Summary
פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.
Abstract
מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב במוח, הם המגיבים הראשונים כדי דלקת או פגיעה במערכת העצבים המרכזית. מחקר שנערך לאחרונה גילה מיקרוגלייה דינאמיות, מסוגל בהנחה פנוטיפים הן הפרו דלקתיים ואנטי דלקתיות. M1 (פרו-דלקתיים) והן M2 (pro-תיקוני) פנוטיפים לשחק תפקיד חשוב neuroinflammatory מצבים כגון פגיעה מוחית הלידה, נספח שונות פונקציות בתגובה לגירויים סביבתיים מסוימים. מודולציה של הפעלת microglial נרשמה להיוועץ neuroprotection ובכך רומז מיקרוגלייה ייתכן הפוטנציאל הטיפולי של פגיעה מוחית. עם זאת, מחקר נוסף נדרש כדי להבין טוב יותר את התפקיד של מיקרוגלייה במחלה, פרוטוקול זה מאפשר את זה. הפרוטוקול המתואר להלן משלב תהליך צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות להפחתת פסולת הסלולר, עם הפרדה מגנטית, הפקת מדגם מאוד טהור של תאים microglial העיקרי שיכול לשמש לניסויים בתוך חוץ גופית , בלי הצורך 2-3 שבועות culturing. בנוסף, השלבים אפיון תשואות פונקציונלי נתונים אודות מיקרוגלייה, מחקרים לשיפור ההבנה שלנו של קיטוב וסיוע הטרמה של תאים אלה, אשר יש השלכות חזק בתחום של רפואה רגנרטיבית.
Introduction
נזק רכשה במהלך תקופת הלידה דלקת, מחוסר חמצן-ischaemia, דימום יכול להיות מערך של sequelae לטווח ארוך. הפתופיזיולוגיה המורכבת של פגיעה מוחית הלידה הוא משוער לערב דלקת ו איסכמיה עם מוות עצביים עצב שהתפתח1. התגובה החיסונית מולדת ממלא תפקיד חשוב בהמפל של האירועים שהובילו פגיעה2.
מיקרוגלייה, תושב תאים חיסוניים בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS), הם המגיבים הראשונים פציעה3. מיקרוגלייה הם סוגי תאים פלסטיק עם היכולת להיות תלויי מגן או רעיל, על הסביבה4. הם מעורבים כימוטקסיס, phagocytosis, מצגת אנטיגן וייצור של ציטוקינים ו4,של מינים חמצן תגובתי5. מיקרוגלייה senescent כל הזמן סקר את הסביבה, מופעלים על ידי הנוכחות של חומר זר או מזיקים4. הפעלת מוביל לתגובה הפרו דלקתיים, קריטי ב CNS הגנה4. מיקרוגלייה פנוטיפ "פרו-דלקתיים" אלה M1 מעורבים בעיקר אנטיגן מצגת ומוות של פתוגנים4. למרות תפקיד מכריע התגובה דלקתית neuroprotection, דלקת בלתי מבוקרת או ממושך יכול להיות מזיקים להוביל נזקים עצביים4. עם זאת, כאשר הם נחשפים לגירויים סביבתיים מסוימים, מיקרוגלייה יכול התערוכה של פנוטיפ אנטי דלקתיות. מיקרוגלייה M2 pro-תיקוני אלה יש תפקיד קריטי פצע ריפוי ותיקון6, שחרור מגוון של ציטוקינים ותיקון עוד מגשרים מסיסים downregulate דלקת, להגדיל phagocytosis ולקדם4, 7. התפקידים של מיקרוגלייה הינם מגוונים וכוללים בידול אוליגודנדרוציטים נהיגה במהלך re-myelination8, הגנה על נוירונים במהלך דלדול חמצן, גלוקוז מודלים קו9 וקידום תוצר neurite ב פגיעה בחוט השדרה מודלים10.
המחקר של אלה גלייה מייצג היבט חשוב להבנה, מניפולציה התגובה neuroinflammation. הפרוטוקול המתואר מאפשר חקירה מתמשכת לתוך הפוטנציאל הטיפולי של אפנון מיקרוגלייה בהפרעות neuroinflammatory.
מודולציה של הפעלת microglial לקראת תפקיד neuroprotective נצפתה במגוון של מצבים11,12,13. לכן, שיפור ההבנה הנוכחית נוספת ללמוד אפנון של הפעלת microglial הוא קריטי, הדרישה לשימוש של מודלים שונים כולל חוץ גופית בתוך ויוו. מחקרים במבחנה מייצגים כלי חשוב בשל שלהם גדול יותר, נמוך יותר עלות ויעילות היכולת לחקור אוכלוסיה תא מבודד.
