Summary
ويرد بروتوكول لعزل microglia الأولية من العقول مورين. يساعد هذا الأسلوب في الفهم الحالي للظروف العصبية. يتم الجمع بين الكثافة المتدرجة الطرد المركزي والفصل المغناطيسي لإنتاج المحصول كافياً من عينة نقية جداً. وعلاوة على ذلك، فإننا مخطط الخطوات اللازمة لتوصيف microglia.
Abstract
Microglia، الخلايا المناعية المقيم في الدماغ، وهي أول المستجيبين لالتهاب أو إصابة في الجهاز العصبي المركزي. وقد كشفت الأبحاث الأخيرة ميكروجليا لتكون قادرة على تولي تعمل كل برو-التهابات والالتهابات، ودينامية. M1 (برو-التهابات) و M2 (برو الترميمي) تعمل تلعب دوراً مهما في الظروف نيوروينفلاماتوري مثل إصابة في الدماغ قبل الولادة، واختلاف معرض الوظائف استجابة لبعض المؤثرات البيئية. وقد لوحظ تحوير microglial التنشيط لإضفاء نيوروبروتيكتيون مما يوحي microglia قد الإمكانات العلاجية في إصابة في المخ. ومع ذلك، مطلوب إجراء مزيد من البحوث لتحسين فهم دور microglia في المرض، وهذا البروتوكول يسهل أن. البروتوكول هو موضح أدناه يجمع بين عملية الطرد المركزي تدرج كثافة الحد من الحطام الخلوية، مع فصل المغناطيسية، إنتاج عينة نقية جداً من خلايا microglial الأولية التي يمكن استخدامها لإجراء التجارب في المختبر ، دون الحاجة إلى 2-3 أسابيع استزراع. بالإضافة إلى ذلك، وصف الخطوات التي تسفر عن بيانات وظيفية قوية حول microglia، مساعدة دراسات لتحسين فهمنا للاستقطاب وفتيلة من هذه الخلايا، التي لها آثار قوية في مجال الطب التجديدي.
Introduction
الأضرار التي حصلت خلال فترة ما حول الولادة من الالتهاب، التاكسج احتباس الدم والنزيف يمكن أن يكون صفيف عقابيل على المدى الطويل. هي نظرية الفسيولوجيا المرضية المعقدة لإصابة في الدماغ قبل الولادة إلى إشراك التهاب والاسكيميه التي تلت موت الخلايا العصبية ومحواري1. الاستجابة المناعية الفطرية دوراً هاما في سلسلة الأحداث التي أدت إلى إصابة2.
Microglia، الخلايا المناعية المقيمين داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS)، هي أول المستجيبين لإصابة3. ميكروجليا أنواع البلاستيك الخلية مع القدرة على أن تكون وقائية أو السامة، سواء التي تعتمد على البيئة4. أنهم متورطون في إنزيمية، البلعمه، مستضد العرض التقديمي وإنتاج السيتوكينات والأكسجين التفاعلية الأنواع4،5. ميكروجليا مسن باستمرار مسح البيئة ويتم تنشيطها بوجود مادة ضارة أو أجنبية4. ويؤدي التنشيط إلى استجابة برو تحريضية، أهمية حاسمة في حماية الجهاز العصبي المركزي4. هذه microglia النمط الظاهري "برو-التحريضية" M1 تشارك أساسا في مستضد العرض التقديمي والموت من مسببات الأمراض4. رغم الدور الحاسم للاستجابة الالتهابية في نيوروبروتيكشن، التهاب غير المنضبط أو لفترات طويلة يمكن أن تكون ضارة وتؤدي إلى تلف الخلايا العصبية4. ومع ذلك، عند التعرض لبعض المؤثرات البيئية، يمكن أن يحمل microglia النمط الظاهري للالتهابات. هذه microglia M2 برو الترميمي لها دور حاسم في التئام الجروح وإصلاح6، الإفراج عن مجموعة من السيتوكينات والوسطاء الآخرين للذوبان أن التهاب downregulate، زيادة البلعمه وتعزيز إصلاح4، 7-أدوار microglia متنوعة وتشمل التمايز oligodendrocyte القيادة أثناء إعادة-مييلينيشن8، حماية الخلايا العصبية من خلال استنزاف الأوكسجين والجلوكوز في السكتة الدماغية نماذج9 وتعزيز ثمرة نورت في إصابات النخاع الشوكي ونماذج10.
دراسة هذه الخلايا الدبقية يمثل جانبا مهما في فهم ومعالجة الرد على نيوروينفلاميشن. وصف بروتوكول يسمح للمزيد من التحقيق في القدرة العلاجية للتحوير microglia في اضطرابات نيوروينفلاماتوري.
وقد لوحظ تحوير التنشيط microglial نحو دور محصن في طائفة من الظروف11،،من1213. وبالتالي، تحسين الفهم الحالي ومواصلة دراسة تحوير microglial التنشيط الحرجة، التي تتطلب استخدام نماذج مختلفة بما في ذلك على حد سواء في المختبر و في فيفو. في المختبر الدراسات تمثل أداة هامة نظراً لزيادة كفاءتها وأقل تكلفة والقدرة على التحقيق في نسبة سكان خلية معزولة.
