Method Article

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

DOI:

10.3791/57099

⸱

March 29th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Institute for Basic Research, The New York State Office for People with Developmental Disabilities, 2Placental Analytics LLC, 3Visikol Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo apresenta um protocolo para o tecido reversível compensação, imunocoloração, renderização 3D e análise de redes vasculares em amostras de vilosidades da placenta humana na ordem de 1-2 mm3.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Troca de nutrientes e gases entre mãe e feto ocorre na interface do sangue intervillous materno e a vasta rede de capilar das vilosidades que torna-se muito do parênquima da placenta humana. A rede capilar vilosa distal é o terminal da fonte de sangue fetal, depois de várias gerações de ramificação dos vasos que se estendem desde o cordão umbilical. Esta rede tem uma bainha celular contígua, a camada de barreira trofoblasto sincicial, que impede a mistura do sangue do feto e o sangue materno, no qual é continuamente banhado. Insultos à integridade da rede capilar placentária, ocorrendo em doenças como diabetes materna, hipertensão e obesidade, têm consequências que presentes sérios riscos de saúde para o feto, infantil e adulto. Para melhor definir os efeitos estruturais destes insultos, um protocolo foi desenvolvido para este estudo que capta a estrutura capilar rede na ordem de 1-2 mm3 onde um pode investigar suas características topológicas em sua total complexidade. Para realizar isto, clusters de terminais vilosidades da placenta são dissecados e a camada de trofoblasto e o endothelia capilar é immunolabeled. Estas amostras são então esclarecidas com um tecido novo, processo que torna possível adquirir pilhas imagem confocal para z-profundidades de ~ 1 mm de compensação. As renderizações tridimensionais dessas pilhas são então processadas e analisadas para gerar medidas básicas de rede capilar, tais como o volume, o número de ramificações capilares e pontos de extremidade do ramo capilar, como validação da adequação dessa abordagem para caracterização da rede capilar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nosso entendimento de suas patologias e a placenta em desenvolvimento é, em grande medida, limitado para inferir relações espaciais entre vilosidades adjacentes e capilares contidos derivados de cortes histológicos. Neste estudo, abordámos esta questão ao desenvolver os meios para gerar os renderizações tridimensionais (3D) das redes de capilares placentários humanos que são adequados para análises das características da rede capilar (por exemplo, ramificação, solidez). Para fazer isso que combinamos coloração imunofluorescente com dois produtos de limpeza do tecido comercial, Visikol-1 e Visikol-2 (referido abaixo como solução-1 e 2 de solução).

A placenta humana é um vasto complexo de vasos sanguíneos localizados na interface entre o sangue da mãe intervillous e o desenvolvimento do feto. Estendendo-se para fora de sua inserção na placa coriônica, o cordão umbilical ramifica-se em uma rede de artérias e veias que ramify para cobrir a superfície coriônica com uma elaborada rede vascular. Suas extremidades então penetram para o interior ou a profundidade do disco placentário onde eles passam por várias gerações mais ramificação e terminam no terminal villi e suas redes capilares contidos, o site da troca de gases, nutrientes, e metabólica resíduos entre o sangue fetal e materno.

Insultos à rede capilar placentário durante o desenvolvimento tem consequências duradouras para a saúde do feto, recém-nascido e o adulto emergente 1,2,3. Tendo em conta as patologias relacionadas com a gravidez, como aborto, restrição de crescimento intra-uterino, diabetes pré-eclâmpsia e maternal 4,5,6 lá é um alto valor colocado no desenvolvimento de métodos de medição e caracterização de redes capilares das vilosidades da placenta. Um grande obstáculo é que redes vasculares placentárias abrangem uma vasta gama de escala. As redes de superfície vasculares podem ser tão grandes como 4-5 mm de diâmetro. Os capilares das vilosidades terminais são da ordem de 10 -20 µm de diâmetro; a placenta contém mais de 300 km de vasos sanguíneos 7. Presentemente, existem algumas técnicas de rápida e fácil de usar que podem capturar esses extremos da escala de navio. Até à data, apenas um pequeno número de vilosidades pode ser processado por microscopia. Por exemplo, Jirkovska et al enfoca as vilosidades da placenta no prazo, combinando a microscopia confocal com seriais seções óticas intervalos 1 µm obtidos de 120 µm de espessura seções; Não há dados sobre o número de amostras estudadas nem estatísticas foram fornecidos 8. Estruturas capilares foram identificadas, e contornos de vilosidades e capilares foram desenhados à mão, com traçados exportados para análise de imagem. Enquanto os autores discutem as implicações de suas descobertas para a "rede vascular vilosa crescente", tais conclusões são problemáticos, quando apenas "termo" (36 + semana idade gestacional) tecido é estudado. Da mesma forma, Mayo et uml. e. Pearce et al baseou-se no tecido da mesma idade, para suas simulações de transferência de fluxo e oxigênio do sangue, mas suas análises eram limitados a apenas algumas termo, vilosidades terminal 9,10 . Stereology também foi aplicada ao estudo da estrutura dos vasos das vilosidades. Mas, novamente, o foco tem sido geralmente em gravidezes posteriores entregando bebês nascidos vivos, com uma ou mais gravidez complicações 11,12.

