Summary
Una procedura è presentata per il ripiegamento del dominio legante dCACHE periplasmico ligando di Campylobacter jejuni del chemocettore Tlp3 da corpi di inclusione e la purificazione per produrre quantità di milligrammo di proteina.
Abstract
Identificazione di ligandi naturali dei chemocettori e studi strutturali mirati a delucidazione delle basi molecolari della specificità ligando può essere notevolmente facilitata mediante la produzione di quantità di milligrammo di domini di legame del ligando puro, piegato. Tentativi di heterologously express domini di legame del ligando periplasmico di chemocettori batteriche in Escherichia coli (Escherichia coli) spesso provocare mirati nei corpi di inclusione. Qui, un metodo è presentato per recupero di proteina da corpi di inclusione, suo ripiegamento e purificazione, utilizzando il dominio di legame del ligando dCACHE periplasmico di jejuni del campilobatterio (c. jejuni) del chemocettore Tlp3 come esempio. L'approccio implica espressione della proteina di interesse con un spaccabili sua6-tag, isolamento e urea-mediata solubilizzazione dei corpi di inclusione, proteina ripiegamento di esaurimento dell'urea e la purificazione mediante cromatografia di affinità seguita da cromatografia di rimozione e di esclusione dimensionale di tag. La spettroscopia di dicroismo circolare viene utilizzata per confermare il ripiegamento della proteina pura. È stato dimostrato che questo protocollo è in genere utile per la produzione di quantità di milligrammo di domini di legame ligando periplasmico dCACHE di altri chemocettori batteriche in forma solubile e cristallizzabili.
Introduction
Chemiotassi e motilità hanno dimostrati di svolgere i ruoli importanti nella patogenesi di jejuni del campilobatterio promuovendo la colonizzazione batterica e l'invasione dei host1,2,3. Chemiotassi permette ai batteri di muoversi verso un ambiente ottimale per la crescita, come guidati da segnali chimici. Questo processo prevede il riconoscimento dei segnali chimici intracellulari ed ambientale da un insieme di proteine chiamati chemocettori, o simil-trasduttore (TLP). Maggior parte dei chemocettori sono proteine di membrana incorporato con un extracitoplasmatico ligando (LBD), un dominio transmembrana e un dominio citoplasmatico segnalazione, il secondo dei quali interagisce con le proteine citosoliche di segnalamento che trasmettono il segnale di associazione per i motori flagellari4,5,6,7.
Undici diverse chemocettori sono state identificate nel genoma di c. jejuni 4,8. Ad oggi, solo alcuni di questi chemocettori sono stati caratterizzati e la specificità di ligandi di Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712e Tlp1113 è noto. Identificazione di ligandi naturali i chemocettori rimanenti in questa specie, e numerosi chemiorecettori in altri batteri, può essere notevolmente facilitata mediante la produzione di piegato e altamente puro del chemocettore ricombinante LBDs14, 15 , 16. Tuttavia, tentativi di heterologously express periplasmico LBDs di chemocettori batteriche in Escherichia coli spesso causare mirati in corpi di inclusione17,18,19 . Tuttavia, questo fenomeno può facilitare facile isolamento e ripristino della proteina in mano. Qui, un metodo è presentato per recupero di proteina da corpi di inclusione, suo ripiegamento e purificazione, utilizzando la LBD periplasmico del chemocettore c. jejuni Tlp3 come esempio. Questo esempio è stato scelto perché Tlp3-LBD appartiene alla famiglia dCACHE20 di telerilevamento domini che si trovano abbondantemente in due-componente istidina chinasi e chemocettori in procarioti20,21, 22 , 23.
In questo approccio, il costrutto di espressione, basato su un vettore di pET151/D-TOPO, è stato progettato per incorporare un N-terminale sua6-tag seguito da un tabacco etch sito di clivaggio della proteasi virus (TEV), per successivi tag rimozione19. Il protocollo descrive la sovraespressione della proteina in e. coli, isolamento e solubilizzazione urea-mediata di corpi di inclusione e di proteina ripiegamento da svuotamento di urea. Seguito di ripiegamento, il campione viene purificato mediante cromatografia di affinità, con cromatografia di rimozione e di esclusione dimensionale tag facoltativo. Il ripiegamento della proteina purificata è confermato usando la spettroscopia di dicroismo circolare. Si tratta di una versione modificata del metodo che è stato precedentemente sviluppato per recuperare e purificare la LBD di un diverso del chemocettore, Helicobacter pylori KMCO19. Questa procedura, riassunta nella Figura 1, produce 10-20 mg di puro, senza tag Tlp3-LBD per 1 L di coltura batterica, con una purezza di proteina di > 90% come valutato da SDS-PAGE.