ישנם מגוון של פרוטוקולים המתוארים בספרות על בידודו של מיקרוגלייה מן המוח מאתר, האתגר לייצר ביעילות מדגם תשואה גבוהה עם יכולת הקיום טוב, טוהר גבוהה. השיטות הנפוצות של בידוד של ראשי מיקרוגלייה הן על ידי הפרדה מגנטית ורעדתי ממושך של תרבויות גליה מעורבת. מניסיון אישי, התברר שהיה שם מידה רבה של פסולת הסלולר אשר נחסמת העמודה מגנטי. כך, הפרוטוקול הבא היה מנוצל, אשר משלבת צעד צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הראשוני ולאחריו הפרדה מגנטית CD11b. הפרוטוקול המתואר להלן מוטבה כדי לייצר מדגם הטהור מאד בכמות מספקת. . זה יתרון בשל טוהר גבוהה שלה ואת תקופת זמן קצר – אחד יכול לבצע מבחני תוך יומיים ללא צורך תרבות במשך 2-3 שבועות. באופן פוטנציאלי יכול להיות מותאם פרוטוקול זה בידודו של ראשי האסטרוציטים מאתר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליכים הבאים אושרו על ידי ועדת האתיקה חיה ב אוניברסיטת מונש. בריאה neonate טיפול C57Bl6/J P3-6 עכברים שימשו כדי להפיק את התוצאות נציג.
1. עיכול אנזימטי
הערה: חשוב לשקול עקרות כאשר בידוד culturing ראשי תאים. תוך הקפדה שהסביבה הוא סטרילי ככל האפשר, הקרע הראשוני ואת הקציר של המוח מאתר יכולה להסתיים מחוץ ברדס זרימה laminal, עם כל והשלבים מבוצעים תא למינארי.
- באמצעות מכשירים סטריליים, המתת חסד העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם, לערוף את החיה, לשטוף עם 100% אתנול. בעזרת מספריים קטנות סטרילי, לבצע חתכים קטנים לאורך צד ימין ועל שמאל של הראש. בגיל הזה, העור קליפות משם בקלות. באמצעות קצות המלקחיים מעוקל, החלק בעדינות את הרקמה לכיוון פניו כדי לחשוף את הגולגולת, כולל את Bregma.
- הכנס את קצה המספריים הפתיחה של תעלת השדרה, עושים חתך לרוחב אל תעלת האוזן. לבצע חתך לאורך התפר המשונן Bregma, הצבעה בעדינות את קצה המספריים כלפי מעלה כדי למנוע נזק למוח. להוסיף טיפ מספריים Bregma ולבצע חתכים לרוחב צידי הראש לאורך התפר הפרונטליים ימינה ושמאלה.
- באמצעות מלקחיים, בעדינות הקילוף הגולגולת כדי לחשוף את המוח. כדי לעשות זאת, את הקצוות של הגולגולת שנחשפו על ידי חתך לרוחב, ומשוך בעדינות את הגולגולת אל הצד. הגולגולת צריך לקלף בקלות. בעזרת מלקחיים מעוקל, סקופ בעדינות לתוך המוח כדי להסיר אותו.
- מקום במוח במיכל סטרילי של 5 מ"ל, לשטוף 2 - 3 פעמים עם שטיפת קר כקרח מדיה (של גלוקוז נמוך Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין), כ- 5 מ ל מדיה לכל שטיפת, ולהסיר את הדם.
- בשכונה למינריות זרימת אוויר, למקם את התוכן של הגורם המכיל 5 מ"ל בצלוחית קטנה (35 מ מ), נח על קרח. באמצעות אזמל סטרילי להב או מספריים סטרילי, הסר את המוח ואת הריח הנורה. להפוך את קו האמצע לחתוך כדי להפריד בין שתי האונות.
- בזהירות לקלף את השכבה של קרום המוח עם מלקחיים בסדר, מטפל לא לפגוע cortices. לזהות את שכבת קרום המוח כמו שכבה דקה מאוד של תאים עם גוון אדום על פני השטח של המוח, עם כלי דם גלוי. שמירה על המוח קר חיוני להסרת קרומי המוח תקין. אם השכבה של קרום המוח שובר, המשך פילינג משם השברים קרוע עד שיוסר לחלוטין.
- להעביר את ההמיספרות חדש קטן פטרי (בקירור), מילוי עם שטיפת המדיה. קוצצים את המוח לחתיכות קטנות עם האזמל סטרילי סכין/מספריים.
הערה: אלה צריכים להיות ~ 1 מ מ2 בגודל, להקפיד לא לחתוך אותם לחתיכות קטנות יותר מדי כמו זה עשוי להפחית את התשואה. - להוסיף µL 100 פפאין (מניות U/מ ג 17) ו- 150 µL DNase אני לתוך המדיה דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C
- בעקבות עיכול, triturate רקמות באמצעות פיפטה של P1000. אם הרקמה חלקים גדולים מדי כדי להזין את פיפטה, שקול להשתמש בזוג או מספריים סטרילי להרחיב את הטיפ פיפטה. במהלך תהליך זה, לטפל לא כדי להציג בועות לתוך המדיה כמו זה עשוי להפחית את הכדאיות התא.