وهناك مجموعة من البروتوكولات المذكورة في الأدب لعزل ميكروجليا من العقول مورين، التحدي المتمثل في كفاءة إنتاج عالية غلة عينة مع بقاء جيدة ودرجة نقاء عالية. أساليب شائعة لعزل microglia الأولية بالفصل المغناطيسي وتهز المطول للثقافات الدبقية مختلطة. من خلال تجربة شخصية، ووجد أن هناك درجة عالية من الحطام الخلوية التي أعاقت العمود المغناطيسي. وبالتالي، استخدم البروتوكول التالي، الذي يتضمن خطوة الطرد المركزي تدرج كثافة أولية متبوعاً بالفصل المغناطيسي CD11b. وقد تم تحسين البروتوكول، المذكورة أدناه لإنتاج عينة نقية جداً بكميات كافية. فإنه من المفيد درجة نقاء عالية وفترة زمنية قصيرة بسبب — واحد يمكن إجراء فحوصات خلال يومين دون الحاجة إلى الثقافة لمدة 2-3 أسابيع. هذا البروتوكول يمكن تكييفها محتملة لعزل astrocytes موريني الأولية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الإجراءات التالية التي أقرتها "لجنة الأخلاقيات الحيوان" في جامعة موناش. واستخدمت الفئران C57Bl6/ي ف-3-6 الوليد غير المعالجة الصحية لتوليد نتائج الممثل.
1-الانزيمية الهضم
ملاحظة: من المهم النظر في العقم عند عزل واستزراع الخلايا الأولية. حين ضمان البيئة العقيمة، قدر الإمكان، بالتشريح الأولى وحصاد العقول مورين يمكن أن تكتمل خارج غطاء تدفق لامينال، مع الخطوات اللاحقة كلها داخل غطاء الاندفاق الصفحي.
- باستخدام أدوات معقمة، euthanize الماوس بخلع سرطان عنق الرحم، وقطع رأس الحيوان وشطف مع الإيثانول 100%. باستخدام مقص معقم صغيرة، جعل شقوق صغيرة على طول الجانبين الأيمن والأيسر من الرأس. في هذا العصر، قشور الجلد بعيداً بسهولة. استخدام نصائح الملقط المنحنية، الشريحة بلطف الأنسجة نحو المنصة لفضح الجمجمة، بما في ذلك في بريجما.
- إدراج غيض مقص في افتتاح القناة الشوكية وجعل شق أفقي لقناة الإذن. إجراء شق على طول خياطة السهمي بريجما، مشيراً بلطف طرف المقص صعودا لمنع الأضرار بالدماغ. إدراج تلميح مقص في بريجما وإجراء شقوق جانبية على الجانبين الأيمن والأيسر من الرأس على طول خياطة كرونال.
- برفق باستخدام الملقط، قشر خارج الجمجمة لفضح الدماغ. للقيام بذلك، فهم حواف الجمجمة كشفها بواسطة الشق الأفقي، واجذب الجمجمة إلى الجانب. وينبغي أن قشر الجمجمة بعيداً بسهولة. استخدام الملقط المنحنية، حلج القطن بلطف تحت الدماغ لإزالته.
- الدماغ في حاوية معقمة 5 مل، يغسل 2-3 مرات مع وسائل الإعلام يغسل المثلج (تعديل النسر المتوسطة (دميم الجلوكوز منخفضة دولبيكو) وتستكمل مع 1% البنسلين-ستربتوميسين)، حوالي 5 مل وسائل الإعلام كل المياه والصرف الصحي، لإزالة الدم.
- في غطاء تدفق الهواء الصفحي، وضع محتويات الحاوية 5 مل في طبق بتري صغيرة (35 ملم)، ويستريح على الجليد. استخدام شفرة مشرط معقم أو مقص العقيمة، إزالة المخيخ ولمبة شمي. جعل خط الوسط قطع لفصل نصفي.
- قشر بعيداً بعناية الطبقة سحائي مع الملقط غرامة، مع الحرص على عدم الأضرار كورتيسيس. تحديد الطبقة سحائي كطبقة رقيقة جداً من الخلايا مع مسحه حمراء على سطح الدماغ، ومع الأوعية الدموية مرئية. حفظ الدماغ البارد ضروري لإزالة السحايا السليم. إذا كانت الطبقة سحائي فواصل، مواصلة تقشير بعيداً من شظايا ممزقة حتى تتم إزالته تماما.
- نقل في نصفي الكرة الأرضية إلى صحن بتري صغير جديد (على الجليد) والتعبئة مع الغسيل وسائل الإعلام. ختم المخ إلى قطع صغيرة بدون مشرط عقيم بليد/مقص.