Até recentemente, microscopia confocal foi limitada a imagem para profundidades de tecido de 100-200 µm por causa da absorção de excitação e emissão de fluorescência pela tecido sobrejacente 13 . Apesar de tecido limpando e histologia 3D têm sido amplamente descritos na literatura e há inúmeros métodos para tecido limpar muitos são inadequados para uso com tecidos em geral, pois danificar irreversivelmente morfologia celular através do hyperhydration de proteínas ou remoção de lipídeos. Portanto, não é possível validar que estes resultados são indicativos do próprio tecido e não artefatos de processamento considerando nosso tecido em processo de compensação é uma técnica reversível que é capaz de validar contra histologia tradicional. Clareira de tecido geralmente envolve uma das três abordagens principais: 1) correspondência uniforme de índice de refração (RI) dos componentes do tecido por submersão em soluções correspondentes do RI, que remove o espalhamento de luz cumulativo causado da lente devido à contínua flutuação de baixo RI (citosol) e altas constituintes de RI (proteína/lipídios); 2) removendo componentes lipídicos por meio de incorporação em hidrogel e utilizando eletroforese/difusão para remover componentes lipídicos; 3) expansão/desnaturação da estrutura da proteína para permitir que o aumento da penetração dos solventes para incentivar a uniformidade do RI 13. Enquanto essas abordagens podem processar tecidos transparentes e permitem representações 3D de biomarcadores para ser gerado, essas representações 3D são de valor questionável clínico como é desafiador para determinar se estas imagens são indicativas de propriedades de tecido ou do tecido processo de compensação. Por outro lado, desde que nosso tecido de compensação é reversível padrão histológico e/ou imuno-histoquímica pode ser aplicado no mesmo tecido para avaliar se as alterações são clinicamente significativas.

Este estudo apresenta uma análise de 47 amostras das vilosidades distais obtido um total de 23 gravidezes clinicamente normais e electively encerrados entre 9-23 concluídas semanas gestação e duas entregas normais do termo. Imunofluorescência rotulagem do trofoblasto e endothelia permitiu uma análise quantitativa e automatizada de alterações nas redes de vascular vilosa e sua complexidade.

Com este protocolo, nós isolado e analisado villi terminal e suas redes capilares em uma escala não é possível anteriormente. Esta abordagem, quando aplicada ao desenvolvimento das vilosidades e capilar rede através de gestação irá identificar as propriedades que são a base para o nascimento de uma criança saudável. Quando aplicado a estudos de gravidezes complicadas, ele também esclarecer quando e como as patologias da placenta modificar as árvores das vilosidades e as redes de capilares que eles da bainha, e como estas afectem bem-estar fetal.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo segue as diretrizes do Instituto Estadual de Nova York para a pesquisa básica no Comitê de ética de pesquisa humana inabilidades desenvolventes.

1. das vilosidades árvore dissecação

  1. Enxágue o formol fixada tecido de placenta com salina desbastado de fosfato (PBS)14 para remover o formol e coloque em um prato de Petri no palco de um microscópio de dissecação. Usar o bisturi e pinça fina para arreliar o tecido de placenta separados para localizar árvores das vilosidades (estruturas ramificação threadlike brancas). Dissecar pedaços de árvore das vilosidades (vários milímetros de comprimento) e transferir o tecido para um microtubo contendo PBS de ~ 1 mL.

