Formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores para acessibilidade de cromatina medida em células de mamíferos

Resumo

A plasticidade da arquitetura nuclear é controlada por mecanismos epigenéticos dinâmicos, incluindo não-codificantes RNAs, DNA methylation, nucleossoma reposicionamento, bem como composição de histona e modificação. Aqui descrevemos um protocolo de isolamento Formaldehyde-Assisted de elementos normativos (FAIRE) que permite a determinação de acessibilidade de cromatina de forma reprodutível, barata e simples.

Resumo

Expressão gênica adequadas em resposta a sinais extracelulares, ou seja, específicos do tecido e linhagem genética da transcrição, criticamente depende altamente definidos Estados de organização da cromatina. A dinâmica arquitetura do núcleo é controlada por vários mecanismos e formas dos programas de saída transcricional. É, portanto, importante determinar a acessibilidade de cromatina locus específico de forma confiável de preferência independente de anticorpos, que podem ser uma fonte potencialmente confundimento de variabilidade experimental. Acessibilidade de cromatina pode ser medida por vários métodos, incluindo o ensaio de isolamento Formaldehyde-Assisted de elementos normativos (FAIRE), que permitem a determinação de acessibilidade geral da cromatina em um número relativamente baixo de células. Aqui descrevemos um protocolo FAIRE que permite a identificação simples, confiável e rápida das regiões genômicas com uma ocupação de baixa proteína. Neste método, o DNA é covalentemente ligado às proteínas da cromatina usando formaldeído como agente de reticulação e cortado em pedaços pequenos. O DNA gratuito é depois enriquecido usando extração fenol: clorofórmio. A proporção de DNA livre é determinada pela reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) ou sequenciação de ADN (DNA-seq) em comparação com uma amostra de controle que representa o DNA total. As regiões com uma estrutura mais flexível de cromatina são enriquecidas na amostra grátis do DNA, permitindo assim a identificação de regiões genômicas com baixa compactação da cromatina.

Introdução

O DNA genômico das células eucarióticas é hermeticamente embalado para os nucleossomas, que precisa ser removido ou remodelada para permitir a interação com o DNA de outras proteínas. A ativação transcricional de um gene, geralmente, resulta em uma configuração mais aberta da sua estrutura de partícula, particularmente no nucleossoma + 1¹, para facilitar a transcrição pela RNA polimerase. Também, regiões reguladoras tais como promotores e potenciadores de sofrem mudanças dinâmicas em sua acessibilidade de cromatina para permitir a interação com modificadores de cromatina ou de fatores de transcrição². Várias abordagens têm sido desenvolvidos para identificar essas regiões livres de nucleossoma. Estes incluem a sensibilidade de nucleases como DNase eu³ ou nuclease micrococcal⁴, que só pode acessar o DNA quando ele não é firmemente disposto ao redor os nucleossomas. Outros métodos para a identificação da cromatina aberta ou DNA livre incluem a integração mediada por transposase de elementos retrotransposable (ensaio para Transposase-acessível da cromatina, ATAC)⁵, ou cromatina (ChIP) de imunoprecipitação usando anticorpos contra histonas. O método FAIRE não é baseado na capacidade de uma enzima para alcançar o DNA ou a ligação de um anticorpo para uma proteína em particular, mas em vez disso depende a purificação das regiões nucleossoma-livre por uma extração de fenol: clorofórmio^6,7. Neste método, o DNA é covalentemente a proteínas da cromatina pelo formaldeído de agente de reticulação e é depois cortado em pequenos pedaços por sonication. Regiões de cromatina firmemente embaladas terá ligações cruzadas de DNA/proteína abundantes, enquanto regiões de DNA com nenhum ou poucos nucleosomes terá pouca ou nenhuma complexos de DNA/proteína de ligação cruzada. Uma extração de fenol: clorofórmio permite a purificação do DNA livre na fase aquosa, enquanto a quitosana de DNA para as proteínas é capturado na fase orgânica fenol ou interfase aquosa-orgânica juntamente com as proteínas não-quitosana. A quantificação deste DNA livre em comparação com uma referência de amostra de DNA total permite a identificação das regiões da cromatina livre. O método FAIRE pode ser usado para a caracterização das regiões genômicas individuais conforme descrito aqui, mas também é adequado para a identificação de acessibilidade de todo o genoma da cromatina quando acoplado ao sequenciamento profundo, conforme descrito em diferentes modelos^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. os resultados obtidos por outros métodos como ATAC-seq e FAIRE-seq em grande parte se sobrepõem a¹⁴. O método FAIRE é um muito robusto, barato e fácil de executar o método para identificar regiões livres de nucleossoma. Ao contrário de outros métodos, que não exige experiências piloto para determinar o nível apropriado de digestão conforme exigido por nucleases (DNase-seq, seq-MNase) ou transposases (ATAC-seq) e discutidos detalhadamente em uma recente revisão de¹⁵. Os únicos parâmetros para ser ajustado são o sonication condições e em alguns casos, o tempo de fixação. Este artigo descreve um protocolo simples que é apresentado esquematicamente na Figura 1 , e que não exige qualquer equipamento especial que não seja um sonicador. O protocolo pode ser executado em um tempo razoavelmente curto e faz FAIRE um método fácil e confiável para testar a acessibilidade de cromatina em um número de diferentes tipos de células variando de pulmão de células¹¹ de células primárias, obtidas a partir de fígados de rato¹⁶.

