenar a 4 ° C para o curto prazo (até 90 dias) ou a-80 ° C para o longo prazo.
  9. Semente 6 × 106 Sf9 células em uma placa de cultura de tecidos tratados 10 cm em 10 mL de meio de cultura de insetos. Adicione 1 mL do sobrenadante inicial baculovirus (P1) para as células.
  10. Colheita de baculovirus sobrenadante (P2) em 5 pós-infecção dia deth .
  11. 50 mL de Sf9 células (3 x 106 células/mL) na cultura de suspensão em meio de cultura inseto em um policarbonato 250 mL frasco Erlenmeyer e coloque o frasco em uma incubadora de agitador orbital de semente. Adicionar 2 mL de caldo de2 P para as células e agitar a 135 rpm, mantendo uma temperatura constante de 28 ° C.
    Nota: Três ou quatro dias após a infecção, toda a população de células Sf9 mostrará o efeito citopático, que é uma indicação de baculovirus sendo o título de alta produção.
  12. Sequencialmente, amplificar os sobrenadantes de baculovirus até o volume desejado é obtido (P.3, P4,...), aumentando 10 a 50-fold volume de cultura de células em cada infecção subsequente.
    Nota: P3 é o 3rd redondo de infecção em qual 500 mL para 1 L de Sf9 cultura celular pode estar infectada com 10 a 20 mL de P2 baculovirus sobrenadante; P4 é 4th redondo de infecção em que 5 a 10 L de Sf9 cultura celular pode estar infectada com 100 a 200 mL do sobrenadante de baculovirus P3 e assim por diante. Normalmente, as células Sf9 são semeadas em 3 × 106 células/mL em meios de cultura livre de soro inseto.
  13. Centrifugue o baculovirus sobrenadante a 1.000 x g durante 30 min a 4 ° C para remover restos celulares e tratar o baculovirus sobrenadante com nuclease de 50 unidades/mL (250 unidades / µ l de estoque) por 2 h a 37 ° C para digerir o genoma de DNA e RNA. Filtre os sobrenadantes através de uma unidade de filtração 0,45 μm.

3. preparação do sistema de cromatografia

  1. Preparar o sistema de cromatografia enxaguando sequencialmente as amostra e buffer de linhas cada com água estéril, 1 N de hidróxido de sódio, água e lavar o tampão (20 mM de fosfato de sódio tampão contendo 150 mM de cloreto de sódio, pH 7.0) a uma taxa de fluxo linear de 50 mL/min.
  2. Preparar uma coluna µm de heparina 50 (10 × 10 cm, 7,9 mL de volume de coluna (CV)) executando sequencialmente coluna limpeza Reserva (5 CV estéril 20 mM de fosfato de sódio tampão contendo 2 M de cloreto de sódio, pH 7.0) e o tampão de lavagem 5 CV em uma taxa de fluxo linear de 7 mL/min.

4. purificação de Baculovirus Vector

  1. Configure o sistema de cromatografia da seguinte forma:
    1. Use o exemplo de porta de entrada para carregar o baculovirus sobrenadante de carregamento.
    2. Use a porta de entrada do tampão A1 para carregar o tampão de lavagem. Prepare uma garrafa pelo menos 500 mL de tampão de lavagem e coloque a linha de tampão de lavagem no frasco.
    3. Use a porta de entrada do tampão A2 para carregar o buffer de eluição (20 mM de fosfato de sódio com 1,5 M de cloreto de sódio, pH 8.0). Prepare uma garrafa pelo menos 500 mL de tampão de eluição e coloque a linha do tampão de eluição para a garrafa.
    4. Inserir diversos tubos de 50ml cónico o coletor de fração para coletar a coluna passagem baculovirus sobrenadante, o tampão de lavagem e o baculovirus eluted.
  2. Equilibrar a coluna de heparina com cinco volumes de coluna de 7,9 mL (CVs) de tampão de lavagem (40 mL) em uma taxa de fluxo linear de 7,0 mL/min.
  3. Carrega 250 mL do sobrenadante para a coluna de heparina usando a bomba de amostra (porta de amostra de entrada) do sistema de cromatografia em uma taxa de fluxo linear de 2,0 mL/min de baculovirus.
  4. Executar 10 CVs (80 mL) de tampão de lavagem através da coluna de heparina em uma taxa de fluxo linear de 2,0 mL/min até a curva de absorção ultravioleta (UV) (280 nm) retornou à linha de base e torna-se estável.
  5. Eluir as baculovirus partículas da coluna 7,9 mL de heparina com 5 CVs (40 mL) de tampão de eluição, a uma taxa de fluxo linear de 4,0 mL/min. relógio para um pico de eluição afiada de proteína no cromatograma, quando as partículas de baculovirus dissociam a coluna de heparina.
  6. Pós-eluição, imediatamente, diluir o sobrenadante de baculovirus eluted usando 10-fold 20 mM de tampão de fosfato de sódio em água para evitar a inativação de partículas de baculovirus de choque osmótica durante a subsequente centrifugação.
  7. Loja de 100 µ l de cada uma das frações, incluindo a coluna de passagem recolhidos durante o carregamento de baculovirus sobrenadante, o tampão de lavagem e o eluato. Infectar estas frações de baculovirus para HT1080 para avaliar o processo de purificação (ver secção 6).
  8. Limpe a coluna com coluna limpar o buffer e o tampão de lavagem. Finalmente, lavar a coluna com 5 CV estéril 20% de etanol em água a uma taxa de fluxo linear de 7,0 mL/min e armazenar a 4 ° C.
  9. Limpar o sistema de cromatografia com água, 1 N de hidróxido de sódio, novamente com água e 20% de etanol em água a uma taxa de fluxo linear de 50,0 mL/min e armazenar o sistema em 20% de etanol.