ملاحظة: ينبغي أن تكون هذه ~ 1 مم2 في الحجم، وينبغي الحرص لا قطع منها إلى قطع صغيرة جداً، وهذا قد يقلل من المحصول. - إضافة 100 ميليلتر غراء (17 ش/mg الأسهم) و 150 ميليلتر الدناز أنا في وسائط الإعلام، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية
- وبعد عملية الهضم، تريتوراتي الأنسجة باستخدام ماصة P1000. إذا قطع الأنسجة تكون كبيرة جداً للدخول الماصة، النظر في استخدام زوج أو مقص معقم لتوسيع تلميح ماصة. أثناء هذه العملية، تأخذ الحرص على عدم إدخال فقاعات في وسائل الإعلام، وهذا قد يقلل من جدوى خلية.
2. إزالة الأنقاض المايلين
- تحت غطاء الاندفاق الصفحي استخدام المعدات المعقمة، وإعداد أنبوب مخروطي 50 مل مع مصفاة 100 ميكرومتر خلية، كل في الدماغ. صب محتويات طبق بيتري، يحتوي على خلاصة القطع المتوسطة والدماغ على مصفاة. دفع عن طريق قطعة الدماغ باستخدام المكبس من المحاقن المعقمة 3 مل في حركة طحن حتى يكون هناك لا أنسجة أكثر وضوحاً. وبعد الهضم، وأنسجة المخ ينبغي أن ينهار بسهولة.
- بشكل مستمر يجب غسل الفلتر مع وسائط الإعلام، والمياه والصرف الصحي التي تتصدر حتى مصفاة الخلية طوال هذه العملية. هذا سوف تغسل من خلال أية خلايا محاصرين في مصفاة.
ملاحظة: ينبغي أن يتم هذا حتى يكون هناك تقريبا ~ 15 مل في الأنبوب. هذا هو لضمان أن المصفاة يتم غسلها بما فيه الكفاية عن طريق وتعظيم كمية الخلايا التي تم جمعها. -
الطرد المركزي من تعليق خلية مفردة في ز 500 x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. وخلال هذا الوقت، إعداد المتوسطة الكثافة التدرج كما هو موضح.
- إعداد بركل الأسهم متساوي التوتر (SIP)، التي هي وسيلة التدرج كثافة استخدامها. القيام بذلك عن طريق إضافة 9:1 نسبة الكثافة المتوسطة الانحدار إلى 10 × العقيمة هانكس الملح حل متوازن (حبس).
- إعداد التدرجات ك 30 المسبار المسبار في دميم % و 70% في 1 x HBSS. على سبيل المثال، لإعداد 10 مل 30% SIP، أضف 3 مل المسبار إلى 7 مل دميم.
- نضح المادة طافية من أنابيب مخروطية الشكل وريسوسبيند بيليه الخلية مع مل 8% 30 المسبار في دميم. نقل المجلد كامل إلى أنبوب مخروطي طازجة 15 مل.
- الأساس الذي تقوم عليه الحل المسبار 70%. للقيام بذلك، ملء ماصة نقل مع 70% المسبار والدفع عن طريق ماصة نقل إلى الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية بعناية. مجرد التلميح يقع بالقرب من الأسفل، دفع بلطف من خلال محتويات ماصة نقل.
ملاحظة: القيام بذلك ببطء حتى لا يؤدي إلى تعطيل الواجهة 30/70. يجب أن يكون هناك خط واضح يفصل بين الطبقتين. - الطرد المركزي الطبقات المسبار، بما في ذلك الخلايا، في 650 x ز مع الفرامل 0 وتسريع 4، لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: من الضروري لإكمال وتدور مع الفرامل قبالة والسماح لأجهزة الطرد المركزي تأتي ببطء إلى توقف تطبيق الفرامل سيتم تعطيل في الطور البيني وتخفيض هائل في جمع الخلايا بين الطبقات المسبار. - نضح الحطام الخلوية في الجزء العلوي من الأنبوب، وإزالة ما يقرب من 4 مل وسائل الإعلام من الأعلى. وسوف يخفف هذا من إزالة الخلايا وحيدات النوى في الخطوة التالية. استخدام ماصة P1000، بعناية أقل تلميح ماصة صوب الطور البيني. عزل الخلايا وحيدات النوى من واجهة متوسطة الانحدار كثافة 30/70. جمع حوالي 3 مل من واجهة غائم ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديدة. وفي أعقاب ذلك، يضعف المخلوط مع مل 9 من هبس للمساعدة في إزالة المتوسطة الكثافة المتدرجة.
- الطرد المركزي الطور البيني المتوسط التدرج في كثافة مخففة، وتحتوي على خلايا وحيدات النوى في 500 غرام x للحد الأدنى 5 نضح المادة طافية وريسوسبيند مع 1 مل النمو المتوسطة (دميم تستكمل مع الصادات المصل و 1% البقري الجنين 10%). وفي أعقاب ذلك، وصمة عار الخلايا ريسوسبينديد مع تريبان الأزرق وأداء عدد خلايا استخدام هايموسيتوميتير.
3-المغناطيسية تنشيط الخلية الفرز
ملاحظة: يتم تعديل هذه الخطوات من البروتوكول الصانعين.