Protocolo

1. dia 1: Cultura de células

1. Cultura de células a serem analisados para a quantidade desejada. Mídia e as condições de cultura celular depende dos tipos de célula sob investigação.
   Nota: Em princípio, qualquer célula eucariótica é passível de uma análise de acessibilidade de cromatina de FAIRE. Para este experimento, 4 x 10⁶ HEK-293T células são semeadas em um prato único de 10 cm em meio DMEM suplementado com 10% (v/v) FBS e 1% (p/v) penicilina/estreptomicina e incubados a 5% de CO₂ e 37 ° C por 24 h até as células atinjam a confluência de 70-80% (~ 8 x 10 ⁶ células por prato).

2. dia 2: Reticulação de formaldeído e colheita de célula

Cuidado: Formol é altamente tóxico e deve ser sempre utilizada sob uma coifa. Use roupas de proteção (luvas e jaleco). Descarte os resíduos adequadamente.

1. Adicione formol diretamente para o meio de cultura celular em uma coifa para atingir uma concentração final de 1% (v/v) (270 µ l de formol 37% (v/v) de 10 mL de meio de cultura celular). Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (20-25 ° C) e matou as placas manualmente cada 2 min.
   Nota: O tempo de reticulação pode ser ajustado de acordo com o tipo de célula. Para a maioria das linhas celulares, 10 min de reticulação é adequada. Para tecidos, incubação do tempo pode ser necessário para permitir a fixação de todas as células.
2. Adicionar glicina a uma concentração final de 0,125 M para saciar o formaldeído (adicionar 500 µ l de um estoque de glicina de 2,5 M a 10 mL de meio de cultura). Incubar durante 5 min à temperatura ambiente e matou a cada 2 min.
3. Lavar as células 3 x com gelo frio PBS (8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KCl, 1,44 g/L, Na₂HPO₄ · 2 H₂O, 0,24 g/L KH₂PO₄, ajustar o pH para 7,4 com HCl ou NaOH). Aspire o meio e lavar diretamente na placa de cultura de células ou frasco, adicionando 10 mL de PBS. Repeti esta etapa duas vezes, sendo muito cuidadoso no caso de células frouxamente aderentes como HEK-293T. Adicione PBS cuidadosamente para o lado do prato para evitar o desprendimento das células.
4. Após a terceira lavagem, Ressuspender as células em 1 mL de PBS frio gelo e transferir para um tubo de reação de 1,5 mL no gelo. Use um raspador de célula para separar as células quando necessário.
   Nota: Ao iniciar com um material limitado, use tubos de ligação a DNA baixos para evitar a perda de amostra durante o procedimento.
5. Centrifugue por 5 min a 300 x g a 4 ° C em uma centrífuga de mesa refrigerada. Desprezar o sobrenadante aspirando-lo cuidadosamente.

