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Biochemistry

Procédé de repliement efficace et la Purification des chémorécepteurs Ligand Binding Domain

Published: December 12, 2017 doi: 10.3791/57092
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology, Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

Summary

Une procédure est présentée pour le repliement de la domaine de liaison du ligand périplasmique dCACHE de Campylobacter jejuni zone chémoréceptrice Tlp3 de corps d’inclusion et de la purification pour produire des quantités de milligramme de protéine.

Abstract

Identification des ligands naturels des chémorécepteurs et études structurelles visant à élucider les bases moléculaires de la spécificité de ligand peut être grandement facilitée par la production de quantités de milligramme de domaines de liaison du ligand pur, plié. Tentatives de façon hétérologue express domaines de liaison du ligand périplasmique de chémorécepteurs bactériennes Escherichia coli (Escherichia coli) souvent entraîner leur ciblage dans les corps d’inclusion. Ici, on présente une méthode pour la récupération de la protéine de corps d’inclusion, son repliement et la purification, le domaine de liaison du ligand dCACHE périplasmique de Campylobacter jejuni (c. jejuni) zone chémoréceptrice Tlp3 en prenant comme exemple. L’approche implique l’expression de la protéine d’intérêt avec un CLIVABLES son6-tag, l’isolement et induite par l’urée solubilisation des corps d’inclusion, protéine de repliement de l’appauvrissement de l’urée et de purification par chromatographie d’affinité, suivi par chromatographie d’enlèvement et d’exclusion stérique tag. La spectroscopie de dichroïsme circulaire est utilisée pour confirmer l’état plié de la protéine pure. Il a été démontré que ce protocole est généralement utile pour la production de quantités de milligramme de domaines de liaison du ligand périplasmique dCACHE des autres chémorécepteurs bactériennes sous forme soluble et cristallisable.

Introduction

Le chimiotactisme et la motilité ont démontré que jouent un rôle important dans la pathogenèse de Campylobacter jejuni en favorisant la colonisation bactérienne et l’invasion de l’hôte1,2,3. Chimiotaxie permet aux bactéries de s’orienter vers un environnement optimal pour la croissance, que guidés par des signaux chimiques. Ce processus implique la reconnaissance de signaux chimiques intracellulaires et de l’environnement par un ensemble de protéines appelées chémorécepteurs, ou protéines de type transducteur (PLT). La plupart des chémorécepteurs sont des protéines membranaires incorporées avec un ligand extracytoplasmique contraignant (LBD), un domaine transmembranaire et un domaine cytoplasmique de signalisation, laquelle interagit avec les protéines de signalisation cytosoliques qui transmettent le signal pour les moteurs flagellaires4,5,6,7.

Onze des chémorécepteurs différentes ont été identifiées le génome de c. jejuni 4,8. À ce jour, seuls certains de ces chémorécepteurs ont été caractérisées et la spécificité de ligand de Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712et13 de la Tlp11 est connue. Identification des ligands naturels les chimiorécepteurs restants chez cette espèce, et nombreux chémorécepteurs chez d’autres bactéries, peut être grandement facilitée par la production de la zone chémoréceptrice recombinant plissée et très pure LBDs14, 15 , 16. Toutefois, tentatives de façon hétérologue express périplasmiques LBDs des chémorécepteurs bactériennes Escherichia coli souvent entraîner leur ciblage en inclusions17,18,19 . Néanmoins, ce phénomène peut faciliter isolement facile et récupération de la protéine dans la main. Ici, on présente une méthode pour la récupération des protéines du corps d’inclusion, son repliement et la purification, à l’aide de la LBD périplasmique de la zone chémoréceptrice de c. jejuni Tlp3 à titre d’exemple. Cet exemple a été choisi car Tlp3-LBD appartient à la famille dCACHE20 de télédétection des domaines que l'on retrouve abondamment dans deux composants histidine kinases et de chémorécepteurs dans prokaryotes20,21, 22 , 23.

Dans cette approche, la construction de l’expression, basée sur un vecteur pET151/D-TOPO, a été conçue pour incorporer un N-terminal son6-tag suivie d’un tabac etch site de clivage de protéase de virus (TEV), pour tag ultérieures enlèvement19. Le protocole décrit la surexpression de la protéine dans e. coli, l’isolement et induite par l’urée solubilisation des corps d’inclusion et protéine de repliement de l’appauvrissement de l’urée. Suite de repliement, l’échantillon est purifié par chromatographie d’affinité, avec chromatographie d’enlèvement et d’exclusion stérique balise facultative. L’état plié de la protéine purifiée est confirmé en utilisant la spectroscopie de dichroïsme circulaire. Il s’agit d’une version modifiée de la méthode qui a été développée pour récupérer et épurer le LBD d’une autre zone chémoréceptrice, Helicobacter pylori TlpC19. Cette procédure, résumée dans la Figure 1, donne 10-20 mg de pure, non balisé Tlp3-LBD par 1 L de culture bactérienne, d’une pureté de la protéine de > 90 % estimé par SDS-PAGE.

