Apresentamos aqui um pedido de uma norma técnica imunológica (CFSE manchado OT-eu proliferação) destinados a monitorar rapidamente mediada por adjuvante T linfócitos citotóxicos (CTL) geração in vivo. Esta estimativa rápida das capacidades CTL é útil para o desenvolvimento de vacinas profiláticas contra patógenos intracelulares, bem como as vacinas terapêuticas do câncer.
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Rápida na Vivo avaliação dos recursos de geração de linfócitos de T citotóxicos do adjuvante para desenvolvimento de vacinas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A avaliação de vacinas de subunidade moderno revela que a geração de anticorpos neutralizantes é importante mas não suficiente para a seleção de adjuvante. Portanto, adjuvantes com capacidades imuno-estimulatórios humorais e celulares que são capazes de promover respostas de linfócitos (CTL) T citotóxicas são urgentemente necessárias. Assim, fiel, monitoramento de adjuvante que induzir Cruz-ferragem e posteriormente aumentar a geração de CTL representa um passo crucial no desenvolvimento de vacinas. Aqui apresentamos um pedido de um método que usa SIINFEKL específicos (OT-eu) células T para monitorar a Cruz-apresentação do modelo do antígeno ovalbumina (OVA) na vivo na presença de candidatos de diferentes adjuvantes. Este método representa um teste rápido para selecionar adjuvantes com os melhores recursos de cruz-ferragem. A proliferação de CD8+ T células é a indicação mais valiosa da Cruz-ferragem e também é considerado como um correlato de cruz-apresentação induzida por adjuvante. Esta característica pode ser avaliada em diferentes órgãos imunes como linfonodos e baço. A extensão da geração CTL também pode ser monitorizada, conferindo-lhe insights sobre a natureza de um local (drenagem do linfonodo principalmente) ou uma resposta sistêmica (distante dos gânglios linfáticos e/ou baço). Ainda mais esta técnica permite várias modificações para testes de drogas que podem inibir a percursos específicos da Cruz-apresentação e também oferece a possibilidade de ser usado em diferentes cepas de ratos geneticamente modificados e convencionais. Em resumo, o aplicativo que apresentamos aqui será útil para laboratórios de vacina em indústria ou do meio académico que desenvolvem ou modificar adjuvantes químicos para pesquisa de vacina e desenvolvimento.
Introdução
Linfócitos T citotóxicos (CTL) induzindo vacinas são principais intervenções terapêuticas que foram desenvolvidas para lutar contra certos tipos de câncer1. CTL são também importantes para vacinas profiláticas contra patógenos intracelulares2. Além disso, o CTL são dentre os mecanismos de defesa imune alguns funcionalmente ativos em populações de risco tais como neonatos3,4 , quem também dependem de CTL para combate de infecções início vida5. A este respeito, as vacinas contra o vírus sincicial respiratório (VSR) que foram desenvolvidas com um adjuvante que não eliciam respostas CTL (alume) resultaram em um completo fracasso da vacina levando a sérias complicações com infecções em lactentes de6. Estes efeitos negativos da vacinação podem ser revertidos por um CD8+ de resposta de células T7. Nós demonstramos anteriormente que as principais citocinas (interferons do tipo I) eliciadas algum estimulador de agonistas de genes (picada) de interferon são essenciais para as respostas CTL geradas por estes adjuvantes8, em parte, medindo-se a proliferação de OT-I T pilhas após vacinação e usando estes resultados como uma medida de CTL induzindo capacidades observadas em estendem de horários de vacinação9. A medição da proliferação de OT-eu CD8+ T em um rato de destinatário tipo selvagem (WT) C57BL/6 células por carboxyfluorescein grufo tintura de éster (CFSE) diluição é uma robusta estimativa da capacidade do adjuvante de uma vacina para gerar Cruz-ferragem de SIINFEKL, (o peptídeo imuno-dominante da ovalbumina, óvulos). Variações desta técnica são amplamente utilizadas para a avaliação da proliferação de OT-eu CD8+ e OT-II CD4+ T células. Por exemplo, ela tem sido usada na ausência de citocinas selecionadas (ratos KO) ou para medir a eficácia da vacina após retirada de antigénios em animais WT. Criámos um protocolo curto (4 dias experimento) em que após a transferência passiva de OT CFSE-manchado-eu CD8+ T cells, uma imunização (s.c.) subcutânea, consistindo de uma dose de 50 µ g de OVA livre de endotoxinas suplementado com adjuvantes de teste é administrado (Figura 1). O acompanhamento dos resultados 48 h após a vacinação fornece uma confiável prova da capacidade do adjuvante para gerar respostas CTL. Por esta estratégia, é possível avaliar a potência da resposta imune local no nó de linfa drena após a imunização, bem como a extensão da resposta, medindo-se a atividade CTL no baço (ou distante dos gânglios linfáticos).