3. pilha Lysis e fragmentação da cromatina

1. Ressuspender as células em tampão de Lise FAIRE de 1 mL (1% (p/v), 10 mM de EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 10 µ g/mL leupeptin, 10 µ g/mL aprotinina, 2 mM PMSF) e ressuspender as células pipetando cuidadosamente subindo e descendo várias vezes. Incube durante 20 min no gelo. Armazene as amostras a-80 ° C a esta etapa, se necessário.
2. Proceda à sonicação a quitosana DNA de cisalhamento-lo para um tamanho médio de 200-300 bp. As configurações específicas do sonicador devem ser determinadas para cada fonte de amostras e o dispositivo usado sonication. Em qualquer caso, certifique-se de que o DNA é cortado com eficiência. Um passo de otimização para a tosquia de DNA é descrito no passo 5.14. Fixe as amostras no gelo durante sonication para evitar o aquecimento da amostra.
3. Centrifugar a amostra por 15 min e 13.000 x g a 4 ° C.
4. Transferi o sobrenadante para um novo tubo de reação. Dividi as amostras em 100 alíquotas µ l. Armazene as amostras a-80 ° C, se necessário.
   Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto.

4. de-reticulação de controle DNA

1. Leve um 100 µ l alíquota da etapa 3.4 para reverter o crosslink e para ser usado como uma referência para o DNA total. Adicionar 10 µ l de RNase-A (10 mg/mL) e incubar durante 1 h a 37 ° C.
2. Adicione 10 µ l de Proteinase K (20 mg/mL). Use um thermo-bloco programável para incubar por 4 h a 37 ° C e em seguida para 6 h a 65 ° C para decompor as proteínas e inverter as ligações cruzadas. Finalmente, mantenha as amostras em 4 ° C até que o protocolo seja retomado e em seguida, avance para o passo 5.
   Nota: Outros protocolos FAIRE usam cromatina amostras de células que não tenham sido quitosana como referência, abolindo assim a necessidade de reticulação¹¹. O fato de que estas amostras não são quitosana poderia levar a diferenças na eficiência sonication ou na estabilidade do DNA, portanto, o uso de amostras de referência totais do DNA que sofreram o mesmo procedimento como as amostras de teste é mais preciso.

5. dia 3: Fenol: clorofórmio purificação do DNA

1. A não-de-ligação cruzada leve alíquota da etapa 3.4. Adicionar 10 µ l de RNase-A (10 mg/mL) e incubar durante 1 h a 37 ° C.
2. O passo do formulário alíquota não-de-quitosana 5.1 e a amostra de quitosana da etapa 4.2 e prosseguir em paralelo. Adicione H₂O para alcançar um volume final de 300 µ l.
3. Adicione 300 µ l de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio (25:24:1) em uma coifa e vórtice vigorosamente.
   Cuidado: O fenol é corrosivo e tóxico e deve ser utilizado sempre sob uma coifa. Usar roupas de proteção (luvas e jaleco), verifique se os tubos de reação são bem fechados e descartar os resíduos adequadamente.
4. Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.
5. Transferi com cuidado, 280 µ l da fase aquosa superior para um novo tubo de reação. Certifique-se para não levar todos os restos do período do intérfase, que também contém proteínas. Descarte a fase inferior restante como resíduos de solventes orgânicos.
6. Repita as etapas de 5.3 a 5.5 e transferir cuidadosamente 270 µ l da fase aquosa superior para um novo tubo de reação.
7. Adicione 270 µ l de clorofórmio em uma coifa e vórtice vigorosamente.
   Nota: Este passo é usado para eliminar qualquer fenol restante da amostra.
8. Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.
9. Transferi com cuidado, 250 µ l da fase aquosa superior para um novo tubo de reação, tomando cuidado para não carregar todos os restos da interfase. Descarte a amostra restante como resíduos de solventes orgânicos.
10. Adicione 25 µ l de 5 M de NaCl e 250 µ l de isopropanol. Adicione 5 µ l de glicogênio (20 mg/mL) como o portador de DNA. Misture bem invertendo-se os tubos e incube por 20 min em temperatura ambiente. Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C, para precipitar o DNA.
11. Lave o sedimento de DNA com 400 µ l de etanol 70% (v/v). Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.
12. Aspire o sobrenadante cuidadosamente e deixar o sedimento secar por 10 min à temperatura ambiente. Resuspenda em buffer de TE 100 µ l (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA).
13. Incube a amostra de DNA não-de-quitosana grátis por 4 h a 65 ° C para remover as referências cruzadas entre ADN. Armazenar as amostras a-20 ° C.
14. Quantificar a quantidade de DNA usando um espectrofotômetro e executar uma alíquota para verificar o tamanho do fragmento em um gel de agarose 2% (p/v). Ajustar o tempo de corte e intensidades, dependendo dos resultados da análise de tamanho de DNA por agarose gel eletroforese, para obter um tamanho médio de 200-300 bp.