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Protocol

1. l’expression de son6-Tlp3-LBD chez e. coli

  1. Inoculer 150 mL de bouillon Luria-Bertani (LB) stérile contenant 50 µg, ampicilline des-1 mL avec BL21-Codon-Plus (DE3) - cellules RIPL transformées avec le vecteur pET151/D-TOPO pour l’expression de son6- Tlp3-LBD (résidus d’acides aminés 42-291), et Incubez il à 37 ° C dans un agitateur (diamètre de l’orbite, 25 mm) avec 200 tr/min pendant la nuit.
  2. Préparer six flacons Erlenmeyer de 2 L contenant 800 mL de bouillon LB stérile et le 50 µg mL-1 ampicilline. Inoculer chaque flacon de 20 mL de la culture au jour le jour obtenue à l’étape 1.1. Les incuber à 37 ° C sous agitation continue à 200 tr/min jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm atteint 0,6.
  3. Prendre 1 mL d’une aliquote de l’une des fioles (échantillon de contrôle non induits), les granulés à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse (13 000 x g, 4 ° C, 10 min) et éliminer le surnageant. Stocker le culot bactérien à-20 ° C pour une analyse ultérieure SDS-PAGE.
  4. Induisent l’expression de la protéine en ajouter 1 mM de l’isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) chaque ballon avec la culture. Continuer en incubant les flacons à 37 ° C dans un agitateur à 200 tr/min pendant 4 h supplémentaires.
  5. Récolter les cellules par centrifugation à 5 000 x g pendant 15 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
    Remarque : À ce stade, la procédure peut être suspendue en plaçant le culot cellulaire dans un congélateur-80 ° C pour le stockage.

2. isolement et dénaturation des corps d’Inclusion

  1. Transférer tous les boulettes de cellules obtenues à l’étape 1.5 dans un bécher de 250 mL et ajouter 100 mL de tampons A (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM). Permettre aux cellules de décongeler complètement (si surgelés) et Resuspendre le culot. Conserver l’échantillon sur la glace, sauf indication contraire.
  2. Passez les cellules resuspendues dans un homogénéisateur haute pression trois fois à lyser les cellules et assurer une tonte complète de l’ADN génomique.
  3. Centrifuger le lysat à 10 000 g pendant 15 min à 4 ° C. Prélever un échantillon de 1 mL du surnageant (fraction soluble) et conserver à-20 ° C pour une analyse ultérieure SDS-PAGE. Jeter le reste du liquide surnageant et placer la pastille sur la glace.
    Remarque : Cette pastille est de couleur blanche (faciles à distinguer des cellules ininterrompues qui sont la nuance de brun en couleur) et contient des corps d’inclusion.
  4. Resuspendre le culot de corps d’inclusion dans 20 mL de tampon glacee B (pH 10 mM Tris-HCl 8.0, le fluorure de phénylméthanesulfonyle 0,2 mM (PMSF), 1 % X-100 Triton). Ceci facilite la solubilisation de la membrane et les protéines membranaires. Vortex pour 1-2 min à la remise en suspension de l’aide.
  5. Centrifuger l’échantillon à 10 000 g pendant 15 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
  6. Resuspendre le culot dans 20 mL de tampon glacee B au vortex le tube pendant 1-2 min. veiller à ce que la pastille est cassée en petits morceaux. Pipette de l’échantillon up et down pour pellet remise en suspension de l’aide.
    Remarque : Il est important de resuspendre le culot soigneusement pour obtenir des corps d’inclusion exemptes d’impuretés.
  7. Répétez l’étape 2.5. Si le surnageant est trouble ou colorée, répétez les étapes 2.6 et 2.5 (dans cet ordre) jusqu'à ce que le liquide surnageant est limpide et incolore.
  8. Resuspendre le culot dans 20 mL de tampon glacee C (10 mM Tris-HCl pH 8,0, PMSF à 0,2 mM) au vortex le tube pendant 1-2 min.
  9. Répétez l’étape 2.5.
  10. Ajouter 25 mL de tampon de dénaturation glacee D (pH de 10 mM Tris-HCl 8.0, urée 8 M, 10 mM le dithiothréitol (DTT), PMSF à 0,2 mM) pour dissoudre le culot de corps d’inclusion. Resuspendre soigneusement au Vortex pendant 1-2 min ou jusqu'à ce que la pastille est cassée en petits morceaux.
  11. Mélanger la suspension en rotation axiale avec un taux de rotation de 30 tr/min pendant 30 à 120 min à 4 ° C.
  12. Clarifier la solution de protéines dénaturées par centrifugation à 30 000 x g, 4 ° C pendant 30 min, placer le surnageant sur la glace et jeter le culot.
  13. Mesurer la concentration de la protéine à l’aide de l’analyse de Bradford. 24 , prélever une partie aliquote d’analyse SDS-gel et placez-le à-20 ° C.
    NOTE : À ce stade, la procédure peut être suspendue par snap-gel l’échantillon aliquoté dans l’azote liquide et le conserver à-80 ° C pour le stockage.