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Protocol
1. espressione dei suoi6-Tlp3-LBD in e. coli
- Inoculare 150 mL di brodo di Luria-Bertani (LB) sterile contenente 50 µ g ampicillina di-1 mL con Plus-codone-BL21 (DE3) - cellule RIPL trasformate con il vettore di pET151/D-TOPO per l'espressione della sua6- Tlp3-LBD (residui dell'amminoacido 42-291), e Incubare a 37 ° C in un agitatore (diametro orbita, 25 mm) con 200 giri/min durante la notte.
- Preparare sei matracci di Erlenmeyer 2L contenente 800 mL di brodo LB sterile e 50 µ g mL-1 ampicillina. Inoculare ciascuna beuta con 20 mL della coltura durante la notte ottenuta dal punto 1.1. Li Incubare a 37 ° C con agitazione continua a 200 giri/min fino a quando la densità ottica a 600 nm raggiunge 0,6.
- Prendere un 1 mL aliquota da uno dei palloni (campione di controllo uninduced), pellet utilizzando una centrifuga da banco (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) e scartare il surnatante. Conservare il pellet batterico a-20 ° C per la successiva analisi di SDS-PAGE.
- Indurre l'espressione della proteina aggiungendo 1 mM di isopropile β-D-thiogalactoside (IPTG) per ciascuna beuta con la cultura. Continuano le beute a 37 ° C in un agitatore a 200 giri/min per ulteriori 4 h di incubazione.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 5.000 x g per 15 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
Nota: A questo punto, la procedura può essere sospesa inserendo il pellet cellulare in un congelatore-80 ° C per la conservazione.
2. isolamento e denaturazione dei corpi di inclusione
- Trasferire tutti i pellet cellulare ottenuti al passaggio 1.5 in un becher da 250 mL e aggiungere 100 mL di tampone A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). Permettono alle cellule di scongelare completamente (se congelati) e risospendere il pellet. Mantenere il campione sul ghiaccio a meno che non diversamente indicato.
- Passare tre volte le cellule sedimento attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione per lisare le cellule e garantire la tosatura completa del DNA genomic.
- Centrifugare il lisato a 10.000 x g per 15 min a 4 ° C. Raccogliere un campione di 1 mL del surnatante (frazione solubile) e conservare a-20 ° C per la successiva analisi di SDS-PAGE. Scartare il resto del surnatante e mettere la pallina sul ghiaccio.
Nota: Questa pallina è di colore bianco (facilmente distinguibili dalle cellule ininterrotte che sono colore marrone a colori) e contiene i corpi di inclusione. - Risospendere il pellet di corpi di inclusione accuratamente in 20 mL di tampone ghiacciata B (10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 0,2 mM fenilmetanosolfonil fluoruro (PMSF), 1% Triton X-100). Questo facilita la solubilizzazione della membrana e proteine di membrana. Vortexare per 1-2 min aiutare la risospensione.
- Centrifugare il campione a 10.000 x g per 15 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
- Risospendere accuratamente in 20 mL di tampone ghiacciata B nel Vortex il tubo per 1-2 min. Accertarsi che il pellet è suddiviso in piccoli pezzi. Dispensare il campione su e giù per aiutare la risospensione del pellet.
Nota: È importante Risospendere accuratamente per ottenere corpi di inclusione esenti da impurità. - Ripetere il punto 2.5. Se il supernatante è torbida o colorata, ripetere i passaggi da 2.6 e 2.5 (in questo ordine) fino a quando il surnatante è limpida e incolore.
- Risospendere il pellet in 20 mL di tampone ghiacciata C (10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 0,2 mM PMSF) nel Vortex il tubo per 1-2 min.
- Ripetere il punto 2.5.