- الطرد المركزي الخلايا وحيدات النوى التي جمعت في 300 غرام x لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية لإزالة متوسط النمو هذا سوف تتداخل مع العزل المغناطيسي. باستخدام نفس عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.8، المنبسطة ريسوسبيند في 1 × 108 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني (Ca++ وملغ++ الحرة) التي تحتوي على يدتا FBS ومم 1 2%، ضمن نطاق حجم 0.1-2.5 مل.
- إضافة حجم الخلايا المنواه كاملة في برنامج تلفزيوني من الخطوة السابقة إلى أنبوب أسفل جولة البوليستيرين طازجة 5 مل (12 × 75 مم). إضافة 50 ميليلتر CD11b PE كاشف الوسم كل 1 مل عينة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء.
- إضافة ميليلتر 70 من التحديد كوكتيل (مجموعة من الأجسام المضادة ضد CD11b في برنامج تلفزيوني) كل 1 مل عينة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء.
- خلط الجسيمات المغناطيسية التي بيبيتينج صعودا وهبوطاً أكثر من 5 مرات. إضافة 50 ميليلتر/مل للعينة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق محمية من الضوء.
ملاحظة: هذه الجسيمات ثم تشكيل مجمع تيتراميريك مع الأجسام المضادة وسوف تحصل على إرفاق العمود المغناطيسية. - إذا كان الحجم الإجمالي الخليط خلية أقل من 2.5 مل، أعلى تصل إلى هذا الحجم مع برنامج تلفزيوني (Ca++ وملغ++ الحرة) التي تحتوي على يدتا FBS ومم 1 2%، ومزيج من بيبيتينج بلطف 2-3 مرات. ضع الأنبوب (بدون غطاء) في المغناطيس واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- في حركة مستمرة واحدة، تماما عكس المغناطيس الذي يحتوي على الأنبوب ق 2-3، صب قبالة المادة طافية. العودة المغناطيس إلى وضع مستقيم، وإزالة الأنبوب من المغناطيس. إعداد لتغسل الخلايا المتبقية من العمود.
ملاحظة: المادة طافية يحتوي على خلايا غير موسومة وغير المرغوب فيها، التي تتم إزالتها بعكس الأنبوب في حين لا يزال في المغناطيس. الأنبوب يحتوي على Cd11b المرفقة+ الخلايا. - غسل الخلايا بتكرار الخطوات من 3.5 و 3.6 أكثر مرتين. إذا كانت العينة أكبر من 1 مل، يوصي زيادة تكرار الخطوات 3.5 و 3.6.
- ريسوسبيند الخلايا في متوسط نمو المنشود. شطف إلى جانب السفينة، فضلا عن جمع (على سبيل المثال. أنبوب 15 مل) لجمع الخلايا من الجانبين من الأنبوب وتحقيق أقصى قدر من الغلال.
4-تحقق نقاء ميكروجليا
ملاحظة: microglia الأولية المعزولة من 3 لتر (n = مجموع 5 الحيوانات) تم التحقق منها عن طريق خلية تنشيط الفلورسنت الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لتحديد نقاء لنتائج تمثيلية.
- خلايا الثقافة في قارورة T-25 في الأجلين المتوسط والنمو الذي يحتوي على 10% FBS بين عشية وضحاها، البذر في كثافة 1-2 × 106 خلايا كل قارورة.
- تغسل الخلايا في قوارير T-25 مع برنامج تلفزيوني 3 x لمدة 5 دقائق لإزالة أي وسائط النمو المتبقية التي قد تتداخل مع تريبسينيزيشن.
- إضافة 2 مل التربسين 0.25% لفصل الخلايا من قوارير. تأكد من أن حجم التربسين يكفي لتغطية كامل سطح قارورة. عقب لطيف يحوم من قارورة لضمان تغطية موحدة التربسين، احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- إخماد عملية تريبسينيزيشن بإضافة 2 مل وسائط النمو التي تحتوي على 10% FBS في قارورة.
- جمع المادة طافية تحتوي على خلايا تريبسينيزيد وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية لجمع الخلايا.
- إزالة المادة طافية تتضمن النمو المتوسطة والتربسين وريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ميكروليتر 500. القيام بعدد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق.
- أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تنفيذ كتلة مستقبلات Fc بإضافة 50 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت + 1 ميكروليتر FcR مانع الواحدة 5 × 106 خلايا. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: كتلة مستقبلات Fc خطوة حاسمة في الإجراء المصبوغة لمنع الربط غير محددة من المناعية لمستقبلات Fc في الخلية محصنة ضد السكان. لا يؤثر هذا الحصار على ربط المصب من أجسام أخرى. - إنهاء عملية التجميد بتمييع مع 500 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة. وفي أعقاب ذلك، الطرد المركزي خليط تحتوي على الخلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند طازجة 500 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت.
