Artigo de método

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para identificar compostos que interrompem a ligação do ligante de Chemokine fluorescente-etiquetadas CXC 12 a CXC Chemokine Receptor 4

DOI:

10.3791/57271

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10 de março de 2018

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1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

Neste artigo

Resumo

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Um fluxo de ensaio de ligação celular baseados em citometria é descrito que é usado principalmente como uma ferramenta de triagem para identificar compostos que inibem a ligação de um ligante de chemokine CXC fluorescente etiquetada 12 (CXCL12) para o receptor do chemokine CXC 4 (CXCR4).

Resumo

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Como alvo farmacológico dos receptores de acoplado à proteína G (GPCRs) é de grande importância para a saúde humana, como disfuncional GPCR mediada por sinalização contribui para a progressão de muitas doenças. O par ligante/receptor ligante de chemokine CXC 12 (CXCL12) / receptor do chemokine do CXC 4 (CXCR4) tem gerado interesse clínico significativo, por exemplo, como um alvo em potencial para o tratamento de câncer e doenças inflamatórias. Pequenas moléculas, bem como anticorpos terapêuticos que especificamente alvo CXCR4 e inibem a função do receptor, portanto, são considerados valiosas ferramentas farmacológicas. Aqui, um fluxo baseados em citometria celular ensaio que permite a identificação de compostos (por exemplo, pequenas moléculas) que revogará CXCL12 vinculação de CXCR4, é descrita. Essencialmente, o ensaio se baseia na competição para receptor vinculação entre uma quantidade fixa de CXCL12 fluorescente etiquetadas, o agonista chemokine natural para CXCR4 e compostos sem rótulo. Portanto, é evitar a utilização indesejável de sondas radioactivamente marcadas neste ensaio. Além disso, as células vivas são usadas como a fonte do receptor (CXCR4) ao invés de preparações de membrana celular. Isto permite uma fácil adaptação do ensaio para um formato de chapa, o que aumenta a taxa de transferência. Este ensaio tem demonstrado ser um ensaio de descoberta valiosa medicamento genérico para identificar compostos CXCR4-direcionamento. O protocolo pode provavelmente ser adaptado para outros GPCRs, pelo menos se fluorescente etiquetadas ligantes estão disponíveis ou podem ser gerados. Conhecimento prévio sobre as vias de sinalização intracelulares que são induzidas após a ativação destas GPCRs, não é necessário.

Introdução

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G receptores (GPCRs) são proteínas de superfície celular que podem ser ativadas por ligantes extracelulares (por exemplo, peptídeos, hormônios proteicos, aminas), desse modo regular muitos fisiológicos e do desenvolvimento de processos1. Quando um agonista ocupa seu bolso de vinculação GPCR, a mudança conformacional induzida da proteína do receptor promove a ligação de proteínas intracelulares associadas do receptor via G, consistindo de Gα- PIB e Gβγ subunidades. A subsequente troca de GTP para PIB sobre os resultados de subunidadeα G na dissociação das subunidades de proteína G (Gα-GTP e G<....

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Protocolo

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1. a manutenção da cultura de pilha

Nota: Todos os passos descritos em 1 e 2 são realizados em condições estéreis em um fluxo laminar.

  1. Desenvolvem-se células em frascos de cultura T75 em 37 ° C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada.
    Nota: Neste ensaio, são utilizadas células Jurkat (isto é, células de humanas leucêmicas dos linfócitos T que expressam endogenamente CXCR417). Expressão do CXCR4 na superfície da célula deve ser avaliado ao longo do cultivo de células através da citometria de fluxo. Uma descrição do procedimento de citometria de fluxo e reagentes para determinar os nívei....

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Resultados

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O fluxo de trabalho geral do ensaio vinculação é apresentado na figura 1A. Uma ilustração do tipo de dados de citometria de fluxo obtidos para tipos diferentes de amostra em um experimento de padrão (ou seja, o controlo negativo, controle positivo e amostra experimental) está representada na figura 1Be um layout de placa possível para executar o ensaio em um formato de placa de 96 poços é dada na Fig.......

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Discussão

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Ensaios obrigatórios de concorrência em comparação a outros tipos de ensaios obrigatórios (ou seja, a vinculação de saturação e experimentos de cinética de ligação), são mais adequados para fins de triagem. Na verdade, eles permitem avaliação de grandes lotes de compostos sem rótulo, por exemplo, pequenas moléculas, marcando sua capacidade de interferir com a ligação de uma quantidade fixa de um ligante-receptor rotulada. Compostos que se ligam a outros locais do receptor do que o ligante rotulado podem desperce.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Os autores gostaria de agradecer Eric Fonteyn excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo KU Leuven (conceder n. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, conceder n. G.485.08) e a Fondation Dormeur Vaduz.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BD FACSCanto IIBecton DickinsonNão aplicávelDispositivo de citometria de fluxo
BD FACSDIVA Software
BD FACSArrayBecton DickinsonNão aplicávelDispositivo de citometria de fluxo
BD FACSArray System Software
Graphpad PrismGraphpadpacote de software usado para análise de regressão não linear na Figura 2 e Figura 3
FlowJoA FlowJo é agora uma subsidiária integral da BD.
Vi-CELLBeckman CoulterAnalisador de viabilidade celularnão aplicável
Sigma 3-18 KSSigmaCentrífuganão aplicável
AMD3100SigmaA5602-5mgantagonista CXCR4 específico
MaravirocMedicamento antirretroviral Pfizer, antagonista CCR5, disponível para pesquisa em Selleckchem (cat # S2003), Sigma (cat # PZ0002)
h-SDF1a (AF647)ALMACCAF-11-B-01CXCL12 marcado com fluorescência, CXCL12AF647
Soro Fetal Bovino (FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
Albumina de Soro Bovino (BSA)SigmaA1933-25G
HBSS (10x), cálcio, magnésio, sem vermelho de fenolGibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1M)Gibco (Life Technologies)15630-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Células JurkatATCC
Reservatório de reagente PPSigmaBR703411
Filtro de fluxo rápido: 0.2 µ m aPESThermo Scientific566-0020
Placa de microtitulação de esterilina, 96 poços, fundo em U, transparenteTubos Thermo Scientific611U96
Falcon, 50mlGreiner Bio-One227 261
Frasco de cultura de tecidos (T75)Corning353024
HEPES (1M)Gibco (Life Technologies)14065-049

Referências

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  1. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  2. Milligan, G., Kostenis, E.

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