- Aggiungere 25 mL di tampone di denaturazione ghiacciata D (10 mM Tris-HCl pH 8.0, urea 8 M, 10 mM dithiothreitol (DTT), 0,2 mM PMSF) per sciogliere il precipitato di corpi di inclusione. Risospendere accuratamente nel Vortex per 1-2 minuti, o fino a quando la pallina è rotto in piccoli pezzi.
- Mescolare la sospensione di rotazione assiale con un tasso di rotazione di 30 rpm per 30-120 min a 4 ° C.
- Chiarire la soluzione di proteina denaturata mediante centrifugazione a 30.000 x g, 4 ° C per 30 minuti, mettere il sopranatante sul ghiaccio e scartare il pellet.
- Misurare la concentrazione di proteina usando l'analisi di Bradford. 24 prendere un'aliquota per l'analisi del gel di SDS e metterlo a-20 ° C.
Nota: A questo punto, la procedura può essere messo in pausa il campione aliquotato snap-congelamento in azoto liquido e tenerlo a-80 ° C per la conservazione.
3. proteine ripiegamento
- Preparare 250 mL di tampone E (3M urea, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, monocloridrato di L-arginina di 0,4 M, 20 mM ridotto L-glutatione, L-glutatione ossidato mM 2) in un becher da mL 500 e raffreddare il buffer fino a 4 ° C.
- Aggiungere 60 mg di miscela di proteine denaturate contenente il suo6-Tlp3-LBD ottenuta al passaggio 2.13 a 250 mL di tampone E, mescolando il buffer a 500 giri/min. Incubare il refolding mix a 4 ° C con agitazione continua a 500 giri/min per 24-48 h. La concentrazione finale di proteine in questo passaggio è di 0,2 mg mL-1.
- Preparare 7 L di tampone A in un secchio di 8-10 L e raffreddarlo fino a 4 ° C in preparazione per il prossimo passo (punto 3.4) che avrà luogo in 24-48 h (Vedi il diagramma di flusso nella Figura 1).
- Immergere un pezzo di tubatura di dialisi di 28 mm di diametro gonfiato, con peso molecolare di interruzione a 12-14 kDa in 200 mL di 10 mM etilendiamminotetracetico sale disodico dell'acido (EDTA-Na2) ~ 50 cm e calore sopra una fiamma di gas fino a ebollizione. Risciacquare la membrana di dialisi con 200 mL di ddH2O.
- Bloccare un'estremità della membrana di dialisi con una chiusura di tubatura di dialisi e trasferire i 250 mL ripiegamento miscela ottenuta al passaggio 3.2 nel tubo di dialisi. Chiudere l'estremità aperta con un altro morsetto. Verificare l'integrità della membrana affinché che non vi siano perdite.
- Posizionare il tubo di dialisi in un secchio di dialisi con il pre-raffreddata 7 L di tampone A preparata al punto 3.3. Posizionare un ancoretta magnetica, assicurando che non toccherà la tubatura di dialisi continuando a mescolare.
- Dialyse il campione a 4 ° C con continua agitazione a 500 giri/min e modificare il buffer almeno quattro volte in un periodo di 12 h. Dopo l'ultima modifica di buffer, lasciare il campione per dialyse durante la notte.
Nota: Durante la dialisi, l'eccesso di urea (~ 3 M) viene gradualmente rimosso dalla soluzione proteina denaturata, che la proteina permette di ripiegare. Precipitazione della proteina pesante può essere osservato alla fine della dialisi. - Rimuovere il tubo di dialisi dal secchio e trasferire il contenuto in un becher da mL 500. Tenere la soluzione della proteina sul ghiaccio, a meno che non diversamente indicato.
- Filtrare la soluzione della proteina attraverso una membrana di dimensione del poro 0,43 µm in una bottiglia di vetro da 500 mL per rimuovere qualsiasi proteina precipitata.
4. la purificazione della sua6-etichetta della proteina mediante cromatografia di affinità immobilizzata dello ione del metallo
-
Carica ed equilibrare una colonna chelante preconfezionato da 5 mL.
- Collegare la colonna ad una pompa peristaltica, assicurando che non c'è nessuna aria intrappolata nel tubo di collegamento.
- Lavare la colonna facendo passare attraverso 25-50 mL di ddH2O.
- Caricare la colonna caricando 3 mL di 0.1 M Burundi2 e poi passando per 25 mL di ddH2O.
- Equilibrare la colonna con 25 mL di tampone F (buffer di caricamento, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazolo 20 mM).