- وضع معظم الخلايا (مثلاً إذا ريسوسبيندينج الخلايا في 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية، واستخدام 400 ميكروليتر) في أنبوب عينة. توزيع الخلايا المتبقية بين أنابيب التحكم وأعلى يصل إلى 100 ميكروليتر كل أنبوب التحكم (مثلاً لأنابيب التحكم 6، طرح ميكروليتر 16.67 في كل أنبوب التحكم وأعلى مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ميكروليتر 83.33). جعل المجموعات (أنابيب التحكم بخط غامق) أونستينيد وواحد ملون (CD45، CD11b)، واحد يعيش الميت وصمة، فموس وأنابيب العينة.
- بيليه الخلايا في جميع الأنابيب التي سينتريفوجينج في 500 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- وصمة عار الخلايا في الأنبوب مع جسم ميكروليتر 1 من كل 100 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة الواحدة 5 × 106 خلايا. احتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: استخدم 50 ميكروليتر جسم كوكتيل إذا استخدمت أقل من 2 × 106 خلايا. - تغسل الخلايا مع 500 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة. الطرد المركزي الخلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ميكروليتر 300.
ملاحظة: استخدم ~ 100 ميكروليتر إذا كان عدد خلايا أقل من 2 × 106. - باستخدام تحليل التدفق الخلوي، التحديد الكمي للخلايا CD45منخفضة وإيجابية لصبغة CD11b. وهذه النسبة المئوية يناظر microglia الأولية المعزولة.
5-المناعي تلطيخ من Microglia الأولية
- لوحة الخلايا الموجودة في لوحة 96-جيدا في كثافة الخلايا 1 × 105 مع متوسط النمو واحتضان بين عشية وضحاها.
- إزالة المادة طافية ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني لإزالة منهاج عمل بيجين مع ماصة P1000 15 دقيقة، ثم غسلها 3 مرات مع برنامج تلفزيوني + 0.1% تريتون العاشر.
- كتلة للربط غير محددة مع ألبومين المصل البقري 3% ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان مع الأرنب 1-رابطة المحامين الدولية (1: 100) عن 24 ساعة عند 4 درجة مئوية. وفي أعقاب ذلك، إزالة الخليط جسم الأولية ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان مع ثانوية أرنب المضادة التجارة والنقل المتقارن (1: 200) ح 1 في درجة حرارة الغرفة. وفي أعقاب ذلك، إزالة الخليط جسم الثانوية ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- تحميل الشرائح مع الفلورسنت تصاعد المتوسطة والتقاط الصور باستخدام مجهر فلوري.
6-تحديد مقدار استخدام Microglia فرودو المقايسة
ملاحظة: يسمح الإنزيم فرودو لتحديد مستويات البلعمه في الخلايا المستزرعة. عند امتصاص عن طريق الالتقام، يزيد الاستيعاب في البيئة الحمضية أكثر مستويات الأسفار يصرف بيوبارتيكلي. ثم يمكن قياس مستويات الأسفار بنظام مراقبة الأصول الميدانية. يتم تعديل الخطوات التالية من البروتوكول الصانعين.
- ثقافة الخلايا في قارورة T-25 في الأجلين المتوسط والنمو بين عشية وضحاها، البذر في كثافة 1-2 × 106 خلايا كل قارورة. تغسل الخلايا في قوارير T-25 مع برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق.
- فصل الخلايا باستخدام 2 مل 0.25% التربسين. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- إخماد عملية تريبسينيسيشن بإضافة 2 مل وسائط النمو التي تحتوي على 10% FBS في قارورة.
- الطرد المركزي بتعليق خلية في ز x 500 لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه الخلايا.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه المحتوية على microglia الأولية في الثقافة المتوسطة في 106 خلايا/مل.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، لوحة خلايا في صفيحة 96-جيدا على الأقل قبل يوم واحد وتهدف ل 1 × 105 خلايا قابلة للتطبيق للبئر الواحد في اليوم التحليل التي يتعين القيام بها. - خلايا لوحة إلى لوحة 96-جيدا في 1 × 105 خلايا/حسنا، 100 ميكروليتر كل بئر. لوحة التحكم وآبار تجريبية في ثلاث نسخ، وترك بئر فارغة واحدة في مراقبة إيجابية لطرح خلفية الخلية لا تحكم.
- إضافة 100 ميكروليتر من وسائط النمو إلى الآبار التي تركت فارغة لخلفية الخلية لا الطرح.
ملاحظة: مثل أي أخرى في المختبر المقايسة، عناصر التحكم المناسبة حيوية بالنسبة لدقة قراءات. جنبا إلى جنب مع لا-الخلية التحكم (خلفية القراءة)، كما تشمل مراقبة سلبية جيدا (المتقارن فرودو وأضاف ولكن على الجليد). - وتغطي اللوحة واحتضانها ح 1 في حاضنة مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
- تحضير آبار تجريبية عن طريق إضافة المنشطات والعلاج. إضافة عناصر التحكم المركبة (وسائط النمو فقط) إلى الآبار غير المعالجة.