2. מיאלין פסולת להסרת
- תחת תא למינארי להשתמש הציוד סטרילי, להכין צינור חרוטי 50-mL עם 100 מיקרומטר תא מסננת, עבור כל המוח. שופכים את תכולת הפטרי, המכיל את תקציר בינוני והמוח החתיכות על גבי מסננת. יקדם את החלקים של המוח באמצעות הבוכנה של מזרק mL 3 סטרילי בתנועה שחיקה עד שיש אין רקמות יותר גלוי. בעקבות עיכול, רקמת המוח צריך להתפרק בקלות.
- ללא הרף לשטוף את המסנן עם התקשורת לשטוף, מאת מצטייד מסננת את התא לאורך כל התהליך הזה. זה ואשטוף דרך תאים לכוד בתוך מסננת...
הערה: זה צריך להיעשות עד שיש כ ~ 15 מ"ל בצינור. זה כדי להבטיח כי מסננת מספיק נשטף דרך וכדי למקסם את כמות התאים שנאספו. -
Centrifuge התליה תא בודד ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. במהלך תקופה זו, להכין את המדיום הדרגתיות צפיפות כמתואר.
- הכינו את percoll מול מניות (SIP), אשר הוא המדיום צפיפות הדרגתי בשימוש. לעשות זאת על-ידי הוספת 9:1 יחס של צפיפות בינונית הדרגתיות 10 x סטרילי הנקס מאוזנת תמיסת מלח (HBSS).
- להכין מעברי צבע עד 30% SIP ב- DMEM ו- 70% ללגום ב 1 x HBSS. לדוגמה, כדי להכין 10 מ"ל של 30% SIP, להוסיף 3 מ"ל של SIP 7 mL DMEM.
- וארוקן את תגובת שיקוע צינורות חרוט, resuspend בגדר תא 8 מ של 30% ללגום ב- DMEM. להעביר את אמצעי האחסון מלא צינור חרוטי טריים 15 מ"ל.
- ביסוד הפתרון SIP 70%. כדי לעשות זאת, למלא פיפטה העברה של 70% SIP וקדם בקפידה העברת פיפטה לתחתית הצינור חרוט. לאחר הטיפ קרוב לתחתית, דחף בעדינות דרך התוכן של פיפטה העברה.
הערה: לעשות את זה לאט כדי לא לשבש את הממשק 30/70. בטח יש קו ברור המפריד בין שתי השכבות. - Centrifuge את השכבות SIP, לרבות תאי, ב g x 650 ועם בלם 0 ההאצה 4, 25 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: זה חיוני כדי להשלים את הסיבוב עם בלם את ולאפשר לצנטריפוגה לבוא לאט לקיפאון, כמו יישום של בלם לשבש את לאטמוספרה, להפחית באופן דרמטי את האוסף תא בין שכבות SIP. - האחות ההריסות הסלולר בחלק העליון של הצינור, ולהסיר כ 4 מ"ל מדיה מלמעלה. זה תקל את ההסרה של תאי תאי בשלב הבא. בזהירות בעזרת פיפטה P1000, אפשרות להוריד את הטיפ פיפטה לכיוון לאטמוספרה. לבודד תאי תאי מממשק 30/70 צפיפות בינונית הדרגתיות. לאסוף כ 3 מ"ל ממשק מעונן והעברה אל צינור חרוטי 15 מ"ל. בעקבות זאת, לדלל את התערובת עם 9 מ של HBSS כדי לסייע הסרה של המדיום הדרגתיות צפיפות.
- Centrifuge את צפיפות מדולל הדרגתיות לאטמוספרה בינוני, המכילות את התאים תאי ב 500 g x עבור 5 דק תשאף תגובת שיקוע resuspend עם מדיום הגידול 1 מ"ל (DMEM בתוספת 10% עוברית שור סרום ו 1% אנטיביוטיקה). בעקבות זאת, מכתים את התאים resuspended עם trypan blue ולבצע ספירת תאים באמצעות של haemocytometer.
3. מגנטי תא מופעל מיון
הערה: השלבים עוברות שינוי מפרוטוקול של היצרנים.
- Centrifuge תאי תאי שנאספו ב 300 גרם x 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את מדיום הגידול כפי זה יפריע הבידוד מגנטי. באמצעות ספירת באותו המתקבל שלב 2.8, nucleated resuspend-עונה 1 פרק 108 תאים למ"ל ב- PBS (Ca++ ו מ ג++ חינם) המכילה EDTA FBS ו- 1 מ מ 2%, בטווח נפח של 0.1-2.5 מ ל.