- Regolare il campione di proteina ripiegata ottenuto al passaggio 3.9 alla composizione del buffer F con l'aggiunta di 2,5 mL di 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL di NaCl di M 5 e 2,5 mL delle soluzioni madre di imidazolo di 2 M.
- Caricare il campione sulla colonna a un tasso di 5 mL/min o meno e scartare il flusso continuo (proteine non associati).
- Lavare la colonna con 50-100 mL di tampone F per rimuovere le proteine non specifico associati e scartare il flusso continuo.
- Eluire il suo6-Tlp3-LBD con 25 mL di tampone G (tampone di eluizione, 20 mM Tris-HCl, NaCl, imidazolo 500 mM 500 mM) e le frazioni di scorrimento contenenti la proteina (come determinato usando il reagente di Bradford) della piscina.
- Misurare la concentrazione di proteine nel campione usando l'analisi di Bradford. Prendere una piccola aliquota di analisi SDS-PAGE e posto a-20 ° C.
5. il suo6-tag Removal utilizzando TEV proteasi (opzionale)
- Preparare e raffreddare fino a 4 ° C, 4 L di tampone H (buffer di clivaggio TEV, 10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glicerolo, 2 mM DTT).
- Tagliare circa 5-7 cm di tubatura di dialisi (diametro 2-3 cm) e immergerla in 200 mL di ddH2O.
- Aggiungere il suo6-etichetta della proteasi TEV alla sua6-proteina tag preparata al punto 4.5 per un finale rapporto molare 1 TEV: proteine 8.
- Fissare un'estremità del tubo con una chiusura di tubatura di dialisi e riempirlo con la miscela di proteasi della proteina/TEV. Chiudere l'altra estremità e garantire che non vi siano perdite.
- Posto la dialisi tubicino nel pre-raffreddata 4 L di tampone H (dal punto 5.1) e viene quindi incubato a 4 ° C con continuo mescolando per 2 h. cambiamento il buffer e continuare la dialisi durante la notte per permettere la reazione di clivaggio mediata di TEV completare.
- Nel frattempo, preparare e cool (4 ° C) 4 L di tampone ho (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glicerolo) in preparazione per il giorno successivo.
- Dopo la dialisi durante la notte, scambiare il buffer buffer che ho preparato nel passaggio 5.6 e dialyse per un'ulteriore 1-2 ore a 4 ° C.
- Togliere il tubo dal secchio dialisi, sganciare un'estremità del tubo e la soluzione della proteina di trasferimento a un 50 mL tubo Falcon. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di siringa 0,43 µm dimensione dei pori e tenerlo sul ghiaccio, se non diversamente specificato.
- Misurare il volume del campione e regolare la concentrazione di Tris, NaCl e imidazolo alla composizione del buffer F (ad es. per 25 mL della soluzione di proteina nel buffer J aggiungere 0,25 mL di 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL di 5 M di NaCl e 0,25 mL di imidazolo 2 M).
- Preparare una colonna HiTrap chelanti HP 5ml come descritto al punto 4.1.
- Caricare il campione sulla colonna (portata: 5 mL/min) e raccogliere il flusso continuo, che contiene il tag Tlp3-LBD (residui 42-291). ApoAlert proteina, il fenduti sua6-tag e sua6- TEV vengono mantenute dalla colonna.
- Lavare la colonna con 5 mL di tampone F (buffer di caricamento) per consentire tutte le proteine senza tag fluire attraverso e raccogliere l'eluato.
- Piscina l'eluato ottenuto nei passaggi 5.11 e 5.12 e misura la concentrazione di proteina. Prendere una piccola aliquotare e conservare a-20 ° C per l'analisi SDS-PAGE.
6. dimensione-exclusion Chromatography (Gel filtrazione) di Tlp3-LBD
- Preparare 1 L di tampone A (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) e filtrarli utilizzando una membrana 0,43 µm.
- Equilibrare una colonna di esclusione dimensionale 26/60 con tampone A una portata di 4 mL/min.
- Concentrare il campione proteico ottenuto nel passaggio 5.13 a un volume di 3-4 mL utilizzando concentratore centrifugo 15ml con un 10 kDa cut-off (4 ° C, 4.000 x g).