ملاحظة: Lipopolysaccharide 1 ميكروغرام/مل [منبه] والخلايا الظهارية amnion البشرية (حايك)-استخدمت وسائط الإعلام مكيفة [المعاملة] لتوليد نتائج تمثيلية. - ذوبان الجليد قنينة صبغ مترافق، إضافة 2 مل الإقبال على المخزن المؤقت ودوامه بإيجاز. نقل محتويات الأنبوبة في أنبوب زجاج نظيفة و sonicate لمدة 5 دقائق، التأكد من أن الجزيئات موزعة بالتساوي.
- نضح المتوسطة الثقافة من آبار الميكروسكوبية واستبدالها بسرعة 100 ميكروليتر من تعليق صبغ. تغطية واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
ملاحظة: تذكر لوصمة عار أنابيب التحكم كذلك. - باستخدام تحليل التدفق الخلوي، التحديد الكمي للخلايا تلطيخ إيجابية بالنسبة الخرز فرودو مترافق ويقدم كنسبة مئوية (أصل) من نشاط فاجوسيتوسينج ميكروجليا.
7-التحديد الكمي للمبرمج Microglia بعد إهانة التحريضية
- كرر الخطوات 1-7 من القسم "تحقق نقاء microglia".
- وضع معظم الخلايا (مثلاً إذا كنت حراكه الخلايا في 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية، واستخدام 400 ميكروليتر) في أنبوب عينة. توزيع الخلايا المتبقية بين أنابيب التحكم وأعلى يصل إلى 100 ميكروليتر كل أنبوب التحكم (مثلاً لأنابيب التحكم 6، طرح ميكروليتر 16.67 في كل أنبوب التحكم وأعلى مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية 83.33 ميكروليتر). المجموعات (أنابيب التحكم بخط غامق): البقع أونستاينيد، واحد (أننيكسينف, يوديد Propidium)، واحد يعيش الميت وصمة عار، فموس، عينة أنابيب.
- بيليه الخلايا في جميع الأنابيب التي سينتريفوجينج في 500 غرام x لمدة 5 دقائق.
- احتضان مع 1 ميكروليتر جسم/100 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت/5 × 106 خلايا لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: استخدم 50 ميكروليتر إذا كان أقل من 2 × 106 خلايا. - غسل الخلايا بإضافة 500 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت والطرد المركزي في ز x 500 لمدة 5 دقائق.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ميكروليتر 300.
ملاحظة: ~ 100 ميكروليتر إذا كان عدد خلايا أقل من 2 × 106. - التحديد الكمي للخلايا داخل كل رباعي (Q1: نخرية، Q2: الراحل apoptotic، Q3: قابلة للاستمرار، Q4: apoptotic المبكر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام الأساليب المذكورة هنا، يمكن عزل السكان نقية من microglia ويمكن أن تكون جاهزة لتوصيف استخدام في المختبر ، ونظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل. بادئ ذي بدء، ما يصل إلى 18 الحيوانات يمكن استخدام كل إعدام، مع غلة المتوقعة حوالي 450,000-600,000 ميكروجليال الخلايا. من المهم أولاً تأكيد نقاء الخلايا المعزولة، والقيام بذلك تم إجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية تلطيخ لعلامات اثنين CD45 و CD11b-تحديد microglia يمكن إثبات مزعجة، كما أعرب أيضا عن علامات كثيرة أعربت عن طريق ميكروجليا الضامة، واستخدام هذه العلامات اثنين يسمح التحديد الكمي دقيقة وموثوق بها. على وجه التحديد، microglia قد تعبير منخفضة من CD45، مقارنة بتعبير عالية في الجهاز العصبي المركزي والضامة المحيطية، وهي أيضا إيجابية بالنسبة CD11b (الشكل 1). وذكر من هذه العزلة، وخاصة درجة نقاء 89.3 في المائة. بعد تلطيخ ل CD11b، ونلاحظ أن لدينا microglia الأولية مشاركة الخصائص المورفولوجية مماثلة، مع مجموعة من مورفولوجيس من وضوح أونراميفيد (كبير كروية خلية الجسم مع عمليات موسعة قليلاً أو لا) إلى متشعب أكثر (مع أصغر وأكثر شكل بيضوي سوماتا وعادة ما يصل إلى عمليات النظام الثانوي) مضاهاة لمجموعة من الدول التنشيط، كما يتوقع أن يرى في فيفو (الشكل 2).
وفي أعقاب ذلك، تم تشغيل اثنان فحوصات توصيف وظيفة microglia والبقاء على قيد الحياة. Microglia الرئيسية الخلية متجولة في الجهاز العصبي المركزي والمقايسة فرودو يسمح التحديد الكمي لهذه الخاصية وظيفية معينة. وذكر بزيادة 3-fold قريب في الدالة متجولة بعد 24-ح ثقافة المشارك مع حايك مكيفة المتوسطة (الشكل 3)، مقاسا بالتحديد الكمي للجسيمات الفلورية فرودو. أخيرا، أجرى أنيكسينف-PI المصبوغة التالية المشارك ثقافة للتعرف على البقاء على قيد الحياة microglia بعد إهانة تحريضية. تخفيض المبرمج microglia بعد أن لوحظ العلاج مع المتوسطة مكيفة (الشكل 4). وتوحي هذه النتائج أن متوسطة حايك مكيفة microglia ويحمي ويعزز نشاطها متجولة، الذي قد يكون العلاج في اضطرابات الدماغ قبل الولادة الإصابة ونيوروينفلاماتوري.
