Um método de Optogenetic para controlar e analisar os padrões de expressão de Gene em interações de célula para célula
22 de março de 2018
Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a transferência de célula a célula de informação oscilatória pelo controle de optogenetic e viver monitoramento da expressão do gene. Essa abordagem fornece uma plataforma única para testar um significado funcional dos programas de expressão do gene dinâmico em sistemas multicelulares.
O objetivo geral deste experimento é observar a transferência de informações oscilatórias célula a célula por controle optogenético e monitoramento ao vivo da expressão gênica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave de como as células se comunicam umas com as outras através da via de sinalização Notch, particularmente de como as células transmitem as informações oscilatórias umas às outras. A principal vantagem dessa técnica é que podemos controlar e monitorar a dinâmica da expressão gênica com altíssima precisão.
Demonstrando o procedimento estará Akihiro Isomura, um pesquisador do meu laboratório que desenvolveu essa nova tecnologia. Para transfectar vetores de plasmídeo de módulos optogenéticos baseados em Tol2 junto com o vetor de expressão da transposase em células C2C12, primeiro conte as células tripsinizadas com um contador de células. Placa de 50.000 células C2C12 por poço em uma placa de 12 poços um dia antes da transfecção.
Em seguida, co-transfect 0,375 microgramas de vetores optogenéticos baseados em Tol2, 0,125 microgramas de um vetor de seleção de drogas e 0,5 microgramas do vetor de expressão da transposase usando o reagente de lipofecção. Tripsinize as células transfectadas e coloque-as em placas de cultura de 100 milímetros um dia após a transfecção. Troque o meio de cultura pelas células transfectadas por meio de cultura suplementado com 100 miligramas por mililitro de higromicina.
Cultive as células por três dias para eliminar as células não transfectadas. Observe que a mudança de mídia não é necessária. Em seguida, tripsinize as células transfectadas e purifique uma população de células que expressam proteínas fluorescentes para seleção, classificando as células receptoras e fotossensíveis, conforme detalhado no protocolo de texto.
Configure dois tipos de incubadoras com ou sem fontes de luz para uma condição induzida por luz ou uma condição escura. Use um medidor de luz para configurar a intensidade da luz de um transiluminador de LED azul. Meça a intensidade da luz depois de fechar a porta.
Programe os tempos e a duração da iluminação da luz carregando um script de controle em um microcontrolador de placa única que permite programações programáveis para iluminação. Conte as células tripsinizadas com um contador de células e coloque 100.000 células emissoras fotossensíveis carregando pAI218 e pAI170 em placas de cultura plástica de 35 milímetros de diâmetro. Coloque os pratos em incubadoras separadas para condições escuras e claras.
Após a montagem dos pratos, mantenha as portas das incubadoras fechadas até a coleta dos lisados celulares. Um dia e meio após o revestimento, inicie a iluminação da luz. Não exponha as células à luz descontrolada para evitar fotoestimulação indesejável.
Então, faça esta etapa sem abrir a porta. Observe que abrir a porta aqui é apenas para demonstração. Cerca de dois dias após o recozimento, mova os pratos de amostra das incubadoras para o gelo em intervalos de 30 minutos e inicie a preparação dos lisados celulares para análise posterior.
Para monitorar as respostas celulares após a estimulação óptica por PMT em tempo real, primeiro tripsinize e conte o número de células emissoras e receptoras com métodos padrão. Preparar uma suspensão de volume total de um mililitro de 25 000 células receptoras e 125 000 células emissoras. Plaquear as células misturadas em cada poço de placas pretas de 24 poços com meio de cultura contendo luciferina de um milimolar.
Analise as células em um leitor de placas para o ensaio de luciferase para confirmar se os sinais de saída não são muito altos para o sistema de gravação. Em seguida, coloque a placa no sistema de gravação e inicie um programa de gravação. Por exemplo, inicie a iluminação da luz 18 horas após definir a gravação.
Para imagens em tempo real de respostas de célula única sob o controle de perturbação optogenética, primeiro coloque 50.000 células receptoras e 250.000 células remetentes em pratos de 27 milímetros de diâmetro com base de vidro e 35 milímetros de diâmetro. Certifique-se de que as proporções de mistura e o número total de células estejam ajustados corretamente. Um dia após o revestimento, troque o meio por dois mililitros do meio de gravação.
Coloque a placa à base de vidro em um microscópio invertido equipado com uma câmara ambiental a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Configure uma câmera CCD resfriada. Certifique-se de que a temperatura do sensor CCD seja resfriada até o valor de destino.
Defina parâmetros para janela de lapso de tempo multidimensional no software de aquisição automática para capturar imagens com intervalos de cinco minutos e mais de 288 vezes. Na janela de lapso de tempo multidimensional, selecione um canal de luminescência. Certifique-se de que o modo de leitura esteja definido para o modo de leitura lenta de 50 kilohertz, que é crítico para reduzir os ruídos de leitura para detectar luz bioluminescente fracamente emitida.
Na janela de lapso de tempo multidimensional, selecione os canais de fluorescência. Certifique-se de que o modo de leitura esteja definido para o modo rápido de um megahertz para reduzir o tempo necessário para a imagem de fluorescência. Por fim, defina o binning dois por dois com exposição de 400 milissegundos.
Em seguida, selecione uma guia de diário para configurar programações para estimular as células com iluminação periódica de luz azul. Clique no botão de adição para adicionar uma nova configuração de diário. Selecione um arquivo de diário em uma caixa de diário, escolha vários pontos de tempo e defina valores nas caixas de ponto inicial e intervalo para agendar a estimulação.