- Chiarire la soluzione della proteina mediante centrifugazione a 13.000 x g, 4 ° C per 30 min rimuovere qualsiasi proteina precipitata.
- Caricare il campione sulla colonna di filtrazione 26/60 gel pre-equilibrato. Eseguire cromatografia in tampone A una portata di 4 mL/min Monitor traccia UV. Tlp3-LBD eluisce ad un volume di ritenzione di 210-220 mL. Piscina le frazioni di picco.
- Misurare la concentrazione di proteina. Prendere una piccola aliquota per analisi SDS-PAGE.
7. SDS-PAGE analisi dei campioni raccolti nelle varie fasi di purificazione della proteina
- Preparare 1 L di buffer di esecuzione SDS-PAGE (buffer J), contenente 25 mM Tris, 250 mM glicina pH 8.3 e 0,1% (p/v) sodio dodecil solfato (SDS).
- Preparare 10 mL di tampone di caricamento SDS-PAGE (buffer KB): 5x, contenente 0,25 M Tris-HCl pH 6.8, SDS 10% (p/v), 50% (v/v) glicerolo, 1 millimetro DTT e 0.05% bromofenolo Blu.
- Consentire le aliquote raccolte durante le varie fasi della purificazione (punti 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) a scongelare.
- Per ogni campione, mescolare il volume corrispondente a 15 µ g di proteine totali con 2 µ l di 5x SDS-PAGE di caricamento del buffer e regola il volume a 10 µ l con ddH2O.
- Riscaldare i campioni a 95 ° C per 5-10 min, li spin a 10.000 x g per 30 s e trasferire i campioni in una provetta pulita.
- Preparare un gel di SDS-PAGE, utilizzando 15% poliacrilammide gel di separazione (per 5 mL: 2,5 mL 30% (p/v) bis-acrilammide, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 1,2 mL ddH2O, 50 µ l 10% (p/v) SDS, 50 µ l 20% (p/v) ammonio persolfato (APS), 3 µ l tetrametiletilendiammina (TEMED) e 5% poliacrilammide gel di impilamento (per mL: 340 2 µ l 30% (p/v) bis-acrilammide, 250 µ l di 1 M Tris pH 6.8, 1,37 mL ddH2O, 20 µ l 10% (p/v) SDS, 20 µ l 20% (p/v) APS, 2 µ l TEMED).
- Montare l'apparecchiatura di elettroforesi e riempirlo con 1x SDS page tampone secondo la raccomandazione del produttore di corsa.
- Caricare un marcatore di peso molecolare della proteina ed i campioni preparati al punto 7.5. Eseguire l'elettroforesi a una corrente costante di 25 mA.
- Trasferire il gel in un contenitore e risciacquare con ddH2O. aggiungere 150 mL di macchiatura soluzione contenente 25% (v/v) isopropanolo, acido acetico 10% (v/v) e 0,03% (p/v) Brilliant Blue R-250 il blu di Coomassie. Posizionare il contenitore su una piattaforma di rotazione orizzontale per 30 min a temperatura ambiente.
- Lavare il gel con ddH2O e posizionarli nella soluzione decolorante contenente 5% (v/v) metanolo e acido acetico 7% (v/v). Decolorare, mescolando utilizzando una piattaforma di rotazione orizzontale per 1 h.
- Il gel di immagine e analizzare.
8. analisi spettroscopia dicroismo (CD) circolare del struttura secondaria della proteina pura ripiegata
- Trasferire 0,5 - 1 mg di proteina ripiegata ottenuta nel passaggio 6.6 in un tubo di dialisi e metterlo in un secchio di dialisi contenenti 5 L di tampone L (50 mM sodio fosfato pH 7,4), preraffreddata a 4 ° C. Dialyse il campione a 4 ° C con agitazione continua ed eseguire modifiche di buffer di almeno 3-4 oltre 2-4 h prima di lasciare il campione per dialyse durante la notte.
- Concentrare la soluzione della proteina dializzati a 0,06 mg mL-1 utilizzando un concentratore centrifugo del cut-off di 10 kDa.
- Chiarire la soluzione mediante centrifugazione a 13.000 x g, 4 ° C per 30 min.