الشكل 1 : التعبير عن CD45 و CD11b من ميكروجليا. كل نقطة تمثل خلية وصفت ونظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل يتيح توضيح السكان خلية منفصلة. Microglia تعبير أقل من مستضد CD45 الضامة المشتقة من الوحيدات هامشية بالمقارنة مع وهي إيجابية ل CD11b. الأرقام أدناه جسم التسمية تشير إلى نسبة الخلايا بوابات معبراً عنها بالنسبة المئوية من السكان الأصل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : مورفولوجية microglia الابتدائي معزول. كما يمكن أن يرى في هذا الرقم، الاحتفاظ microglia كروية خلايا الجسم والهيكل متشعب متميزة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر.
الشكل 3 : التحديد الكمي للدالة متجولة في microglia الابتدائي معزول. الجسيمات المسمى فرودو فلوريس فقط عندما تكون في البيئات الحمضية، مثلما حدث في اندوسوميس الخلوية بعد البلعمه. هنا، يلاحظ زيادة في امتصاص الجسيمات فرودو في microglia تعامل مع المتوسطة حايك مكيفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تحليل لبقاء microglia بعد إهانة التحريضية. (أ) نظام مراقبة الأصول الميدانية الممثل قطع microglia معزولة. تلطيخ مجتمعة من يوديد propidium وأنيكسينف يسمح التصنيف في أبوبتوتيك، نخرية، أو خلايا حية بعد التحفيز بلبس. حايك (ب) مكيفة متوسطة المبرمج microglia انخفاضا كبيرا بالنسبة لعناصر التحكم، مما يشير إلى شكل من أشكال الحماية لهذا النوع من الخلايا. * يعني ف < 0.05، اختبار t للطالب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| غسل المتوسطة |
| تعديل دولبيكو الجلوكوز منخفضة متوسطة النسر |
| 1% v/v البنسلين-ستربتوميسين |
| هضم المتوسطة (في الدماغ) |
| 150 ميليلتر الدناز أنا |
| 100 ميليلتر غراء (الأسهم 17U/mg) |
| 3 مل أغسل المتوسطة |
| متوسط النمو |
| تعديل دولبيكو الجلوكوز منخفضة متوسطة النسر |
| 10% مصل بقرى الجنين |
| 1% v/v البنسلين-ستربتوميسين |
الجدول 1: جدول للحلول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microglia لديها القدرة على أن برو والمضادة للالتهابات، غيرت من المحفزات البيئة. وقد أظهرت الدراسات السابقة يمكن أن يضفي تحوير microglia التنشيط نيوروبروتيكشن. قدرتها على توفير الحماية للخلايا العصبية وإصلاح الضرر يتطلب إجراء مزيد من البحوث مزيد من الفهم الحالي لهذه الخلايا معقدة. وهكذا، عزل microglia الأولية عالية النقاء تقنية هامة ومفيدة. هذا طريقة سريعة نسبيا للحصول على microglia الأولية عالية نقية جاهزة للتجريب في المختبر خلال يومين.
وهناك مجموعة من البروتوكولات المذكورة في الأدب لعزل microglia الأولية من العقول موريني. أن التحدي الرئيسي كفاءة إنتاج عينة كافية، عالية في البقاء والنقاء. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو العائد من عينة نقية جداً دون الحاجة إلى الوقت في الثقافة. وهكذا، الأسلوب هو تقصير من أسبوعين إلى يومين، وهذا ييسر نتائج سريعة. وصف الخطوات التي تسفر عن بيانات وظيفية قوية حول microglia، تعزيز الفهم الحالي لهذه الخلايا معقدة. البروتوكول يجمع بين النهجين الحالية-الكثافة المتدرجة الطرد المركزي والفصل المغناطيسي. قد تم التحقق من الفصل المغناطيسي جيدا في الأدب لعزل microglia بطريقة رقيقة نسبيا مقارنة بغيرها العزلة تقنيات14،،من1516. بينما هناك دون شك تغييرات الخصائص الوظيفية ل microglia الابتدائي معزول مقارنة في تلك الدولة الأصلية في فيفو، أية تغييرات على خصائص microglia كما هو ملاحظ في فحوصات المتقدمة أعلاه يتم حسابها من الهضم بعد خط الأساس، وعلى هذا النحو هي انعكاس للتعديل المباشر من هذه المجموعة الفرعية محصنة.