3. repliement des protéines

  1. Préparer 250 mL de tampon E (3 M urée, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,4 M monochlorhydrate de L-arginine, glutathion-20 mM réduit L, 2 L-glutathion oxydé mM) dans un bécher de 500 mL et de rafraîchir la mémoire tampon jusqu'à 4 ° C.
  2. Ajouter 60 mg de mélange de protéines dénaturées contenant son6-Tlp3-LBD obtenu à l’étape 2.13 à 250 mL de tampon E, en remuant le tampon à 500 tr/min. Incuber le mélange repliement à 4 ° C sous agitation continue à 500 tr/min pendant 24 à 48 heures. La concentration de la protéine finale lors de cette étape est de 0,2 mg mL-1.
  3. Préparer L 7 de tampons A dans un seau de 8-10 L et refroidir jusqu'à 4 ° C, en préparation pour la prochaine étape (étape 3.4) qui aura lieu dans les 24-48 h (Voir l’organigramme de la Figure 1).
  4. Plonger un morceau de ~ 50 cm de tube à dialyse de 28 mm de diamètre gonflé, avec limite de poids moléculaire à 12-14 kDa dans 200 mL de sel disodique de l’acide de 10 mM EDTA (EDTA-Na2) et chauffez-le au-dessus d’une flamme de gaz jusqu'à ébullition. Rinçage de la membrane de dialyse avec 200 mL de ddH2O.
  5. Fixer une extrémité de la membrane de dialyse avec une fermeture de tuyauterie de dialyse et transférer le mélange obtenu à l’étape 3.2 dans le tube de dialyse de repliement de 250 mL. Fermer l’extrémité ouverte avec une autre pince. Vérifier l’intégrité de la membrane pour assurer qu'il n’y a pas de fuites.
  6. Placer le tube de dialyse dans un seau de dialyse avec le refroidissement préalable 7 L de tampon A préparé à l’étape 3.3. Placez une agitation magnétique bar, assurant qu’il ne touche pas le tube à dialyse tout en remuant.
  7. Demi-temps l’échantillon à 4 ° C, avec une constante agitation à 500 tr/min et modifier la mémoire tampon d’au moins quatre fois sur une période de 12 h. Après le dernier changement de tampon, laisser l’échantillon à demi-temps du jour au lendemain.
    Remarque : Pendant la dialyse, l’excès d’urée (~ 3 M) est progressivement retiré de la solution de protéines dénaturées, ce qui permet à la protéine à replier. Précipitation de protéines lourdes peut être observée à la fin de la dialyse.
  8. Retirez le tube de dialyse dans le seau, puis transvaser son contenu dans un bécher de 500 mL. Conserver la solution de protéines sur la glace, sauf indication contraire.
  9. Filtrer la solution de protéines à travers une membrane de taille de pore de 0,43 µm dans une bouteille de verre de 500 mL pour supprimer toute protéine précipité.

4. la purification de son6-protéine utilisant la chromatographie d’affinité immobilisée Ion métallique contenant le tag

  1. Charger et équilibrer une colonne chélateur préemballés de 5 mL.
    1. Connecter la colonne à une pompe péristaltique, assurant qu’il n’y a pas d’air emprisonné dans la tubulure de raccordement.
    2. Laver la colonne en passant par 25 à 50 mL de ddH2O.
    3. Charger la colonne en chargeant 3 mL de 0.1 M NiCl2 et puis en passant par 25 mL de ddH2O.
    4. Equilibrer la colonne avec 25 mL de tampon F (tampon de dissociation, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl, imidazole de 20 mM à 500 mM).
  2. Ajuster l’échantillon replissé protéine obtenue à l’étape 3.9 à la composition du tampon F en ajoutant 2,5 mL de 1 M Tris-HCl pH 8,0, 25 mL de 5 M de NaCl et 2,5 mL des solutions mères de 2 M imidazole.
  3. Charger l’échantillon sur la colonne à un taux de 5 mL/min ou moins et jeter le cheminement (protéines non liées).
  4. Laver la colonne avec 50-100 mL de tampon F pour éliminer les protéines non spécifiquement liées et jeter le cheminement.
  5. Éluer son6-Tlp3-LBD avec 25 mL de tampon G (tampon d’élution, 20 mM Tris-HCl, NaCl, imidazole de 500 mM à 500 mM) et mettre en commun les fractions intermédiaires contenant la protéine (comme déterminé en utilisant le réactif de Bradford).
  6. Mesurer la concentration de protéines dans l’échantillon à l’aide de l’analyse de Bradford. Prendre une petite portion pour analyse SDS-PAGE et place à-20 ° C.