- להוסיף נפח מלא של תאים nucleated PBS מהשלב הקודם לרכבת התחתית התחתונה עגול פוליסטירן טריים 5 מ ל (12 x 75 מ מ). להוסיף 50 µL CD11b PE labelling מגיב לכל 1 מ של דגימה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות מוגן מפני אור.
- הוסף µL 70 של מבחר קוקטיילים (שילוב של נוגדנים חד-שבטיים כנגד CD11b ב- PBS) לכל 1 מ של דגימה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות מוגן מפני אור.
- מערבבים חלקיקים מגנטיים על-ידי pipetting למעלה ולמטה יותר מ 5 פעמים. להוסיף µL 50/mL המדגם. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות מוגן מפני אור.
הערה: חלקיקים אלה יוצרים מתחם tetrameric עם הנוגדנים ואז להיקשר אל העמודה מגנטי. - אם הנפח הכולל של תערובת התא הוא פחות מ 2.5 מ ל, המובילים אל אמצעי אחסון זה עם PBS (Ca++ ו מ ג++ חינם) המכיל 2% FBS ו- 1 מ מ EDTA ומערבבים על ידי בעדינות pipetting 2 - 3 פעמים. למקם את הצינור (ללא מכסה) לתוך המגנט, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- בתנועה רציפה אחת, היפוך מלא המגנט המכיל את צינור s 2-3, לשפוך את תגובת שיקוע. לחזור המגנט זקוף, הסר את הצינורית של המגנט. להכין לשטוף את התאים הנותרים מן העמודה.
הערה: תגובת שיקוע מכיל תאים unlabelled ולא רצויים, אשר יוסרו על ידי היפוך הצינור עדיין בזמן המגנט. הצינור מכיל את Cd11b המצורף+ תאים. - לשטוף את התאים על ידי וחזור על שלבים 3.5, 3.6 עוד פעמיים. אם המדגם גדול מ 1 מ"ל, נוספת אני חוזר של שלבים 3.5 ו- 3.6 מומלץ.
- Resuspend התאים מדיום הגידול הרצוי. לשטוף את הצד של אוסף כלי השיט גם כן (למשל. צינור 15 מ"ל) לאיסוף תאים ומהצדדים של הצינור של להגדיל את התשואות.
4. אימות של טוהר מיקרוגלייה
הערה: מיקרוגלייה העיקרי מבודד 3 L (n = סה כ 5 חיות) אומתו באמצעות פלורסנט תא מופעל מיון (FACS) כדי לקבוע טוהר עבור התוצאות נציג.
- התרבות התאים בקבוקון T-25 במצע הגידול המכיל 10% FBS לילה, זריעה על צפיפות של 1-2 x 106 תאים לכל את הבקבוק.
- לשטוף את התאים המבחנות T-25 עם PBS 3 x עבור 5 דקות כדי להסיר את כל התקשורת צמיחה הנותרים, אשר עשויים להפריע trypsinization.
- להוסיף 2 מ של 0.25% טריפסין להתנתק תאים מן המבחנות. ודא כי אמצעי האחסון של טריפסין מספיקה לכסות את המשטח כולו + בקבוקי שתייה צידניות. בעקבות עדין מתערבל + בקבוקי שתייה צידניות כדי להבטיח כיסוי אחיד של טריפסין, תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
- להרוות את תהליך trypsinization על-ידי הוספת 2 מ של צמיחה המדיה המכילה 10% FBS לתוך הבקבוק.
- לאסוף את תגובת שיקוע המכילות את התאים trypsinized ואת צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף תאים.
- הסר את תגובת שיקוע המכילות את מדיום הגידול ואת טריפסין, resuspend בגדר במאגר FACS 500 μL. לבצע את ספירת התאים באמצעות trypan blue.
- צנטריפוגה ב 500 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. לבצע Fc קולטן חסום על-ידי הוספת μL FACS מאגר 50 + 1 μL ה-FcR חוסם לכל 5 x 106 תאים. תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 º C.
הערה: הבלוק קולטן Fc היא שלב קריטי בהליך מכתימים כדי למנוע קשירה שאינם ספציפיים של immunoglobulins לקולטנים Fc אוכלוסיות תאים חיסוניים. מצור זה אינו משפיע על איגוד במורד הזרם של נוגדנים אחרים. - לסיים את תהליך חסימה על ידי דילול עם מאגר FACS μL 500. בעקבות זאת, centrifuge את התערובת המכילות את התאים ב g x 500 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend במאגר טריים 500 μL FACS.
- מניחים את רוב התאים (למשל אם resuspending תאי μL 500 FACS מאגר, μL שימוש 400) לתוך צינור מדגם. להפיץ את התאים הנותרים בין הצינורות שליטה, מובילים μL עד 100 למחזור בקרת (למשל עבור 6 שפורפרות הבקרה, לסבול 16.67 μL לתוך כל שפופרת שליטה ו- top 83.33 μL FACS מאגר). להפוך את הקבוצות (שפורפרות הבקרה באותיות מודגשות) כמו Unstained, יחיד צבעונית (CD45, CD11b), הכתם חי/מת בודד, FMOs, צינורות מדגם.