5. concentração de Baculovirus

  1. Pre-esterilize tubos de centrífuga usando uma autoclave. Adicione um volume igual de baculovirus sobrenadante para cada tubos se numa vizinhança de cultura de tecidos. Medir o peso do tubo por um equilíbrio e ajustar o peso do conteúdo dos tubos se com PBS estéril.
  2. Cada um dos tubos se coloque em oposição balde do rotor SW 32 Ti.
  3. Executar o se a 80.000 g × para 90 min a 4 ° C.
  4. Abra os tubos se numa vizinhança de cultura de tecidos e assepticamente, aspirar o líquido sem retirar a pelota de baculovirus.
  5. Resuspenda o pellet de cada tubo pipetando vigorosamente acima e para baixo com 200 µ l de PBS contendo 0,5% (w/vol) BSA.
  6. Transferir o baculovirus concentrado para cryovials (50 a 100 µ l por frasco) e armazenar a-80 ° C.

6. titulação de Baculovirus

  1. O dia antes da infecção, conte as células de HT1080 usando um hemocytometer após coloração de células com Trypan azul. Semente de 1 x 105 HT1080 células por poço em uma placa de 6 em 2 mL de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). Sementes vários poços adicionais para ser capaz de determinar o número exato de células presentes no momento da infecção. Cultura de células em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
    Nota: Células HT1080 são utilizadas para a titulação como eles expressam um maior nível de sulfato de heparan em comparação com as outras células linhas16. Uma vez que as células HT1080 são aderentes, titulação é mais simples e menos demorado em comparação com usando a titulação Sf9-baseado tradicional.
  2. No dia de infecção, determine o número de células por poço pela contagem de células de poços. Infectar as células, adicionando o baculovirus original diluída que tinha foram retiradas antes da purificação da coluna e com amostras da coluna de passagem, lavagem e frações de eluição. Para cada amostra, determine a diluição e volume empiricamente com base em partículas infecciosas baculovirus e infectar a cada poço em triplicado.
  3. Dois dias após a infecção, analise as células para a expressão do gene de interesse. As células podem ser analisadas utilizando um citômetro de fluxo se expressam uma proteína fluorescente (por exemplo, GFP)17.
  4. Calcular a concentração (unidade infecciosa por mL) baseada no número de células presentes no momento da infecção, o factor de diluição e porcentagens de proteína fluorescente nas células usando a fórmula: (número de células durante a porcentagem de infecção × de proteína fluorescente factor de diluição × células positivas) / volume de baculovirus no mL.
    Nota: Por exemplo, se o número total de células por bem no momento da infecção é 1.2 × 105, a porcentagem de proteína fluorescente é de 5%, o factor de diluição é 100 e o volume de baculovirus diluídos adicionado é de 10 µ l, o título é 6 × 107 unidades infecciosas (IU) /mL.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

O protocolo apresentado é em um diagrama de fluxo (Figura 1). As etapas incluem o transfection transiente de Sf9 células com bacmid DNA para produzir baculovirus em cultura aderente em uma placa, a subsequente amplificação em cultura de suspensão isento de soro, tratamento de nuclease e clarificação por centrifugação e filtração, e a purificação usando a cromatografia de afinidade de heparina seguido de concentração com ultracentrifugação.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve a produção de baculovirus no Sf9 células em cultura de suspensão e purificação de baculovirus usando uma cromatografia de afinidade de heparina. Os parâmetros usados neste protocolo maximizar o rendimento e minimizar a inactivação de baculovirus infecciosas. O protocolo fornecido aqui mostra que uma recuperação significativamente melhorada de baculovirus partículas em comparação com as recuperações alcançado por outros9.