5. son6-balise de suppression à l’aide de protéase TEV (facultatif)

  1. Préparer et refroidir à 4 ° C, 4 L de tampon H (tampon de clivage TEV, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 % (v/v) de glycérol, 2 mM DTT).
  2. Couper environ 5-7 cm de tube de dialyse (diamètre 2-3 cm) et plongez-le dans 200 mL de ddH2O.
  3. Ajouter son6-tag protéase TEV pour son6-protéine balise préparé à l’étape 4.5 dans un rapport molaire définitif 1 TEV : protéine 8.
  4. Fixer une extrémité du tube avec une fermeture de tuyauterie de dialyse et remplissez-le avec le mélange de protéase de protéine/TEV. Fermer l’autre extrémité et il n’y a pas de fuites.
  5. Place la dialyse tuyau dans la 4 L refroidissement préalable de tampon H (de l’étape 5.1) et il incuber à 4 ° C avec continue en remuant pendant 2 h. changement du tampon et continuer la dialyse pendant la nuit pour permettre la réaction de clivage médiée par TEV terminer.
  6. Entre-temps, préparer et laisser refroidir (4 ° C) 4 L de tampon (10 mM Tris-HCl ph 8,0, 150 mM NaCl, 1 % (v/v) de glycérol) en préparation pour le lendemain.
  7. Après la dialyse pendant la nuit, échanger du buffer tampon que j’ai préparé à l’étape 5,6 et demi-temps pendant un autre 1-2 h à 4 ° C.
  8. Retirer le tube dans le seau de dialyse, détachez une extrémité du tube et transvaser la solution de protéines dans un tube de Falcon de 50 mL. Filtrer la solution à travers un filtre de seringue de taille de pore 0,43 µm et gardez-le sur la glace, sauf indication contraire.
  9. Mesurer le volume de l’échantillon et ajuster la concentration en NaCl, Tris et imidazole à la composition du tampon F (par exemple pour 25 mL d’une solution protéique dans le tampon J ajouter 0,25 mL de 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,75 mL de 5 M de NaCl et 0,25 mL d’imidazole M 2).
  10. Préparer une colonne de HiTrap de chélation HP 5 mL comme indiqué au point 4.1.
  11. Charger l’échantillon sur la colonne (débit : 5 mL/min) et de recueillir les intermédiaires, qui contient le non balisé Tlp3-LBD (résidus 42-291). Protéine clivé, le clivées son6-tag et son6- TEV sont conservés par la colonne.
  12. Laver la colonne avec 5 mL de tampon F (tampon de charge) pour permettre à toutes les protéines non balisés traversent et recueillir l’éluat.
  13. Piscine de l’éluat obtenues aux étapes 5.11 et 5.12 et mesure la concentration de protéine. Prenez une petite aliquote et conserver à-20 ° C pour l’analyse SDS-PAGE.

6. exclusion stérique (Filtration sur Gel) de Tlp3-BBD

  1. Préparer 1 L de tampons A (10 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM) et filtrez-le à l’aide d’une membrane de 0,43 µm.
  2. Equilibrer une colonne d’exclusion stérique 26/60 avec tampons A à un débit de 4 mL/min.
  3. Concentrer l’échantillon de protéine obtenue à l’étape 5.13 à un volume de 3 à 4 mL à l’aide de concentrateur centrifuge 15 mL avec un cut-off 10 kDa (4 ° C, 4 000 x g).
  4. Clarifier la solution protéique par centrifugation à 13 000 x g, 4 ° C pendant 30 min enlever toute protéine précipité.
  5. Charger l’échantillon sur la colonne de filtration préalable équilibré 26/60 gel. Effectuer chromatographie en tampons A à un débit de 4 mL/min. surveiller la trace de l’UV. Tlp3-LBD élue à un volume de rétention de 210-220 mL. Mettre en commun les fractions de pic.
  6. Mesurer la concentration de protéine. Prenez une petite aliquote d’analyse SDS-PAGE.