- גלולה התאים לכל הצינורות על ידי צריך שתוציאו ב g x 500 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
- כתם התאים בצינור עם נוגדנים μL 1 לכל מאגר FACS μL 100 לכל 5 x 106 תאים. תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C.
הערה: השתמש 50 קוקטייל נוגדן μL אם פחות מ 2 x 106 תאים משמשים. - לשטוף את התאים באמצעות מאגר FACS μL 500. Centrifuge התאים ב g x 500 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend התאים במאגר FACS 300 μL.
הערה: השתמש μl ~ 100 אם ספירת הדם היא פחות מ- 2 x 106. - באמצעות ניתוח cytometry זרימה, לכמת התאים הם CD45נמוך , חיובית עבור CD11b מכתים. אחוז זה מקביל מיקרוגלייה העיקרי מבודד.
5. נוגדן של ראשי מיקרוגלייה
- צלחת התאים צלחת 96-ובכן-צפיפות של תאים5 עונה 1 פרק 10 עם מדיום הגידול, דגירה בין לילה.
- הסר את תגובת שיקוע, לשטוף 3 פעמים עם PBS.
- לתקן את התאים paraformaldehyde 4% ב- PBS במשך 15 דקות להסיר כדורגלן עם פיפטה P1000 ולאחר מכן לשטוף אותם 3 פעמים עם PBS + 0.1% טריטון-X.
- בלוק לכריכה שאינם ספציפיים עם אלבומין שור 3% לשעה בטמפרטורת החדר.
- דגירה עם הארנב רשות השידור-1 (1: 100) במשך 24 שעות ביממה ב 4 º C. בעקבות זאת, הסר את התערובת נוגדן ראשוני, לשטוף 3 פעמים עם PBS.
- דגירה עם משני אנטי-ארנב GFP המספר המשלים (1:200) לשעה בטמפרטורת החדר. בעקבות זאת, הסר את התערובת נוגדנים משניים, לשטוף 3 פעמים עם PBS.
- הר שקופיות עם פלורסנט הרכבה בינונית, לכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
6. כימות מיקרוגלייה באמצעות pHrodo Assay
הערה: וזמינותו pHrodo מאפשר זיהוי של רמות של phagocytosis בתאים בתרבית. על ספיגת דרך אנדוציטוזה, הפנמה לסביבה חומצי יותר מגבירה את רמות של זריחה של conjugates bioparticle. לאחר מכן ניתן לכמת רמות קרינה פלואורסצנטית מאת FACS. השלבים הבאים הם ששינה מפרוטוקול של היצרנים.
- התרבות התאים בבקבוקון T-25 במצע הגידול בן-לילה זריעה על צפיפות של 1-2 x 106 תאים לכל את הבקבוק. לשטוף את התאים T-25 מבחנות עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
- ניתוק התאים באמצעות טריפסין 0.25% 2 מ"ל. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
- להרוות את תהליך trypsinisation על-ידי הוספת 2 מ של צמיחה המדיה המכילה 10% FBS לתוך הבקבוק.
- Centrifuge התליה תא ב g x 500 דקות 5-4 ° C עד הצניפה תאים.
- הסר את תגובת שיקוע, resuspend את גלולה המכילה את מיקרוגלייה ראשי תרבות בינוני-106 תאים למ"ל.
הערה: לחלופין, צלחת תאים בצלחת 96-ובכן לפחות יום לפני ולכוון עבור 1 x 105 התאים קיימא לכל טוב ביום וזמינותו נמצא שיבוצע. - צלחת תאים לתוך צלחת 96-ובכן-עונה 1 פרק 105 תאים/טוב, μL 100 לכל טוב. צלחת פקדים, בארות ניסיוני שהפקידים והשאר באר ריקה אחת לכל בקרת חיובי עבור חיסור רקע תאים ללא שליטה.
- להוסיף 100 μL של צמיחה מדיה הבארות נשאר ריק עבור חיסור רקע לא-התא.
הערה: כמו כל שאר במבחנה assay, הפקדים המתאימים הם חיוניים על הדיוק של הקריאות. לצד התא ללא שליטה (רקע קריאה), כוללים גם את הפקד שלילי טוב (המספר המשלים pHrodo נוסף, אך מניחים על הקרח). - לכסות את הצלחת ואת תקופת דגירה של h 1 באינקובטור עם 5% CO2 ב 37 º C.
- להכין בארות ניסיוני על-ידי הוספת ממריץ וטיפול. להוסיף פקדים הרכב (מדיה גדילה בלבד) וולס לא מטופל.