Devido ao t...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado em parte financiando o start-up de Cincinnati infantil Research Foundation (CCRF) M.N. e inovador núcleo Grant (ICG) apoiado pelo centro nacional para Ciências translacionais avançando do National Institutes of Health, sob Prêmio número UL1 TR001425. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
decromatografia28976337 de saúde Akta Avant 150GE
POROS Heparina 50 µ m ColunaThermoFisher Scientific4333414Coluna de heparina
UltracentrífugaBeckman-CoulterItem não catalogadoConcentra vírus em alta velocidade
Polyallomer Tubo de ultracentrífugaBeckman-Coulter326823Concentra vírus em alta velocidade
Incubadora de agitador orbital MaxQ 8000 ThermoFisher ScientificItem não catalogadoAgitador para cultura em suspensão
250 mL Frascos ErlenmeyerThermoFisher Scientific238071Frasco para cultura em suspensão
L Frascos ErlenmeyerThermoFisher Scientific238072Frasco para cultura em suspensão
Microscópio (Olympus CKX41)OlympusItem não catalogadoMonitoramento e contagem de células 
Centrífuga de mesaThermoFisher Scientific75253839/433607Para esclarecimento do sobrenadante de Baculovirus
50 ml Tubo cônicoThermoFisher Scientific14-959-49APara coleta de sobrenadante de Baculovirus
Placa de 6 poçosThermoFisher Scientific07-200-80Placa tratada para cultura de tecidos
Placa de 10 cmThermoFisher Scientific08-772EPlaca tratada para cultura de tecidos
Stericup-HV, 0.45  µ m, PVDFEMD-MilliporeSCHVU05REUnidade de filtração
CanamicinaThermoFisher Scientific15160-054
TetraciclinaSigma-AldrichT7660
GentamicinaThermoFisher Scientific15750-060
Kit de vetores Bac-to-BacThermoFisher Scientific10360-014Sistema de expressão de baculovírus
DH10B-T1R  Célula competenteThermoFisher Scientific12331-013Célula competente para
tampãoItem internonão catalogado10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0.
Kit Plasmid MaxiprepThermoFisher ScientificK2100-06Para purificação de bacmid
Células Sf9ThermoFisher Scientific11496-015Células de insetos
Grace' s Meio de cultura de células de insetosThermoFisher Scientific11605-094Meio de transfecção
PBSThermoFisher Scientific20012227Lavagem de células, diluindo amostras
HyClone SFX-Meio de células de insetosGE HealthcareSH30278.02Meio de crescimento de células de insetos sem soro
Benzonase NucleaseSigma-AldrichE1014Enzima para degradar DNA e RNA
DNA de plasmídeo de baculovírus (bacmid)Item internonão catalogadoBacmid para produção de baculovírus
Cellfectin II ThermoFisher Scientific10362Reagente de transfecção para células de insetos
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA4737estabiliza o baculovírus
CryovialThomas Scientific1222C24Para armazenamento de baculovírus
Linha celular HT1080Linha celular de fibroblastos ATCCCCL-121
DMEMSigma-AldrichD6429Crescimento tampão de
lavagemTampão interno Não catalogado 20mmol/l tampão fosfato contendo 150 mmol/l cloreto
de sódio Tampão de eluiçãoInternoItem não catalogado20 mmol/l tampão fosfato contendo 1,5 mol/l cloreto de sódio
Tampão de limpeza de colunainterno não catalogadoTampão fosfato 20 mmol/l contendo 2,0 mol/l cloreto
de sódioÁgua estérilItem não catalogadointerno Para limpeza Akta Avant
Hidróxido de sódioSigma-Aldrich1.09137Para limpeza Akta Avant
EtanolSigma-AldrichE7073Para limpeza Akta Avant
Sistema 1 bacmid TE Item

Referências

  1. Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
  2. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  3. Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
  4. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  5. Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
  6. Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
  7. Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
  8. Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
  9. Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
  10. Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
  11. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071(2016).
  12. Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
  13. Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
  14. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  15. Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
  16. Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
  17. Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
  18. Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
  19. Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
  20. Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004(2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Produ o de Baculov rusCromatografia de Afinidade com HeparinaConcentra o por Ultracentrifuga oCultura de C lulas Sf9Purifica o de V rusVetor de Terapia G nicaPurifica o de Baculov rusCultura de C lulas de InsetoElui o de Coluna de HeparinaConcentra o de V rus

Artigos relacionados