7. SDS-PAGE analyse d’échantillons prélevés à différentes étapes de Purification des protéines

  1. Préparer 1 L de tampon en cours d’exécution de SDS-PAGE (tampon J), contenant 25 mM Tris, 250 mM glycine pH 8,3 et 0,1 % (p/v) sodium dodecyl sulfate (SDS).
  2. Préparation de 10 mL de 5 x tampon (buffer K) de la charge de SDS-PAGE, contenant 0,25 M Tris-HCl pH 6,8, SDS de 10 % (p/v), 50 % (v/v) de glycérol, 1 millimètre DTT et 0.05 % bromophénol bleu.
  3. Permettre les aliquotes recueillis durant les différentes étapes de la purification (étapes 1.3, 2.3, 2.13, 4,6, 5.13, 6,6) à dégeler.
  4. Pour chaque échantillon, mélanger le volume correspondant à 15 µg de protéines totales avec 2 µL de 5 x SDS-PAGE de chargement de la mémoire tampon et régler le volume à 10 µL avec FD2O.
  5. Les échantillons à 95 ° C pendant 5-10 min de la chaleur, elles tournent à 10 000 x g pendant 30 s et transfert les échantillons dans un tube propre.
  6. Préparer un gel SDS-PAGE, à l’aide de 15 % de polyacrylamide gel de séparation (pour 30 % (p/v) de 5 mL : 2,5 mL bis-acrylamide, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 1,2 mL FD2O, 50 µL 10 % (p/v) SDS, 50 µL 20 % (p/v) Le persulfate d’ammonium (APS), 3 µL tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et 5 % de polyacrylamide gel d’empilage (pour 30 % (p/v) de µL de 2 mL : 340 bis-acrylamide, 250 µL 1 M Tris pH 6,8, 1,37 mL FD2O, 20 µL 10 % (p/v) SDS, 20 µL 20 % (p/v) APS, 2 µL TEMED).
  7. Assembler l’appareil d’électrophorèse et remplissez-le avec 1 x SDS page tampon selon les recommandations du fabricant.
  8. Charger un marqueur de poids moléculaire de protéine et les échantillons préparés à l’étape 7,5. Effectuer l’électrophorèse avec un courant constant de 25 mA.
  9. Transférer le gel dans un récipient et rincez-la ddH2O. Ajouter 150 mL du bleu de Coomassie coloration solution contenant 25 % (v/v) isopropanol, 10 % (v/v) d’acide acétique et 0,03 % (p/v) R-250 bleu brillant. Placer le récipient sur une plate-forme de rotation horizontale pendant 30 min à température ambiante.
  10. Rincer le gel avec les ddH2O et placez dans la solution de décoloration contenant 5 % (v/v) de méthanol et d’acide acétique 7 % (v/v). Décolorer tout en mélangeant à l’aide d’une plateforme de rotation horizontale pendant 1 h.
  11. Le gel d’image et d’analyser.

8. circulaire dichroïsme spectroscopie analyse de Structure secondaire des protéines pures replissé

  1. Transfert de 0,5 - 1 mg de protéine replissé obtenu à l’étape 6,6 dans un tube de dialyse et le placer dans un seau de dialyse contenant 5 L de tampon L (50 mM phosphate pH 7,4), refroidi à 4 ° C. Demi-temps l’échantillon à 4 ° C sous agitation continue et effectuer au moins 3-4 changements de tampon sur une période de 2 à 4 h avant de quitter l’échantillon à demi-temps du jour au lendemain.
  2. Concentrer la solution protéique dialysé à 0,06 mg mL-1 à l’aide d’un concentrateur centrifuge de coupure de 10 kDa.
  3. Clarifier la solution par centrifugation à 13 000 x g, 4 ° C pendant 30 min.
  4. Enregistrer le spectre UV lointain de CD de l’échantillon à 25 ° C sur une plage de longueur d’onde de 200 à 260 nm en utilisant un spectropolarimètre avec une vitesse de balayage de 20 nm min-1. Utiliser le tampon de dialyse comme un contrôle à blanc. Répétez l’enregistrement en triple exemplaire et générer le spectre en moyenne.
  5. Calculer la teneur de la structure secondaire de deconvoluting le CD en utilisant le programme CDSSTR de la DichroWeb les spectres sever25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).

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Representative Results

Recombinante expression de son6-Tlp3-LBD chez e. coli a abouti au dépôt de protéines dans le corps d’inclusion. L’expression de 1 L de culture bactérienne calculée à l’étape 2.13 représentait environ 100 mg de son6-Tlp3-LBD déposé au corps d’inclusion. La technique d’isolation de protéine, décrit ici et illustré dans la Figure 1, se compose de la solubilisation des corps d’inclusion, le repliement des protéines et la purification, au moyen de la chromatographie d’affinité, la suppression de la balise et chromatographie d’exclusion stérique et les rendements de 10 à 20 mg de pure, non balisé Tlp3-LBD par 1 L de culture bactérienne.