في حين البروتوكول بسيط نسبيا، الرعاية خلال الخطوات الحاسمة سيساعد على ضمان عائد جيد. أولاً، من الضروري استخدام الوسائط الجلوكوز منخفض لدعم النمو الدبقية. وعلاوة على ذلك، أدمغة مورين يجب الاحتفاظ بالجليد الباردة في جميع الأوقات أثناء العزلة. ومن ثم، يوصي بالبرد قبل جميع المتوسطة، فضلا عن الصكوك إذا كان ذلك ممكناً، وتنفيذ الإجراء على الجليد. الأهم من ذلك، سيؤدي إلى الأكثر فقراً خلية الصحة مرات العزل لفترات طويلة وتعطي، وبالتالي من الأهمية بمكان أن تعمل بسرعة. وعلاوة على ذلك، إزالة الطبقة سحائي السليم خطوة حاسمة عند العمل مع الفئران الكبار، إلا الخلايا الليفية سوف أووتكومبيتي الخلايا الدبقية من حيث النمو. أثناء الهضم الأنزيمي للعقول، من المهم عدم قطع العقول إلى قطع صغيرة جداً كهذا يمكن أن تزيد من موت الخلايا، والهدف من الناحية المثالية عن 1 مم2 قطعة من الأنسجة. عند طحن الأنسجة من خلال مصفاة الخلية، أشطف جيدا مع وسائل الإعلام كل بضع دقائق التأكد من كافة الخلايا يتم غسلها من خلال وليس الحصول على المحاصرين في مصفاة، بالإضافة إلى ذلك فإنه من المستحسن استخدام مصفاة خلية 100 ميكرومتر، يؤدي إلى أصغر المرشحات انخفاض الإنتاجية. خطوة حاسمة أخرى هي أونديرلايينج 70 ٪ كثافة طبقة متوسطة التدرج، وتنفيذ هذه الخطوة بعناية وبطء ضمانا لينظر الطور البيني واضحة أمر ضروري، يوصي باستخدام ماصة باستور. أيضا، يوصي باستخدام أنابيب مخروطية الشكل 15 مل كما فصل الخلايا كان أقل فعالية عندما استخدمت أنابيب مخروطية 50 مل. وأخيراً، يجب أن يتم استخدام الطرد المركزي التدرج في كثافة في درجة حرارة الغرفة، درجة الحرارة يمكن أن تؤثر على التدرج الكثافة.
ويصف هذا البروتوكول طريقة موثوقة لإنتاج خلايا نقية جداً microglia الأولية كما هو موضح بالتعبير عالية من CD45 والتعبير الإيجابي عن Cd11b (بالمقارنة مع انخفاض التعبير CD45 ينظر في وحيدات الطرفية). الخلايا يمكن أيضا أن تكون معزولة بشكل سريع نسبيا، وبالتالي فقد نطاق الفهم زيادة كبيرة لهذه الخلايا إطلاق. ويمكن استخدامه لتحديد السكان microglia مختلفة من خلفيات مختلفة، مما يسمح للدراسات التي قد تكشف عن الاختلافات بين ميكروجليا المعزولة من الحيوانات المريضة أو إصابة وصحية. من خلال عزل السكان microglia نقية، يمكن تقييم التحوير العلاجية لهذه الفئة من السكان الخلايا المناعية. على سبيل المثال، وجد أن وسائل الإعلام مكيفة هايك زيادة البلعمه، فضلا عن تحسين بقاء microglia خلال حافز تحريضية، مما يتيح فوائد علاجية17. وهذا يرتبط بتخفيض الحطام apoptotic ومما يوحي بإزالة الحطام هذه قد يكون لها آثار محصن.
يمكن تطبيق البروتوكول على الفئران حديثي الولادة أو البالغين على حد سواء، سوف تنتج الفئران الأكبر سنا ولكن انخفاض عائد. وعلاوة على ذلك، قد تكون مناسبة لعزل astrocytes الأولية من الفئران حديثي الولادة أو للبالغين، ومرة أخرى الفئران الأكبر سنا سيؤدي إلى انخفاض عائد. بالإضافة إلى ذلك، قد زيادة تحسين التعديل خطوة الانفصال الميكانيكية مع شبكة نايلون مصنوعة خصيصا مع أحجام مسام أكبر مقارنة مصفاة خلية 100 ميكرومتر، خلية الغلة18.
وتشمل القيود المفروضة على هذا البروتوكول العائد أقل والوقت المطلوب لهذا البروتوكول. العائد هو حوالي 150,000 200,000 الخلايا الواحدة وإعدام الحيوانات الستة، مقابل الملايين التي يمكن الحصول عليها من خلال أسابيع زراعة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، بينما يمكن الحصول على الخلايا في غضون يومين، هذا الإجراء في اليوم الأول وقتاً طويلاً جداً، أخذ ما يقرب من ست ساعات.
ومع ذلك، هذا الأسلوب أداة مفيدة للغاية في فهم دور microglia في المرض، وقادرة على عزل وتميز الخلايا في غضون يومين. وتنتج الخلايا microglia الأولية عالية النقاء، تيسير بحوث دقيقة وفعالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