הערה: ליפופוליסכריד 1 µg/mL [ממריץ] ו תא האפיתל אנוש השפיר (hAEC)-מדיה ממוזגים [טיפול] שימשו כדי להפיק את התוצאות נציג. - הפשרת בקבוקון צבע מצומדת, להוסיף מאגר ספיגת 2 מ"ל, בקצרה מערבולת. להעביר את התוכן צינור לתוך שפופרת זכוכית נקי, sonicate במשך 5 דקות, כדי להבטיח כי חלקיקים מפוזרים באופן אחיד.
- האחות המדיום תרבות microplate בארות והחלף במהירות 100 μL של השעיה לצבוע. מכסה, דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
הערה: לזכור כתם הצינורות שליטה גם כן. - באמצעות ניתוח cytometry זרימה, לכמת תאים מכתים חיובית החרוזים pHrodo מצומדת ובהווה כאחוז (האב) של פעיל phagocytosing מיקרוגלייה.
7. כימות של אפופטוזיס מיקרוגלייה בעקבות עלבון דלקתיות
- חזור על השלבים 1-7 מהסעיף "אימות של מיקרוגלייה טוהר".
- מניחים את רוב התאים (למשל אם אתה resuspended תאי μL 500 FACS מאגר, μL שימוש 400) לתוך צינור מדגם. להפיץ את התאים הנותרים בין הצינורות שליטה, מובילים μL עד 100 למחזור שליטה (למשל עבור שפורפרות הבקרה 6, לסבול 16.67 μL לתוך כל שפופרת שליטה ו- top 83.33 μL FACS מאגר). קבוצות (שפורפרות הבקרה באותיות מודגשות): כתמים וללא רבב, יחיד (AnnexinV, Propidium יודיד), יחיד חי/מת הכתם, FMOs, דוגמת צינורות.
- גלולה התאים כל הצינורות על ידי צריך שתוציאו ב 500 g x במשך 5 דקות.
- דגירה עם 1 μL נוגדנים/100 μL FACS מאגר/5 x 106 תאים עבור 20 דקות ב 4 º C.
הערה: השתמש 50 μL אם פחות מ 2 x 106 תאים. - לשטוף את התאים על-ידי הוספת 500 μL FACS מאגר צנטריפוגה ב 500 g x במשך 5 דקות.
- Resuspend בגדר תא במאגר FACS 300 μL.
הערה: ~ 100 μL אם ספירת הדם היא פחות מ- 2 x 106. - לכמת תאים בתוך כל רביע (Q1: נמק, Q2: מוות מאוחר, Q3: מעשית, ש4: מוות מוקדם).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות השיטות המתוארות כאן, אוכלוסיות טהור של מיקרוגלייה ניתן לבודד והוא יכול להיות מוכן אפיון באמצעות במבחנה וניתוח FACS. כדי להתחיל עם, עד 18 בעלי חיים יכולים לשמש לכל cull, עם התשואה הצפויה של-450,000-600,000 microglial תאים. זה חיוני לאשר תחילה את הטוהר של תאים מבודדים, לעשות ניתוח FACS בוצע על ידי צביעת עבור שני הסמנים CD45 ו- CD11b. זיהוי של מיקרוגלייה יכול להוכיח בעייתי, כמו סמנים רבים לידי מיקרוגלייה מתבטאים גם על ידי מקרופאגים, ושימוש של שני סמנים אלה מאפשר כימות מדויק ואמין. באופן ספציפי, מיקרוגלייה יש ביטוי נמוך של CD45, לעומת הביטוי גבוהה ראה את מערכת העצבים המרכזית, ההיקפית מקרופאגים, והם גם חיובי עבור CD11b (איור 1). מן הבידוד מסוים, דווח על טוהר 89.3%. לאחר צביעת עבור CD11b, נציין כי מיקרוגלייה העיקרי שלנו חולקים תכונות מורפולוגיות דומות, עם מגוון של מורפולוגיות מ unramified במובהק (כדורית תא גוף גדול עם מעט או ללא תהליכים מורחבת) כדי כחוד יותר (עם קטן יותר, יותר somata אובל בדרך כלל עד הסדר משני תהליכים) מתאם לטווח של הברית הפעלה, כצפוי ויוו (איור 2).
בעקבות זאת, נוהלו שני מבחני אפיון עבור הפונקציה מיקרוגלייה והישרדות. מיקרוגלייה התא phagocytic העיקריים של מערכת העצבים, וזמינותו pHrodo מאפשר כימות של מלון פונקציונלי מסוים זה. עלייה 3-fold ליד phagocytic פונקציה לאחר 24 שעות ביממה תרבות משותפת עם hAEC ממוזגים בינוני (איור 3) צוין, כפי שהיא נמדדת כימות של חלקיקים pHrodo פלורסנט. לבסוף, AnnexinV-פיי מכתימים הבאים שיתוף תרבות בוצע לזהות את ההישרדות של מיקרוגלייה בעקבות עלבון דלקתיות. צמצום אפופטוזיס מיקרוגלייה לאחר טיפול ממוזגים בינונית (איור 4) נצפתה. ממצאים אלה מראים אותה מדיום hAEC ממוזגים מגן מיקרוגלייה ומגבירה את הפעילות שלהם phagocytic, אשר יכול להיות טיפול בהפרעות פציעה, neuroinflammatory המוח הלידה.