2. imunofluorescência coloração

  1. Com uma pipeta, remova a PBS e substitua com PBS fresco. Deixe descansar por 10 min com agitação ocasional. Repita mais uma vez.
    Nota: Este passo e todas as outras medidas são feitas à temperatura ambiente exceto a incubação do anticorpo primário.
  2. Utilizando uma pipeta, remova e substitua a PBS PBS 0,1% Triton-X100 + 2% de soro de cabra (PBS-T-GS) para permeabilize o tecido e bloco inespecificas de anticorpos secundários. Incube durante 30 min.
  3. Substituir o PBS-T-GS com PBS contendo 2% de soro de cabra, ambos do mouse monoclonal anti-CK7 e coelho anti-CK7.
    1. Incubar o tecido durante a noite a 4 ° C.
    2. Remova os anticorpos restantes por lavagem com PBS-GS por 10 minutos com agitação ocasional.
    3. Remova o PBS-GS e substitua com PBS-GS contendo ambos anti-rato cabra IgG juntamente com um verde emitindo (520 nm) fluoróforo e IgG de anticabra coelho acoplado a um emissor infravermelho (652 nm) fluoróforo.
    4. Remova os anticorpos, repetindo o passo 2.1.
    5. Armazene o tecido immunolabeled à temperatura ambiente no escuro.

3. clarificação do tecido

  1. Lave as amostras 3 vezes com PBS em intervalos de 10 minutos.
  2. Desidratar o tecido, removendo a PBS com uma pipeta e substituí-lo com 50% de etanol (metanol pode ser usado também). Incubar durante 10 min. Substitua fresco 50% etanol e incubar por 10 min. repetir isso mais uma vez para um total de 3 incubação do. Repita a incubação com 70%. Em seguida, substituir com 100% de etanol e incubar por 15 minutos (Alternativamente metanol pode ser usado).
  3. Com uma pinça de ponta fina, transferência de tecido para um microtubo fresco contendo ~ 1 mL de solução-1 para 4 h.
  4. Com pinça de ponta fina, transferir o tecido para um fresco microtubo contendo solução-2 para ~ 4h.
    Nota: Quando armazenados no escuro, a imunofluorescência é estável à temperatura ambiente pelo menos 6 meses.
  5. Não misture com qualquer solução aquosa, (por exemplo, o meio de montagem), pois a compensação será perdido.

4. montagem para microscopia

  1. Não monte o tecido entre uma lâmina de vidro padrão e uma lamela como o tecido é macio e facilmente deformado.
  2. Consulte a Figura 5B e montar o tecido em uma câmara de Sykes-Moore como segue;
    1. Com pinça de ponta fina coloca uma lamela redonda 25 mm na câmara de base.
    2. Com uma pinça de ponta fina, coloque a junta de borracha na base na lamela.
    3. Com uma pipeta, coloque uma gota (~ 40 µ l) de solução-2 no centro da lamela.
    4. Com a pinça de ponta fina transferi um pedaço de tecido de solução-2 para a gota no centro da lamela.
    5. Coloque uma segunda lamela na parte superior da junta.
    6. Rosqueie o anel de bloqueio na parte superior da base comprimindo as lamelas e Gaxeta até ficar firme.
      Nota: Tenha cuidado para não apertar em excesso ou lamela se desintegrará.
    7. Inserir uma agulha de calibre 22 na porta da base e através da gaxeta.
    8. Encher uma seringa de 3 mL com ~ 1,5 mL de solução-2.
    9. Monte uma agulha de calibre 25 na seringa.
    10. Insira a agulha da seringa na porta oposta e através da gaxeta.
    11. Certifique-se de que o ar na câmara é ventilação através da agulha de calibre 25 outra, delicadamente injetar solução-2and preenchimento da câmara.
    12. Retire a agulha e seringa e coloque a câmara sobre uma lâmina de vidro grande no palco microscópio confocal.
  3. Alternativamente, corte personalizados poços de folhas de silicone PDMS.
    1. Com uma tesoura, corte um 25,4 × 25,4 mm2 pedaço de folha de PDMS.
    2. Com um bisturi corte ~ 12.7 × 12.7 mm2 bem na peça.
    3. Pressione a peça firmemente sobre uma lâmina de microscópio.
    4. Encha o poço ao topo com solução-2.
    5. Transferi o pedaço de tecido do microtubo ao centro do poço.
    6. Com pinça de ponta fina Coloque uma lamela no topo do poço, tal que a parte inferior da lamela é umedecida com solução-2.
    7. Monte o conjunto de câmara de Sykes Moore com o tecido no palco microscópio confocal.

5. Confocal da microscopia

  1. Colocar o tecido na câmara em foco com um objectivo de 10x.
  2. Mova o palco do microscópio acima e para baixo através de plano focal para medir a distância entre a parte superior e inferior do tecido.
  3. Mova o palco em 2,5 µm passos para recolher um arquivo de imagem confocal contendo um conjunto de imagens através do tecido de cima para baixo.