La protéine éluée de la colonne de filtration sur gel un pic unique, symétrique, correspondant à un volume de rétention de 220 mL (Figure 2 a). Calcul de la masse moléculaire (mm) à l’aide d’un complot d’étalonnage de log (MW) versus volume de rétention (Vrétention (mL) = 549,3-73,9 x log(MW)) disponible sur le site EMBL Protein Expression and Purification Core Facility (http://www.embl.de/ pepcore/pepcore_services/protein_purification/chromatography/hiload26-0_superdex200/index.html), a donné la valeur de 29 kDa. Cette valeur est très proche de celle calculée à partir de la séquence d’acides aminés (28,7 kDa), qui a suggéré cette Tlp3-LBD est un monomère en solution.

Pour évaluer le processus de purification, échantillons prélevés à différentes étapes ont été évalués en utilisant l’analyse SDS-PAGE. Comme illustré à la Figure 2 b, corps d’inclusion contient principalement son6-Tlp3-LBD. De petites quantités de cette protéine étaient également présentes dans la fraction soluble de la culture induite (IPTG(+)) et dans la culture non induite (IPTG(-)) – apparemment à la suite de l’expression qui fuite de la polymérase T7. Son6-Tlp3-LBD migré sur le gel de polyacrylamide avec un poids moléculaire apparent de 28 kDa, qui est proche de la valeur calculée à partir de la séquence d’acides aminés (31,8 kDa). Le son6-tag removal, chromatographie d’affinité et étapes de filtration ont donné très pure protéines sur gel (> 90 % homogénéité électrophorétique).

Pour confirmer que la protéine obtenue par ce procédé est plié, la structure secondaire de son6-Tlp3-LBD a été évalué par spectroscopie de CD. Estimation de l’hélice α et β-feuille contenu du spectre CD (Figure 3) à l’aide de CDSSTR ont donné des valeurs de β α et 23 % de 31 %. Ces valeurs étaient proches de celles déduites de l’analyse de la séquence en utilisant le serveur Jpred3 (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (37 % 26 % α et β), indiquant que la protéine extraite du corps d’inclusion dénaturé urée a été pliée.

Figure 1
Figure 1 : schéma de la méthode présentée. Recombiné son6-Tlp3-LBD est expressd chez e. coli à induction avec IPTG (voir point 1). Après une expression de 4 h, les cellules bactériennes sont récoltées et lysent (voir chapitre 2). La fraction insoluble contenant les corps d’inclusion (IB) est lavée pour l’enlèvement de la membrane et les impuretés de protéines membranaires, après quoi l’IB sont dissous dans une mémoire tampon contenant de l’urée à forte concentration (voir chapitre 2). Son6-Tlp3-LBD est replié par dilution dans le tampon E suivie de dialyse exhaustive pour l’élimination progressive d’urée (section 3). Replié son6-Tlp3-LBD est ensuite purifiée par chromatographie d’affinité immobilisée ion métallique tel que décrit à l’article 4. Le son6-balise est supprimée à l’aide de protéase TEV (section 5). Non balisé Tlp3-LBD est concentré et purifié par chromatographie par filtration sur gel (section 6). Points de prélèvement d’échantillons pour analyse SDS-PAGE sont indiqués avec *. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Purification des recombinant Tlp3-LBD. (A) trace de chromatographie exclusion stérique de Tlp3-LBD non balisé sur une colonne de filtration sur gel Superdex 200 HiLoad 26/60. La protéine éluée avec un volume de rétention de 220 mL. (B) réduit gel SDS-PAGE bleu de Coomassie teinté de 15 %. M: marqueur de poids moléculaire de protéine ; IPTG (-) : contrôle non induits échantillon recueilli dans l’étape 1.3 ; IPTG (+) : fraction soluble après induction d’IPTG (recueillie à l’étape 2.3) ; IB : corps d’inclusion isolés (étape 2.13) ; Replié son6-Tlp3-LBD : échantillon de protéine replissé étape 4,6 ; Non balisé Tlp3-LBD : échantillon de protéine obtenu à l’étape 5.13 ; Gel filtration 1 et 2 : deux fractions depuis le pic de protéine éluée de la colonne de gel filtration (étape 6.6). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : spectre de dichroïsme circulaire de purifié recombinant Tlp3-LBD. Le spectre a été enregistré à 25 ° C en 50 mM phosphate pH 7,4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Une procédure simple pour l’expression et le repliement de corps d’inclusion de la LBD périplasmique de la zone chémoréceptrice bactérienne Tlp3 est présentée. Préparation de la protéine pure implique la surexpression du gène codées en pET-plasmide dans e. coli, de purification et de solubilisation des corps d’inclusion, repliement de la protéine dénaturée et sa purification par l’affinité consécutive et étapes de la chromatographie d’exclusion stérique. L’urée-facilité de dénaturation et dilution/dialyse-mediated repliement sont des étapes cruciales dans le protocole, optimisation dont est souvent nécessaire de s’assurer de la bonne renaturation de la protéine déposée au corps d’inclusion26.