איור 1 : הביטוי של CD45 ו- CD11b על ידי מיקרוגלייה. כל נקודה מייצגת תא שכותרתה ומאפשר ניתוח FACS הבהרה של אוכלוסיות תאים נפרדים. מיקרוגלייה יש ביטוי התחתון של אנטיגן CD45 בהשוואה מקרופאגים נגזר מונוציט היקפיים והם חיובי עבור CD11b. המספרים שמתחת נוגדן תווית מציינים את הפרופורציה של תאים מגודרת המבוטא באחוזים מהאוכלוסייה האב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : המורפולוגיה של מבודדים מיקרוגלייה העיקרית. כפי שניתן לראות באיור זה, מיקרוגלייה שומרים על כדורי גוף התא שלהם ומבנה כחוד ברורים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר.
איור 3 : כימות של פונקציית phagocytic מבודדים מיקרוגלייה העיקרית. מתויג pHrodo חלקיקים לזרוח רק כאשר בסביבות חומצי, כגון endosomes הסלולר בעקבות phagocytosis. כאן, נצפית עלייה pHrodo ספיגת חלקיקים ב מיקרוגלייה שטופלו hAEC ממוזגים בינוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : ניתוח של מיקרוגלייה ההישרדות לאחר עלבון דלקתיים. (א) נציג FACS חלקות מיקרוגלייה מבודד. ההכתמה משולב של יודיד AnnexinV ו- propidium מאפשר categorisation לתוך תאים חיים או מוות, נמק, לאחר גירוי עם LPS. HAEC (B) ממוזגים בינוני אפופטוזיס מיקרוגלייה מופחתת באופן משמעותי ביחס פקדים, מציע סוג של הגנה על סוג תא זה. * מסמל p < 0.05, מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| לשטוף בינוני |
| הנשר בינוני המתואמת של גלוקוז נמוך Dulbecco |
| פניצילין v/v 1%-סטרפטומיצין |
| תקציר בינוני (לכל המוח) |
| 150 µL DNase אני |
| 100 µL פפאין (17U/mg מניות) |
| 3 מ"ל שטיפת בינוני |
| מדיום הגידול |
| הנשר בינוני המתואמת של גלוקוז נמוך Dulbecco |
| סרום שור בהריונות 10% |
| פניצילין v/v 1%-סטרפטומיצין |
טבלה 1: טבלה של פתרונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיקרוגלייה יש את היכולת להיות גם פרו - דלקתי, ששונו על-ידי סביבת גירויים. מחקרים קודמים הראו שמודולציה של הפעלת מיקרוגלייה יכול להתייעץ neuroprotection. היכולת שלהם לספק הגנה את הנוירונים ותיקון פציעה מחייבת מחקר נוסף כדי לקדם את ההבנה הנוכחית של תאים מורכבים אלה. לכן, בידוד של טוהר גבוהה מיקרוגלייה העיקרי הוא שיטת חשוב ושימושי. זוהי שיטה מהירה יחסית להשגת מיקרוגלייה הראשי מאוד טהור מוכן ניסויים במבחנה בתוך 2 ימי.
ישנם מגוון של פרוטוקולים המתוארים בספרות על בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר. האתגר העיקרי הוא לייצר ביעילות מספקת דוגמה, גבוה ב הכדאיות וטוהר. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא התשואה של מדגם מאוד טהור ללא צורך הזמן בתרבות. לכן, השיטה מתקצר מ 2 שבועות 2 ימים, זה מקל על תוצאות מהירות. השלבים אפיון תשואות פונקציונלי נתונים אודות מיקרוגלייה, שיפור ההבנה הנוכחית של תאים מורכבים אלה. הפרוטוקול משלב שתי גישות הנוכחי - צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות, הפרדה מגנטית. הפרדה מגנטית טוב אומתה בספרות עבור בידוד של מיקרוגלייה באופן עדין יחסית לעומת אחרים בידוד טכניקות14,15,16. בזמן ללא ספק יש שינויים לתכונות פונקציונליות של מיקרוגלייה העיקרי מבודד בהשוואה שלהם במדינת מקומיים ויוו, שינויים במאפייני מיקרוגלייה כפי שנצפתה על מבחני פיתח מעל מחושבים מתוך עיכול שלאחר בסיסית, וזאת גם כאלה רעיוני של אפנון ישיר של משנה זו המערכת החיסונית.