6. inverter a clareira

  1. Reverta a clareira, transferindo o tecido para um microtubo contendo > 20 x o volume de 100% de etanol. Às 1h intervalos substituir com etanol a 70%, em seguida, etanol a 50% e, finalmente, PBS. Armazenar a 4 ° C, no escuro.
    Nota: Agora processa o tecido para a incorporação de parafina padrão, histológico e corte ou coloração imuno-histoquímico.

7. deconvolução

Nota: Para as etapas seguintes, os comandos do software, abas e menus drop-down estão em itálico.

  1. Inicie o software de deconvolução e abra o arquivo de imagem.
  2. Digite os parâmetros listados na janela'Esumoy'.
    1. Para 'espaçamentos Insira o voxel x, y e z de dimensões em µm.
    2. Para cada canal de cor, selecione o corante fluorescente usado para a imunocoloração de menu drop-down.
    3. Para o 'modalidade ', selecione Laser Confocal de varredura a partir do menu drop-down.
    4. Para o 'objectiva ', selecione o menu drop-down x 10.
    5. Para o 'meio de imersão ', selecione ar a partir do menu drop-down.
    6. Clique sobre o 'aplicar ' botão.
  3. Clique na guia 'nDeconvolutio'.
  4. Clique em '3D deconvolução ' no menu drop-down.
  5. No '3D - deconvolução ' janela segurar que as configurações são: 1) adaptável às cegas PSF PSF 2) teórica, 3) uso (padrão adaptativo PSF, 10 iterações, ruído médio), nome de Base 4).
  6. Clique sobre o 'botão Check verde ' para iniciar o programa.
  7. Quando terminar, repita as etapas 7,3-7.6 para reiniciar o programa. Quando terminar reinicie-o para a terceira e última vez.
  8. No 'Data Manager' janela, clique no arquivo com o prefixo "10-10 - 10-".
  9. Clique sobre o 'arquivo ' tab e, em seguida, clique em 'Salvar como '.
  10. Na janela'Salvar As' selecione '8-bit inteiro não assinado ' da 'tipo de dados ' menu drop-down e clique ao salvar.

8. processamento de imagem

  1. Inicie o software de Fiji.
    1. Clique em 'arquivo ', clique em 'aberto ' e selecione o arquivo de imagem Deconvolved e clique no 'aberto ' botão no 'aberto ' janela.
    2. Clique em 'canais de imagem/cor/Split e converter a imagem de três cores de arquivo em três novos arquivos contendo apenas uma cor. Salve o arquivo de imagem vermelha que contém o conjunto de imagens capilar viloso de immunolabeled. Exclua os arquivos de imagem verde e azul.
    3. Subtrair a fluorescência de plano de fundo do arquivo de imagem vermelha com: 'fundo de processo/subtrair '.
    4. No menu drop-down define raio de bola de Rolling para 10 pixels.
    5. Deixe as opções do 4 menu desmarcada e clique em 'Okey '.
    6. Clique em 'Sim no menu de pilha do processo.
    7. Remover tecido inerente da fluorescência (autofluorescência) abrindo o 'Image/Adjust/brilho-contraste ' menu e ajustar as configurações do minimum, maximum, brilho e contraste. Tenha cuidado para não remover qualquer uma da imunofluorescência capilar.
    8. Minimizar o restante fluorescência irrelevante, abrindo o 'Image/Adjust/limiar ' menu e ajuste os controles deslizantes, tal que a imunofluorescência capilar é realçada. Verifique o 'fundo escuro ' caixa e clique em 'aplicar '. Sobre o 'converter para binária suspensa ' seleção de menu o 'fundo preto ' caixa e clique em 'Okey '. Salve o arquivo de imagem preto e branco (binária) para análises abaixo.