Certifique-se de que o arquivo de diário especificado inclua protocolos sequenciais para selecionar iluminação, abertura do obturador, atraso, fechamento do obturador e atraso. Em seguida, configure horários para estimular as células com iluminação periódica de luz azul. Por fim, inicie a gravação de lapso de tempo clicando no botão Adquirir.
Por fim, extraia traços de célula única de canais de luminescência de filmes com lapso de tempo, conforme descrito no protocolo de texto. Os resultados representativos dos ensaios optogenéticos emissor-receptor são mostrados aqui. As células emissoras fotoinduzíveis produziram padrões oscilatórios de expressão do ligante Delta na presença de iluminação periódica de luz azul, como esperado.
Quando as células receptoras são co-cultivadas com as células emissoras fotossensíveis e expostas à iluminação de luz repetitiva, um sistema de registro de bioluminescência em tempo real detecta respostas cíclicas das células receptoras em várias condições de proporções de mistura. Além disso, a microscopia de lapso de tempo com iluminação de luz repetitiva também revela as respostas sincronizadas das células receptoras no nível de célula única. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular explorarem como a informação dinâmica da expressão gênica é transferida nas interações célula-célula.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para analisar a transferência célula a célula de informação oscilatória usando controle optogenético e monitoramento em tempo real da expressão gênica. O método permite um controle e observação precisos da dinâmica de expressão gênica, fornecendo insights sobre a comunicação celular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Optogenética
Fundamentos
- Entender a comunicação celular é crucial para decifrar sistemas multicelulares.
- A via de sinalização Notch desempenha um papel significativo nas interações celulares.
- A transferência de informação oscilatória é um aspecto-chave da dinâmica celular.
- Ferramentas optogenéticas permitem a manipulação precisa da expressão gênica.
Objetivo do Estudo
- Observar como as células se comunicam através de sinais oscilatórios.
- Investigar a dinâmica de expressão gênica em um contexto multicelular.
- Desenvolver uma plataforma para testar a significância funcional de programas de expressão gênica.
Métodos Utilizados
- Transfecção de vetores plasmídeos em células C2C12.
- Uso de módulos optogenéticos baseados em Tol2.
- Monitoramento em tempo real da dinâmica de expressão gênica.
- Técnicas de contagem e placagem de células para transfecção.
Principais Resultados
- Transfecção bem-sucedida de módulos optogenéticos em células-alvo.
- Demonstração da transferência de informação oscilatória entre células.
- Alta precisão no controle da dinâmica de expressão gênica.
- Insights sobre o papel da sinalização Notch na comunicação celular.
Conclusões
- Este protocolo fornece uma ferramenta valiosa para estudar a comunicação celular.
- O controle optogenético melhora nossa compreensão da dinâmica de expressão gênica.
- As descobertas podem ter implicações para a compreensão de sistemas multicelulares.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This optogenetic method enables precise temporal control and live monitoring of gene expression in cell-to-cell interactions, addressing a key challenge in deciphering dynamic signaling mechanisms. By revealing how oscillatory Notch signaling entrains intrinsic cellular rhythms through frequency tuning and phase shifting, the approach provides mechanistic de-risking for target validation in multicellular systems. It supports predictive confidence in early discovery by linking dynamic gene expression programs to functional intercellular communication.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing how periodic inputs of signaling pathways entrain intrinsic oscillations at single-cell resolution.
- Operational Value: Enables functional target validation through optogenetic perturbation and real-time readout of gene expression dynamics.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying how dynamic signaling features influence cellular response patterns in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated sender-receiver coculture systems for downstream screening of modulators affecting oscillatory signal transfer.
- Operational Value: Standardizes light-controlled stimulation protocols and luminescent readouts for reproducible, quantitative assay outputs.
- Scalability: Facilitates platform reuse across signaling pathways by decoupling optogenetic control from specific genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects dynamic gene expression measurements in vitro to potential biomarker alignment in multicellular disease models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed oscillatory patterns are drivers or passengers in pathogenic signaling, reducing ambiguity in target selection.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating whether modulating signal dynamics alters phenotypic outcomes in receiver cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to assay readiness for lead identification, particularly when dynamic signaling behavior is a key determinant of target validity.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of how oscillatory information transfer contributes to cellular decision-making in Notch and similar pathways.
- Screening: Enables assay development for compounds that disrupt or enhance frequency-specific signal transmission between cells.
- Analytics: Provides quantitative time-series data on luminescence and fluorescence readouts, enabling statistical comparison of entrainment efficacy across conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies when oscillatory dynamics correlate with functional states in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular optogenetic platform applicable to multiple signaling systems beyond Notch, increasing long-term ROI.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by resolving mechanistic ambiguity in how dynamic gene expression programs influence intercellular communication.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible control over temporal stimulation and real-time monitoring, reducing variability in complex coculture systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of whether targeting dynamic signaling features yields measurable phenotypic effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets where signal dynamics, not just static expression, are functionally relevant.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, live-cell imaging, and luciferase-based reporter systems.
- Depends on access to programmable light sources, environmental chambers, and plate readers capable of low-light luminescence detection.
- Necessitates standardization of light intensity, timing schedules, and cell mixing ratios across teams for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the system to primary cells or in vivo models due to differences in transfection efficiency and light penetration.
- Practical limitations include potential phototoxicity from prolonged blue-light exposure and signal saturation in high-density cocultures, as noted in the protocol’s optimization steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Generation of Stable Cell Lines by the Tol2 System
2:07
Evaluation of Photo-sensitivity of Engineered Cells at the Population Level
3:31
Dynamic Sender-receiver Assay at the Population Level and at the Single-cell Level
6:47
Results: Analysis of Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions
7:35
Conclusion