- Registrare lo spettro di CD lontano-UV del campione a 25 ° C in un intervallo di lunghezza d'onda di 200-260 nm utilizzando un spectropolarimeter con una velocità di scansione di 20 nm min-1. Utilizzare il buffer di dialisi come un controllo vuoto. Ripetere la registrazione in triplice copia e generare lo spettro di una media.
- Calcolare il contenuto di struttura secondaria di deconvoluting CD spettri utilizzando il programma di CDSSTR dalla DichroWeb sever25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).
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Representative Results
L'espressione ricombinante di suo6-Tlp3-LBD dentro e. coli ha provocato la deposizione di proteine in corpi di inclusione. La resa di espressione da 1 L di coltura batterica calcolata al punto 2.13 era circa 100 mg di sua6-Tlp3-LBD depositato in corpi di inclusione. La procedura di isolamento di proteine, qui descritta e illustrata in Figura 1, è costituito dalla solubilizzazione dei corpi di inclusione, il ripiegamento proteico e la purificazione, mediante cromatografia di affinità, la rimozione di tag e la cromatografia di esclusione dimensionale e produce 10-20 mg di puro, senza tag Tlp3-LBD per 1 L di coltura batterica.
La proteina eluita dalla colonna di gel-filtrazione come picco singolo, simmetrico corrispondente ad un volume di ritenzione di 220 mL (Figura 2A). Calcolo del peso molecolare (MW) utilizzando un diagramma di taratura del log (MW) rispetto al volume di ritenzione (Vritenzione (mL) = 549,3-73,9 x log(MW)) disponibili sul sito dell'espressione della proteina di EMBL e purificazione Core Facility (http://www.embl.de/ pepcore/pepcore_services/protein_purification/Chromatography/hiload26-0_superdex200/index.html), ha reso il valore di 29 kDa. Questo valore è stato molto vicino a quello calcolato dalla sequenza dell'amminoacido (28,7 kDa), che ha suggerito che Tlp3-LBD è un monomero in soluzione.
Per valutare il processo di purificazione, campioni raccolti a diversi passi sono stati valutati usando analisi di SDS-PAGE. Come illustrato nella Figura 2B, corpi di inclusione contenuto prevalentemente sua6-Tlp3-LBD. Piccole quantità di questa proteina erano anche presenti nella frazione solubile della cultura indotta (IPTG(+)) e nella cultura uninduced (IPTG(-)) – a quanto pare come risultato dell'espressione colante della polimerasi T7. Suoi6-Tlp3-LBD migrati su gel di poliacrilammide con un peso molecolare apparente di 28 kDa, che è vicino al valore calcolato dalla sequenza dell'amminoacido (31,8 kDa). Il suo6-tag rimozione, cromatografia di affinità e passaggi di filtrazione ha reso altamente pura proteina del gel (> 90% elettroforetica omogeneità).
Per confermare che la proteina ottenuta da questa procedura era piegato, la struttura secondaria della sua6-Tlp3-LBD è stata valutata dalla spettroscopia CD. Stima del α-elica e β-foglio contenuto dallo spettro CD (Figura 3) utilizzando CDSSTR ha dato valori di β α e 23% 31%. Questi valori sono vicini quelle predette dall'analisi di sequenza utilizzando il server di Jpred3 (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (37% α e 26% β), che indica che la proteina ha recuperata dai corpi di inclusione di urea-denaturato è stata piegata.