9. análise

  1. Contagem de objeto e esqueletonização.
    1. Selecione o arquivo de imagem binária criado na etapa 8.1.8.
    2. Clique em 'analisar/Opções 3D OC e seleção apenas 'Volume' e 'loja resulta... ' caixas no menu drop-down. Certifique-se de que a caixa 'Mostrar números' está desmarcada. Clique sobre o 'Okey ' botão.
    3. CLIck na 'analisar/3D objetos contador '. No menu drop-down, defina 'tamanho filtro: min. ' a 5000. Garantir que o 'excluir objetos nas bordas caixa está desmarcada. Verifique que o 'objetosestatísticas e 'Resumo ' caixas são verificadas. Clique sobre o 'Okey ' botão.
      Nota: Isto pode levar alguns minutos dependendo da configuração do arquivo de tamanho e computador.
    4. Salve a tabela de estatísticas e o arquivo de mapa de objetos.
    5. Selecione o arquivo de mapa de objetos. Clique em 'Skeletonize/Plugins/esqueleto 2D-3D' de carnívoras a rede capilar no arquivo binário. Clique em 'arquivo/salvar como. Selecione 'Tiff... ' no menu drop-down. Na salvar como janela TIFF adicionar "Skel-" ao nome de arquivo de mapa de objeto e clique sobre o 'salvar ' botão.
    6. Clique em 'analisar/esqueleto/analisar esqueleto 2D-3D'. No menu drop-down, aceite as configurações padrão e clique sobre o 'Okey ' botão. Salvar a tabela de ramo 'informação' , a ' tabela deresultados e dois arquivos de saída (Skel-objetos-rotulados - esqueletos e Tagged esqueleto).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os renderings 3D gerados de capilares em clusters de vilosidades terminais na placenta humana da idade gestacional de 8 semanas para a entrega do termo foram contados como clusters individuais e esqueletizados para análise de rede. As unidades funcionais da placenta (Figura 1A) são as árvores de vilosidades que são uma extensão dos navios de superfície onde eles penetraram o parênquima de placenta (Figura 1

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O Conselho de revisão institucional aprovado a coleção de tecidos das vilosidades da placenta para fixação de formol de gravidezes electively rescindidos. Antes que as cirurgias foram realizadas, uma breve revisão do registro médico observou idade materna, paridade e confirmada a ausência de médicos subjacente (por exemplo, hipertensão, diabetes e lúpus) ou do feto (anomalias cromossômicas ou estruturais, realizou-se um crescimento anormal). Folha de dados e quaisquer espécimes coletados foram rotulados apenas c...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pela Secretaria de estado de New York para povos com inabilidades desenvolventes e placentária Analytics LLC, New Rochelle, NY.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Solução de formaldeído a 10% (p/v) em tampão fosfato aquosoMacron Fine ChemicalsH-121-08Agente de fixação geral, fórmula pronta para uso, tenha cuidado, pois os vapores são tóxicos
Lâminas de bisturiThermoFisher Scientific08-916-5B No. 11
BisturiThermoFisher Scientific08-913-5
Pinça finaServiçosde microscopia eletrônica78354-119
Micro Tubo (1,7 mL)PGC Scientifics505-201
Fosfato tamponado salinaSigmaD8537PBS
PipetaVWR52947-948descartável, pipeta de transferência de 3ml
Triton X-100Boehriner Mannheim789 704Diluir a 0,1% do estoque Soro de
cabraGibco16210-064Diluir a 2% em solução PBS
Camundongo monoclonial anti-ck7 Queratina 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30)ThermoFisher ScientificMS-1352-RQ
Coelho Anti-CD31 anticorpoAbcamab28364
emissor verde (520 nm) fluorocromo InvitrogenA11017Alexa-Fluor 488
emissor infravermelho (652 nm) fluorocromoInvitrogenA21072Alexa Fluor 633
Álcool etanol 200 provaPharmco-Aaper111000200Diluir para concentrações mais baixas usando PBS conforme necessário
Solução-1Visikol Inc.Visikol Histo-1
Solução-2Visikol Inc.Visikol Histo-2
Skyes-Moore câmaras BellCoGlass Inc.P / N 1943-11111
agulha de calibre 25ThermoFisher Scientific14-826AABD Precision Glide Needes
Seringa de 3 mLThermoFisher Scientific14-823-40BD seringa descartável
PDMS folhas de siliconeMcMaster-CarrP / N 578T31
microscópio confocalNikon Inc.Nikon C1 Microscópio Confocal
Software de deconvoluçãoMedia CyberneticsAutoQuant X22
Fiji softwarede processamento de imagem livre, software de código aberto  disponível em https://fiji.sc
HematoxilinaLeica Biosystems3801570Componente 1 da SelecTech H& Sistema de coloração
E Eosina alcoólicaLeica Biosystems3801615Componente 2 da SelecTech H& Sistema de coloração
E Tampão AzulLeica Biosystems3802918Componente 3 da SelecTech H& Sistema de coloração E
Aqua Define MCXLeica Biosystems3803598Componente 4 da SelecTech H& Sistema de coloração E
Sistema de detecção imuno-histoquímicaThermoFisher ScientificTL-125-QHDUltraVision Quanto Sistema de detecção HRP DAB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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