בעוד הפרוטוקול הוא פשוט למדי, טיפול במהלך השלבים הקריטיים יסייע להבטיח תשואה טובה. ראשית, חשוב להשתמש גלוקוז נמוך מדיה כדי לתמוך בצמיחה גליה. יתר על כן, המוח מאתר חייב להישמר קרח קר-בכל עת במהלך הבידוד. לפיכך, מומלץ מראש להירגע כל מדיום, כמו גם כלי נגינה במידת האפשר, בצע את ההליך על קרח. חשוב, החזקה בבידוד ממושך בבידוד פעמים להוביל עניים בריאות, תשואות, ולכן הוא קריטי כדי לעבוד במהירות. יתר על כן, ראוי ההסרה של השכבה של קרום המוח היא צעד מכריע בעת עבודה עם עכברים בוגרים, אחרת את fibroblasts לגבור וזאנה במונחים של צמיחה. במהלך העיכול אנזימטי של המוח, זה חשוב לא לחתוך את המוח לחתיכות קטנות יותר מדי כמו זה יכול להגביר מוות של תאים, באופן אידיאלי לשאוף 1 מ2 חתיכות רקמה. בעת טחינת הרקמה דרך מסננת התא, לשטוף ביסודיות עם מדיה כל כמה דקות כדי להבטיח כל התאים נשטפים, לא להילכד בתוך מסננת, בנוסף מומלץ להשתמש מסננת תא 100 μm, מסננים קטנים יותר להתבטא התשואה מופחת. עוד צעד קריטי הוא underlaying של 70% צפיפות צבע בינוני השכבה, ביצוע שלב זה בקפידה והוא לאט לאט על מנת להבטיח שלאטמוספרה ברורה נתפסת הוא חיוני, השימוש פיפטה פסטר מומלץ. בנוסף, השימוש של צינורות חרוט 15 mL מומלץ כמו הפרדת תאים היה פחות יעיל כאשר צינורות חרוט 50 מ ל נוצלו. לבסוף, צנטריפוגה הדרגתי צפיפות חייב להתבצע בטמפרטורת החדר, כאשר הטמפרטורה יכולה להשפיע על מעבר הצבע צפיפות.
פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה של ייצור התאים מאוד טהור מיקרוגלייה העיקרי כפי שמוצג על ידי ביטוי גבוהה של CD45 והן ביטוי חיובי של Cd11b (לעומת ביטוי CD45 נמוך אצל ומונוציטים היקפיים). תאים גם ניתן לבודד במהירות יחסית, ובכך יש לו את ההיקף להבנה משמעותית מוגברת של תאים אלה עכשיו, דונלד. זה יכול לשמש כדי לזהות אוכלוסיות שונות מיקרוגלייה מרקעים שונים, המאפשרות מחקרים אשר עלול לגלות הבדלים בין מיקרוגלייה מבודד חיות חולות/פצועים ובריאים. באמצעות בידוד של אוכלוסיה מיקרוגלייה טהור, אפנון טיפולית של אוכלוסייה זו תא החיסון יכול להיות מוערך. למשל, נמצא כי ממוזגים hAEC המדיה מוגברת phagocytosis, כמו גם שיפור הישרדות מיקרוגלייה בזמן גירוי דלקתי, ובכך מעניק יתרונות טיפולית17. זה בקורלציה מופחתת אפופטוטיים להיפגע פסולת, ובכך מרמז על סיווג של פסולת אלה יכול להיות neuroprotective השפעות.
ניתן להחיל את הפרוטוקול לעכברים neonatal או למבוגרים, עכברים בוגרים עם זאת יהיה לייצר תשואה מופחת. יתר על כן, זה עשוי להיות מותאם כדי לבודד האסטרוציטים העיקרי של עכברים neonatal או למבוגרים, שוב עכברים בוגרים יביא תשואה ירד. בנוסף, השינוי של השלב דיסוציאציה מכני עם רשת ניילון בהזמנה אישית עם המידות הגדולות יותר נקבובית לעומת 100 μm תא מסננת, עשוי לשפר עוד יותר את התשואה תא18.
מגבלות של פרוטוקול זה כוללים את התשואה נמוכה, את הזמן הנדרש עבור פרוטוקול זה. התשואה הוא כ- 150,000-200,000 תאים לכל cull של בעלי חיים 6, לעומת המיליונים זאת ניתן להשיג באמצעות שבועות של תרבית תאים. בנוסף, בעוד תאי ניתן להשיג בתוך יומיים, ההליך ביום הראשון הוא די זמן רב, לוקח כ-6 שעות.
עם זאת, שיטה זו היא כלי שימושי מאוד להבין את התפקיד של מיקרוגלייה במחלה, מסוגל לבודד characterising התאים בתוך יומיים. הוא מייצר תאים מיקרוגלייה העיקרי טוהר גבוהה, הקלת מחקר מדויק ויעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