Repliement de Tlp3-LBD a été atteint d’une manière en deux étapes, tout d’abord par la dilution de l’échantillon dénaturé dans une mémoire tampon contenant de l’urée, puis par dialyse l’échantillon contre un tampon dépourvue d’elle. La protéine replissée obtenue à l’aide de ce protocole était fonctionnelle et cristallisables18,23. Toutefois, la méthode présentée a quelques limitations. Il est bien connu que carbamylation des groupements aminés se produit souvent lorsque la protéine est dénaturée et replié en présence d’urée27,28,29. Cela est dû au fait que l’urée dissoute se décompose avec le temps et produit le cyanate30 qui réagit avec les groupes aminés de protéines pour former un produit carbamylée stable et, dans une moindre mesure, avec d’autres groupes fonctionnels31, 32. la décomposition de l’urée est accélérée dans des conditions de pH alcalin et température élevée. Ainsi, il est recommandé de faire des solutions fraîches urée d’ultrapure (> 99 %) des réactifs solides et effectuez les opérations de repliement/dialyse à basse température (4 ° C)30,33, pour diminuer la formation de cyanate. Par ailleurs, choisir le buffer contenant des amines primaires, tels que les Tris, glycine ou bicarbonate d’ammonium, pour le mélange de repliement est important pour permettre le nettoyage du cyanate produit29,33. Autre option consiste à utiliser le chlorhydrate de guanidine au lieu de l’urée, comme chlorhydrate de guanidine n’a pas été signalé à modifier chimiquement les protéines.

En plus de l’urée, un agent réducteur (TNT ou β-mercaptoéthanol) est souvent nécessaire de solubiliser les corps d’inclusion et pour empêcher les non-indigènes intra - et intermoléculaire disulfure obligations formation en maintenant les résidus de cystéine dans leur état réduit26 ,,34. Tlp3-LBD a un pont disulfure intramoléculaire et dans le présent protocole, 10 mM DTT a été incorporé dans la mémoire tampon de dénaturation de corps d’inclusion (étape 2.10) pour faciliter la remise en suspension de la protéine insoluble. Concentration de TNT a ensuite été réduite de ~ 100 fois par dilution de l’échantillon dans la protéine repliement tampon, suivi de l’étape de la dialyse pour éliminer progressivement tous les TNT. Il est important de noter que l’application de cette procédure pour le repliement des protéines avec plusieurs ponts disulfures peut-être avoir besoin d’optimisation de la concentration des oxydants et réducteurs (p. ex. oxydées et réduites de glutathion (GSH/GSSH), GSSH/DTT, cystamine/cysteamineor cystine/cystéine) pour promouvoir la formation correcte du disulfure de ponts34,35. En outre, si la protéine d’intérêt est impair cystéines qui ne sont pas impliqués dans la formation de la liaison disulfure, un agent réducteur s’ajouteront à tous les tampons de purification ; Prédiction des ponts disulfure potentiels de la séquence d’acides aminés d’une protéine peut être effectuée à l’aide de plusieurs outils in silico (par exemple cys_rec : http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& sous-groupe = propt).

L’utilisation du protocole présenté pour la purification de protéines différentes est également susceptible de nécessiter l’optimisation de la concentration de l’imidazole pendant l’étape de lavage 4.4. Comme le montre la Figure 2 b (lane étiqueté IB), les corps d’inclusion isolées contenues, dans cette instance, principalement la protéine d’intérêt. Si des bandes importantes additionnelles sont visibles sur SDS PAGE gel de l’échantillon de l’IB, augmentation de la concentration de l’imidazole en étape 4.4 devront retirer les contaminants, mais pourrait réduire la protéine rendement36,37. Autre option consiste à appliquer un dégradé linéaire de la concentration de l’imidazole et de mettre en commun les fractions éluées qui contiennent la protéine d’intérêt.

La dernière étape de la purification, chromatographie d’exclusion stérique, permet d’estimer la masse moléculaire des particules éluées simultanément et de dériver l’État oligomère de la protéine. Cependant, l’estimation de la masse moléculaire par chromatographie d’exclusion stérique est seulement précise pour molécules sphériques, qui n’est pas le cas pour plusieurs protéines38,39. On peut déterminer la protéine de masse moléculaire et état oligomère avec une plus grande précision en utilisant la chromatographie d’exclusion stérique couplé à multi-angle diffusion de la lumière (SEC-MALS)40 ou ultracentrifugation analytique41. Précédemment, nous avons confirmé que Tlp3-LBD est monomère en solution à l’aide de SEC-MALS analyse23, et ce résultat concorde avec les rapports sur les autre dCACHE LBDs42,43.