6. determinação do livre Versus Total DNA por PCR em tempo Real quantitativo (qRT-PCR)

1. A proporção de DNA livre nucleossoma (na seguir referida como DNA gratuito) versus total de DNA é determinada por qRT-PCR^17,18. As amostras também podem ser analisadas quantitativamente por microarray hibridização ou sequenciamento profundo para determinações de todo o genoma.
2. Projeto qPCR cartilhas para as regiões a serem testadas e para controles positivos e negativos.
   Nota: Controlos positivos apropriados são primeiras demão situadas no promotor dos genes transcritos ativamente das tarefas domésticas tais como ACTB, GAPDH, TPI1 ou TUBA1A (codificação β-actina, GAPDH, TPI ou α-tubulina). Apropriados controles negativos são encontrados em regiões de heterocromatina ou gene desertos. Outros controles negativos apropriados podem ser projetados em regiões genômicas adjacentes para o locus dinamicamente regulamentado sob investigação de Controlarar para diferenças de número de cópia local (tabela 1).
3. Diluir as amostras de DNA para uma concentração final de 10 ng / µ l de tampão TE e considerar o fator de diluição para os cálculos finais (ver passo 6.5).
4. Configurar uma reação qPCR em triplica em uma placa de 96 poços, com o seguinte mix de reação por alvéolo: modelo DNA: 20 ng (2 µ l), para a frente da primeira demão 200 nM (0,4 µ l de um estoque de 5 µM), primer reverso 200 nM (0,4 µ l de um estoque de 5 µM) , um comercial pronto para usar a mistura de reação contendo corante verde (5 µ l de um estoque de 2 x) e H₂O a 10 µ l.
5. Executar em um dispositivo de qPCR em tempo real, usando o modo de quantificação absoluta e determinar o Ct das amostras com os pares diferentes da primeira demão. Calcule a taxa de recuperação do DNA livre de DNA total para cada primeira demão usando a seguinte fórmula, tendo em conta os factores de diluição da etapa 6.3:
   
   Resultados representativos e um cálculo de exemplo são dadas na tabela 2.
6. Para compensar as diferenças entre as amostras, normalize para a taxa de recuperação do controle positivo:
   

Resultados

Usamos o método FAIRE para medir diferenças na acessibilidade de cromatina de genes II MHC classe nas células HEK293T como publicado¹⁹. MHC classe II codificação genes são expressos em células apresentadoras (APCs), constitutivamente ou em resposta a citocinas sinalização²⁰. A expressão de genes MHCII é impulsionada por um complexo ativador que se liga a elementos específicos de DNA, denominados caixas XY, localizadas no promotor e potenciadores destes genes^21,22. Isso se reflete no nível de cromatina, como revelado pela nossa análise FAIRE de regiões selecionadas do MHC classe II HLA-DPB1 e HLA-DMA. Estes experimentos mostraram que a cromatina é aberta nas regiões englobando as caixas XY, enquanto é mais compacto em organismos gene (Figura 2).

Por exemplo, para os cálculos, neste particular experimento, dilui-se o total de DNA 10 vezes (factor de diluição 10), e a amostra de DNA livre não foi diluída (factor de diluição 1) para o qRT-PCR. O Cts obtidos para as diferentes regiões testadas e os cálculos para obter os rácios de recuperação final e recuperação relativa rácios são listados no tabela 2. Estas relações de recuperação relativa foram obtidas usando o promotor ACTB como controlo positivo. Observe que esses cálculos são para um das repetições usadas para gerar os resultados mostrados na Figura 2.

Em um contexto diferente, acessibilidade de cromatina foi testada em um modelo de expressão gênica inducible. Neste caso, mudanças rápidas de compactação da cromatina, em resposta ao fator de necrose tumoral estímulo pró-inflamatórias (TNF) foram medidas. Células HeLa foram deixadas não tratada ou estimulado com TNF por 1h, seguido de FAIRE para medir a compactação da cromatina para a expressão de controle de região promotora do gene da TNF-responsivo citocinas interleucina 8 (IL8) de codificação. Estes resultados mostraram uma acessibilidade de cromatina fortemente aumentado no IL8 promotor de TNF-estimulou as células (Figura 3). A acessibilidade no promotor IL-8 após estimulação TNF é ainda maior do que a encontrada no promotor ACTB mostrando uma remodelação dramática cromatina nesta região reguladora. Como a taxa de recuperação obtida neste caso é maior do que o obtido na região como controlo positivo (promotor ACTB) a proporção relativa de recuperação é maior do que um.