Figura 1: schema del metodo presentato. Ricombinante sua6-Tlp3-LBD è Lakers in e. coli dopo induzione con IPTG (Vedi sezione 1). Dopo espressione 4h, cellule batteriche vengono raccolte e lisate (Vedi sezione 2). La frazione insolubile contenenti i corpi di inclusione (IB) viene lavata per la rimozione della membrana e le impurità di proteine di membrana, dopo di che il IB sono dissolti in un tampone contenente urea ad alta concentrazione (Vedi sezione 2). Suoi6-Tlp3-LBD è ripiegato di diluizione nel buffer E seguita da dialisi esaustivo per la rimozione graduale dell'urea (sezione 3). Riavvolgerlo sua6-Tlp3-LBD è poi purificato mediante cromatografia di affinità immobilizzata dello ione del metallo come descritto nella sezione 4. Il suo6-tag viene rimosso utilizzando proteasi TEV (sezione 5). Senza tag Tlp3-LBD è concentrata e ulteriormente purificato mediante cromatografia di gel filtrazione (sezione 6). Punti per la raccolta di campioni per analisi SDS-PAGE sono indicati con *. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: purificazione del ricombinante Tlp3-LBD. (A) traccia di cromatografia esclusione dimensionale di senza tag Tlp3-LBD su una colonna di Superdex 200 HiLoad 26/60 gel filtrazione. Le proteine eluite con un volume di ritenzione di 220 mL. (B) ridotto 15% gel di SDS-PAGE Coomassie blu-macchiato. M: marcatore di peso molecolare della proteina; IPTG (-): uninduced controllo campione raccolto al punto 1.3; IPTG (+): frazione solubile dopo induzione di IPTG (raccolti nel passaggio 2.3); IB: isolato i corpi di inclusione (passo 2.13); Riavvolgerlo sua6-Tlp3-LBD: campione della proteina ripiegata dal passaggio 4,6; Senza tag Tlp3-LBD: campione della proteina ottenuta al passaggio 5.13; Gel filtrazione 1 e 2: due frazioni dal picco della proteina eluiti dalla colonna di gel-filtrazione (punto 6.6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: spettro di dicroismo circolare di purificato ricombinante Tlp3-LBD. Lo spettro è stato registrato a 25 ° C in 50 mM sodio fosfato pH 7,4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Una procedura semplice per espressione e ripiegamento dai corpi di inclusione di LBD periplasmico della chemoreceptor batterica Tlp3 è presentata. Preparazione della proteina pura coinvolge sovra-espressione del gene codificato con animali-plasmide in Escherichia coli, la purificazione e la solubilizzazione dei corpi di inclusione, di ripiegamento della proteina denaturata e sua purificazione di affinità consecutivi e passaggi di cromatografia di esclusione dimensionale. La denaturazione dell'urea-facilitato e diluizione/dialisi-mediata ripiegamento sono i passaggi critici nel protocollo, ottimizzazione di cui spesso è necessaria per garantire la corretta rinaturazione della proteina depositata in corpi di inclusione26.
Ripiegamento di Tlp3-LBD è stata realizzata in maniera in due fasi, prima diluendo il campione denaturato in un tampone contenente urea e quindi dialysing il campione contro un tampone privo di esso. La proteina ripiegata ottenuta usando questo protocollo era funzionale e cristallizzabili18,23. Tuttavia, il metodo presentato presenta alcune limitazioni. È noto che carbamilazione dei gruppi amminici si verifica spesso quando la proteina è denaturata e riavvolgerlo in presenza di urea27,28,29. Questo è dovuto al fatto che l'urea disciolto si decompone con il tempo e produce cianato30 che reagisce con i gruppi amminici di proteine per formare un prodotto stabile carbamilata e, in misura minore, con altri gruppi funzionali31, 32. la decomposizione dell'urea è accelerata in condizioni di elevata temperatura e pH alcalino. Così, si consiglia di rendere soluzioni di urea fresca da ultrapura (> 99%) reagente solido ed eseguire le operazioni di ripiegamento/dialisi a bassa temperatura (4 ° C)30,33, per diminuire la formazione di cianato. Inoltre, scegliendo il buffer contenente ammine primarie, quali Tris, glicina o bicarbonato di ammonio, per il mix di refolding è importante per consentire lo scavenging del prodotto cianato29,33. Altra opzione consiste nell'utilizzare guanidina invece di urea, guanidina non è stata segnalata per modificare chimicamente proteine.
Oltre a urea, un agente riducente (DTT o β-mercaptoetanolo) è spesso necessaria per solubilizzare i corpi di inclusione e per evitare di non-nativi intra - e intermolecolare bisolfuro obbligazioni formazione mantenendo i residui di cisteina nel loro stato ridotto26 ,34. Tlp3-LBD ha un legame disolfuro intramolecolari e in questo protocollo, 10 mM DTT è stato incorporato nel buffer di denaturazione di corpi di inclusione (punto 2.10) per aiutare la risospensione delle proteine insolubili. Concentrazione di DTT è stato quindi ridotto ~ 100 piega diluendo il campione nella proteina ripiegamento buffer, seguita dal passo di dialisi per rimuovere gradualmente tutti i DTT. È importante notare che l'applicazione di questa procedura per il ripiegamento delle proteine con più ponti disolfuro può avere bisogno di ottimizzazione della concentrazione di ossidanti e riducenti (ad es. ossidato e ridotto il glutatione (GSH/GSSH) GSSH/DTT, cistamina/cysteamineor cistina/cisteina) per promuovere un'adeguata formazione di solfuro di ponti34,35. Inoltre, se la proteina di interesse è spaiati cisteine che non sono coinvolti nella formazione di legami disolfuro, un agente riduttore dovrebbe aggiungersi ai tutti i buffer di purificazione. Stima dei potenziali ponti disolfuro dalla sequenza dell'amminoacido di una proteina può essere eseguita utilizzando diversi strumenti in silico (ad es. cys_rec: http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& sottogruppo = propt).
