Propomos um protocolo de expansão celular na se microcarriers e seu uso como sistema de entrega em um bioreator de perfusão para propagar uma matriz de tecido decellularized. Nós também incluímos diferentes técnicas para determinar a proliferação celular e a viabilidade das células cultivadas no microcarriers. Além disso, demonstramos a funcionalidade das células após culturas de biorreator.
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Artigo de método
Recombinante colágeno peptídeo Microcarriers para expansão da célula e seu potencial uso como sistema de entrega de células em um bioreator modelo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Engenharia de tecidos é um campo promissor, focado no desenvolvimento de soluções para a crescente demanda em tecidos e órgãos em relação a fins de transplante. O processo para gerar tais tecidos é complexo e inclui uma combinação apropriada de tipos de células específicas, andaimes e estímulos físicos ou bioquímicos para orientar a diferenciação e crescimento celular. Microcarriers representam uma ferramenta atraente para expandir as células em um microambiente de tridimensional (3D), uma vez que fornecem maior superfície-para rácios de volume e imitar mais de perto a situação na vivo em comparação com métodos tradicionais bidimensionais. O sistema vascular, fornecendo oxigênio e nutrientes para as células e garantindo a remoção de lixo, constitui um importante bloco de construção quando gerando engenharia de tecidos. Na verdade, a maioria das construções falharem após ser implantado devido a falta de suporte vascular. Neste estudo, apresentamos um protocolo para a expansão de células endoteliais na recombinante microcarriers baseados em colágeno sob condições dinâmicas no balão do girador e biorreatores, e explicamos como determinar nesta viabilidade celular de configuração e funcionalidade. Além disso, propomos um método de entrega de celular para fins de vascularização sem etapas de desprendimento adicionais necessárias. Além disso, nós fornecemos uma estratégia para avaliar a vascularização celular potencial em um bioreator de perfusão em uma matriz biológica decellularized. Acreditamos que o uso dos métodos apresentados pode levar ao desenvolvimento de novas terapias baseadas em células para uma grande variedade de aplicações na prática clínica de engenharia de tecidos.
Introdução
Um problema geral em aplicações de engenharia de tecido é produzir uma massa de células alta com o fenótipo de diferenciação correta na localidade de necessidade. A aplicação de microcarriers para abordar esta questão começou em 1967 com o aumento da importância à data nos campos tais como a engenharia de tecidos ortopédicos para geração em grande escala de pele, ossos, cartilagens e tendões1. Eles permitem a manipulação de culturas aderentes em maneiras semelhante da suspensão de culturas2 expandindo células em substratos (3D) tridimensionais de microescala. Assim, as células experimentam um fornecimento de nutrientes h....
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Protocolo
hBMSCs foram isolados da cabeça do fêmur de pacientes de osteoartrite submetidos à cirurgia de substituição de cabeça do fêmur. O procedimento foi realizado sob a aprovação do Comitê de ética Local da Universidade de Wuerzburg e consentimento informado dos pacientes. Células endoteliais microvasculares primárias foram isoladas a partir de biópsias do prepúcio de doadores juvenis. Seu representante legal fornecido completo consentimento informado por escrito. O estudo foi aprovado pelo Conselho de ética local da Universidade de Wuerzburg (votação 182/10).
1. isolamento de hBMSCs e HDMECs
- Medula óssea-derivado mesenquimais estromais....
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Resultados
Como mostrado na figura 1A, obtivemos o elevado número de células viáveis na microcarriers a RCP após 7 dias da cultura, determinado pela coloração ao vivo/morto. Esses resultados foram confirmados por análise de SEM, em que microcarriers completamente colonizados foram observados ao redor dos poros, parcialmente sobrecrescimento-los (figura 1B). Por outro lado, experiências em que as células não foram semeadas uniformemente resu.......
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Discussão
Um dos principal objetivos da microcarrier é a expansão das células, mantendo a sua diferenciação para entregar as células para o local de necessidade. O método representado introduzir RCP microcarriers onde as células foram capazes de anexar, proliferar e colonizar o microcarriers com densidade de pilha alta. Isto foi observado pelo live/dead coloração, em que mais de 90% de células viáveis foram detectados enquanto apenas poucas células mortas foram obtidas após 7 dias de culturas dinâmicas. Da mesma forma, as imagens .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
A pesquisa que conduz a estes resultados recebeu financiamento da União Europeia sétimo quadro programa FP7/2007-2013 sob contrato de concessão n ° 607051 (BIO-INSPIRE). Agradecemos Carolien van Spreuwel-Goossens da Fujifilm fabricação Europe B.V., a assistência técnica durante a fabricação de RCP e Werner Stracke do Instituto Fraunhofer para silicato pesquisa ISC, para obter assistência com a análise de SEM.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4',6-Diamidino-2-fenilindoldicloridrato (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Ácido acético 100% | Sigma-Aldrich | 533.001 | |
| Balança analítica Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-fosfato | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Biorreator | Presidente de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, Wuerzburg, Alemanha | ||
| Microscópio de campo claro Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Tubos de centrífuga (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Solução de colágeno R 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco | Sigma-Aldrich | D8537 | Modificado, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio |
| Eosina 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Etanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Soro fetal desnaturado |
| para bezerro (FCS) | Bio& VENDA | FCS. ADD.0500 | microscópio de fluorescência não inativado por calor |
| BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexametildisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | grau de reagente, ≥ 99% |
| Incubadora para biorreator | Cadeira de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, Wuerzburg, Alemanha | ||
| Kit de coloração dupla de células vivas/mortas | Fluka | 04511KT-F | |
| Placa agitadora magnética | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Leitor de microplacas Tecan Infinite M200 | Tecan | ||
| Agulha 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papaína de látex de mamão | Sigma-Aldrich | P4762 | pó liofilizado, ≥ 10 unidades/mg de proteína |
| Parafina | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Bomba peristáltica | Ismatec | ||
| Kit de ensaio Quanti-iT PicoGreen dsDNA | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Microscópio Eletrônico de Varredura Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Solução de hidróxido de sódio 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Frascos giratórios (25 mL) | Seringa Wheaton | 356879 | |
| 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Frascos para cultura de tecidos (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline tecnologia celular | LL-0005 |
Referências
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods ....
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Reimpressões e permissões