Figura 1: fluxo de trabalho The FAIRE. As células são quitosana diretamente no frasco de cultura celular ou prato adicionando formol (A). Após têmpera do formaldeído, as células são lavadas três vezes com PBS frio de gelo (B) e transferidas para um tubo de reação, onde são resuspended em tampão de Lise FAIRE e lisados para distorcer o DNA (C). Uma alíquota da cromatina extraída é de quitosana por aquecimento a 65 ° C, para obter a referência de DNA total (D), e depois o DNA gratuito é extraído usando fenol: clorofórmio, tanto a quitosana e as alíquotas de quitosana (E). Finalmente, o DNA é quantificado, e a razão de livre vs total que DNA é calculada (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: determinação da acessibilidade de cromatina no gene MHC classe II cluster em células HEK293T. HEK293T células foram analisadas por FAIRE. A relação entre livre contra DNA total (i. e., a proporção relativa recuperação) foi determinada para o promotor do gene ACTB como um controle positivo, uma região de heterocromatina na Chr. 12 como controle negativo e as regiões reguladoras e corpos de gene do MHC classe II genes HLA-DMA e HLA-DPB1. A parte superior mostra uma representação esquemática do locus e as posições dos primers. Barras de erro representam desvios-padrão de duas repetições biológicas medidas em triplica. A figura foi modificada de um relatório publicado¹⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: alterações de acessibilidade de DNA no promotor IL8 em resposta ao tratamento de TNF. Células HeLa foram estimuladas com TNF (20 ng/mL) para 1 h e analisados por FAIRE. A relação entre livre versus total de DNA foi determinado para o promotor de ACTB (controle positivo), uma região de heterocromatina na Chr. 12 (controle negativo) e o promotor IL8. Barras de erro representam erros-padrão da média (SEM) de três repetições biológicas medidas em duplicatas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: otimização das condições sonication. Extraído de 293T células de cromatina foi sonified usando um sonicador concentrado com tubos apropriados (Tabela de materiais). A cromatina foi lisada para a hora indicada com repetições de 30 s, com as seguintes configurações: potência de pico 150, factor de serviço de 15, ciclos por explosão 500, seguido de potência de pico de 30 s: 2.5, o factor de serviço de 15, ciclos por explosão 500. A cromatina resultante foi de-quitosana, purificados por extração fenol: clorofórmio e carregado em um gel de agarose 2%. Manchado de gel de brometo de etídio é mostrado, e as posições dos marcadores de peso molecular são indicadas em bp. Neste experimento, obteve-se o tamanho ideal da cromatina (200-300 bp) depois de 20 min de sonication. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Primeira demão	Sequência de
ACTB-promotor-F	AAAGGCAACTTTCGGAACGG
ACTB-promotor-R	TTCCTCAATCTCGCTCTCGC
12. Chr. controle negativo-F	ATGGTTGCCACTGGGGATCT
12. Chr. controle negativo-R	TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA
HLA-DMA-XY-caixa-F	CATCAGTCACTGGGGAGACG
HLA-DMA-XY-caixa-R	GCTTCCCAGCCCAGTTACAT
HLA-DMA-5'-F	GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA
HLA-DMA-5'-R	AGCTGCTATGTGTGGTTGGT
HLA-DMA-3'-F	TGGGGACCTAGTTAGGGAGC
HLA-DMA-3'-R	AGATCCATGGGAGGAGGCTT
HLA-DPB1-XY-caixa-F	GTCCAATCCCAGGGTCACAG
HLA-DPB1-XY-caixa-R	TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA
HLA-DPB1-5'-F	GCGTGTTCATGTCTGCATCC
HLA-DPB1-5'-R	TGATCCTCAGAGCCTGGACA
HLA-DPB1-3'-F	CCAGCCTAGGGTGAATGTTT
HLA-DPB1-3'-R	GCCTGGGTAGAAATCCGTCA
IL8 Promotor-F	GTGATGACTCAGGTTTGCCCT
IL8 Promotor-R	CTTATGGAGTGCTCCGGTGG

Tabela 1: Primers para qPCR.