L'uso del protocollo presentato per la purificazione delle proteine differenti è anche probabile che richiedono ottimizzazione della concentrazione di imidazolo durante la fase di lavaggio 4.4. Come indicato nella Figura 2B (lane etichettati IB), i corpi di inclusione isolati contenute principalmente, in questo caso, la proteina di interesse. Se ulteriori bande significativi sono visibili su SDS PAGE gel del campione IB, aumentando la concentrazione di imidazolo nel passaggio 4.4 sarà necessario rimuovere i contaminanti, ma potrebbe ridurre proteina resa36,37. Altra opzione è di applicare una sfumatura lineare di concentrazione dell'imidazolo e piscina le frazioni eluite contenenti la proteina di interesse.
Il passaggio finale nella purificazione, cromatografia di esclusione dimensionale, fornisce i mezzi per valutare la massa molecolare delle particelle eluite e derivare lo stato oligomerico della proteina contemporaneamente. Tuttavia, stima della massa molecolare di cromatografia di esclusione dimensionale solo è accurato per molecole sferiche, che non è il caso per molti proteine38,39. Si può determinare la proteina massa molecolare e stato oligomerico con maggiore accuratezza mediante cromatografia di esclusione dimensionale accoppiata alla dispersione della luce multi-angolo (SEC-MALS)40 o ultracentrifugazione analitica41. In precedenza abbiamo confermato che Tlp3-LBD è monomerico in soluzione mediante l'utilizzo di analisi SEC-MALS23, e questo risultato è coerente con le relazioni su altri dCACHE LBDs42,43.
Il protocollo presentato, nella sua forma originale o leggermente modificata, è stato utilizzato per ripiegare e purificare diversi del chemocettore LBDs dalla famiglia dCACHE per raggi x studi cristallografici17,18,19, 23 , 42 , 44. questa procedura può essere utile in genere per la produzione di quantità di milligrammo di periplasmico LBDs di altri chemocettori batteriche in forma solubile e cristallizzabili. In ogni caso separata, ottimizzazione dei protocolli è probabilmente necessaria. Oltre ai punti discussi sopra, ottimale solubilizzazione dei corpi di inclusione e ripiegamento di proteine può richiedere l'uso di detergenti (per es. SDS o del N-acetile trimetil ammonio cloruro), additivi (ad es. : L-arginina) e regolazione del loro tempo di concentrazione e incubazione in individuo ripiegamento passaggi26,34,45,46. Inoltre, la concentrazione di proteine nel passaggio refolding influenza in modo significativo il rendimento refolding. L'intervallo di concentrazioni da 1 ng mL-1 da mg 10 mL-1 generalmente deve essere testato. Per Tlp3-LBD, la concentrazione ottimale di proteine nel refolding mix era 0,2 mg mL-1.
Estremamente bassa resa refolding di solito è un segno che le condizioni di refolding prova sono tutt'altro che ottimale. Ci si può aspettare che ad alto rendimento è coerenza con una proteina piegata, che possa essere convalidata tramite spettroscopia CD (come descritto in questa procedura). Inoltre, crystallisability della proteina risultante può sugguest stato piegato della proteina. In alternativa, un'analisi funzionale (se disponibile) può essere utilizzata per confermare che la proteina è piegata. Nel caso di Tlp3-LBD, ad esempio, la proteina ripiegata è stata indicata per mantenere la sua capacità di ligand-legantesi, come indicato tramite calorimetria isotermica. 23
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Disclosures
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo Yu C. Liu per i suoi primi lavori sulla produzione Tlp3-LBD. Mayra A. Machuca è in debito con Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS per una borsa di dottorato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ - C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
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