Le protocole présenté, dans sa forme originale ou légèrement modifiée, a été utilisé pour replier et épurer plusieurs zone chémoréceptrice LBDs de la famille dCACHE pour rayons x études cristallographiques17,18,19, 23 , 42 , 44. cette procédure peut être généralement utile pour la production de quantités de milligramme de LBDs périplasmiques des autres chémorécepteurs bactériennes sous forme soluble et cristallisable. Dans chaque cas séparément, optimisation de protocole est probablement nécessaire. Outre les points discutés ci-dessus, solubilisation optimale des corps d’inclusion et le repliement des protéines peut exiger l’utilisation de détergents (par exemple SDS ou N-acétyl triméthyl ammonium chlorure), additifs (par exemple L-arginine) et ajustement de leur temps de concentration et d’incubation en particulier repliement étapes26,34,45,46. En outre, la concentration de protéines dans l’étape de repliement affecte significativement le rendement de repliement. La gamme des concentrations de 1 ng mL-1 à 10 mg mL-1 doit généralement être testée. Pour Tlp3-LBD, la concentration optimale de protéines dans le mélange de repliement était de 0,2 mg mL-1.

Très faible rendement de repliement est habituellement un signe que les conditions du procès de repliement sont loin d’être optimale. On peut s’attendre que le rendement élevé est conforme à une protéine repliée, qui peut être validée en utilisant la spectroscopie de CD (comme décrit dans cette procédure). En outre, crystallisability de la protéine qui en résulte peut sugguest repliée de la protéine. Par ailleurs, un test fonctionnel (si disponible) peut être utilisé pour confirmer que la protéine est pliée. Dans le cas de Tlp3-LBD, par exemple, la protéine replissée a été montrée pour conserver sa capacité de liaison du ligand, comme en témoigne la calorimétrie isotherme. 23

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Disclosures

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions Yu C. Liu pour ses premiers travaux sur la production Tlp3-LBD. Mayra A. Machuca est redevable à Admistrativo-Departamento de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS pour une bourse de doctorat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris base AMRESCO 497
Sodium chloride (NaCl) MERK MILLIPORE 1064041000
Ampicillin G-BIOSCIENCES A051-B
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MERCK 52332
Triton x-100 AMRESCO 694
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD AST0487
Urea AMRESCO VWRC0568
Dithiothreitol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD C-1029
L-arginine monohydrochloride SIGMA-ALDRICH A5131
Reduced L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4251
Oxidized L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4376
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) SIGMA-ALDRICH 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) SIGMA-ALDRICH 10049-21-5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) AMRESCO VWRC20302.260
Imidazole SIGMA-ALDRICH I2399
Glycerol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD BIOGB0232
Nickel chloride (NiCl2) SIGMA-ALDRICH 339350
Glycine AMRESCO VWRC0167
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA-ALDRICH L4509
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) NEW ENGLAND BIOLABS P7703
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) MERCK UFC901096
50 mL Falcon tube FALCON BDAA352070
Dialysis tubing LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY Dialysis
Snakeskin dialysis tubing THERMO SCIENTIFIC™ 68100
Prepacked HiTrap Chelating HP column GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 17-0408-01
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser AVESTIN EmulsiFlex™ - C5
Peristaltic Pump P-1 GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column  GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 28989336
JASCO J-815 spectropolarimeter JASCO J-815

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References

  1. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  2. Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
  3. Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
  4. Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R. Chemotaxis in Campylobacter jejuni. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (1), 24-31 (2012).
  5. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
  6. Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
  7. Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  8. Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
  9. Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
  10. Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822 (2014).
  11. Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
  12. Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
  13. Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206 (2016).
  14. McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
  15. Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
  16. Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
  17. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
  18. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
  19. Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
  20. Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862 (2016).
  21. Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
  22. Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
  23. Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  25. Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
  26. Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
  27. Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
  28. Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
  29. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  30. Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
  31. Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
  32. Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry. 4 (6), 1030-1036 (1965).
  33. Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
  34. Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
  35. Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11 (2004).
  36. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
  37. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
  38. Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
  39. Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  40. Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
  41. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
  42. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
  43. Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
  44. Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
  45. Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
  46. Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochemistry. 34 (17), 5773-5794 (1995).

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Machuca, M. A., Roujeinikova, A. Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain. J. Vis. Exp. (130), e57092, doi:10.3791/57092 (2017).

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