Tabela 2: cálculos de exemplo de FAIRE relativa recuperação rácios. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

FAIRE é um método robusto e de baixo custo, permitindo a identificação de regiões livres de nucleossoma. É baseado no princípio de que o DNA enrolado nucleosomes pode ser facilmente quitosana para as histonas. Uma extração de fenol: clorofórmio é usada para separar o DNA de proteínas, que se encontra na fase de fenol inferior e até certo ponto no período do intérfase (Figura 1) o não-quitosana e fragmentos de DNA livre de proteína. Portanto, as regiões nucleossoma-free estão sobre-representados na fração de DNA livre na fase aquosa. Um número de publicações descreve protocolos detalhados de FAIRE método^23,24,25,26, que pode ser consultada para complementar o procedimento descrito aqui.

Semelhante a outros métodos usados para determinar a estrutura da cromatina, o método FAIRE criticamente também depende de tosquia ideal do DNA. Se os fragmentos são muito longos, qualquer região livre de nucleossoma será mascarada adjacentes ligados a cromatina DNA. Se os fragmentos são muito pequenos, a deteção por qPCR ou sequenciamento profundo torna-se muito difícil. Por esta razão, o sonication do DNA é um parâmetro crucial que deve ser controlado e otimizado para obter fragmentos em torno de 200-300 comprimento de bp, que representam os nucleosomes 1-2 (Figura 4).

Outro parâmetro que pode afetar o resultado final é a reticulação da amostra. Embora o procedimento de fixação descrito aqui é válido para a maioria das linhas de celular, o pesquisador deve avaliar cuidadosamente este passo para a amostra particular sob estudo, especialmente quando usando tecidos, onde tempos mais longos de fixação podem ser necessários para permitir que o formaldeído para atingir as células em todas as amostras de tecido.

Ao contrário de outros métodos, tais como a DNase I ou hipersensibilidade micrococcal nuclease, ChIP ou ATAC, FAIRE não depende de uma atividade enzimática ou anticorpos específicos, e, portanto, que não precisa de titulação ou otimização das condições de reação. Isto faz FAIRE um método ideal para medir a acessibilidade de cromatina para laboratórios com pouca experiência no campo da cromatina. Além disso, experimentos piloto só são necessários a fim de otimizar a etapa de corte do DNA e o tempo de reticulação, quando necessário.

O método foi desenvolvido inicialmente em fermento⁶, mas ele também foi estendido para células de mamíferos. O DNA purificado com o método FAIRE pode ser usado para sequenciamento profundo, permitindo a caracterização de todo o genoma do status da cromatina. Isto já provou útil em um número de estudos^{8,9,10,11,12,13,19,27, 28}.

Resultados de experimentos de FAIRE-seq mostram uma grande sobreposição com os resultados obtidos por outros métodos como DNase-seq¹⁴, embora algumas diferenças surgem. Isto é devido a diferenças metodológicas, como por exemplo nucleosomes relaxados ou remodeladas ainda poderiam dificultar a clivagem por DNase eu, enquanto estas regiões de DNA seriam menos propensas a produzir ligações cruzadas do DNA/proteína e, portanto, seria determinadas como nucleossoma-livre regiões usando FAIRE⁹. Também, a presença de proteínas não-histonas como ARN-polimerase ou proteínas de leitor para marcas epigenéticas poderia resultar em ligações cruzadas do DNA/proteína e, portanto, seria interpretada como regiões de proteína-embalados em experimentos FAIRE. Estas limitações são inerentes a cada método utilizado para a determinação do estado de cromatina, aumentando assim a necessidade de usar uma combinação de diferentes métodos para obter uma visão abrangente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico 25: 24: 1	Carl Roth	A156.1
Glicogênio, 20 mg / ml	Thermo Fisher	R0561
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox	Thermo Fisher	AB1162B
Proteinase K, 20 mg / ml	Thermo Fisher	EO0491
RNase A, 10 mg / ml	Thermo Fisher	EN0531
Leupeptina	Sigma	L8511
Aprotinina	Sigma	A1603
Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)	Sigma	78830
milliTUBE 1 ml AFA Fiber	Covaris	520130
Suporte milliTUBE 1ml	Covaris	500371
Covaris S220 Ultrassônico focalizado	Covaris
Sistema de PCR em tempo real StepOnePlus	aplicado biossistemas	4376600