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Protocolo
Todos os mouses utilizados neste estudo foram do fundo C57BL/6. Todos os animais foram mantidos em condições isentos de organismos patogénicos. Todos os experimentos foram realizados de acordo com a normativa da lei alemã de proteção animal (TierSchG BGBl. EU S 1105; 25.05.1998) e foram aprovados pela Comissão Baixa Saxônia a ética de experimentos do Animal e do escritório de estado (Baixa Saxônia estado escritório de defesa do consumidor e da segurança alimentar), sob o número de autorização de 33,4-42502-04-13/1281 e 162280.
1. CFSE coloração de OT-eu T células e transferência adoptiva
Nota: OT-os ratos são animais transgenicamente gerados que expressam um receptor de células T (TCR) com α fixo e cadeias β que juntos reconhecem o peptídeo imuno-dominante de óvulos, SIINFEKL10,11. Como resultado, estes ratos têm um número consideravelmente elevado de SIINFEKL específicos CD8+ T células (97%)12 quando comparado com ratos normais ou óvulos vacinados (≤ 1%)13.
- Isolamento de CD8 rastreável+ T células de OT-eu camundongos expressando o alelo específico dos linfócitos T Thy1um (Thy1.1):
- Eutanásia em OT 6-9 semanas de idade-eu ratos por inalação de CO2 , seguido por deslocamento cervical14. Dissecar o baço e linfonodos principais (pares inguinais, axilares e cervicais), cortando a pele com uma tesoura cirúrgica, destacando a pele do corpo com a ajuda do alicate cirúrgico e pinça e colocá-los em placas de Petri (15 x 60 mm) cada um contendo um 100 µm poro malha cup para libertação de moagem e células de tecidos.
- Manter os pratos de petri (cada um com uma malha Copa) em 3-5 mL de meio RPMI completo (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 U/mL penicilina, estreptomicina 50 µ g/mL) mantido no gelo.
- Triture os órgãos com a ajuda de um êmbolo da seringa ou um instrumento similar de estéril (corte prévia não é necessária) e recolher a suspensão única célula resultante em tubos de centrífuga de 15 mL.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante. Lavar as células em 10 mL de PBS frio por centrifugação e lisar as hemácias do baço, re-suspendendo a pelota em 1 mL/baço do cloreto de amônio buffer (buffer de ACK, comercialmente disponível). Incube as celulas por 1,5 min no gelo e posteriormente lavar as células com 10 mL de PBS frio por centrifugação (como feito antes).
- Ressuspender o sedimento no mesmo tubo em 1 mL de PBS (pH 7,2) contendo 5% fetal soro bovino para isolamento magnético.
- Para isolamento magnético, proceder à seleção negativa de CD8+ T células usando um kit de isolamento magnético de acordo com as instruções do fabricante ou publicado protocolos15.
- Para executar o CFSE coloração, primeiro contar o número de CD8+ T células obtidas a partir de OT-eu ratos usando um contador de célula automatizada (contador de partículas). Mancha de 1-5 x 107 células/mL em um volume de 1-5 mL com 5 µM CFSE em PBS por 7 min a 37 ° C, protegido da luz em um tubo falcon de 15 ml.
- Saciar a coloração CFSE adicionando o mesmo volume (1:1) de soro fetal bovino para as células e incube-os adicional 7 min a 37 ° C, protegido da luz. As células com 10 mL de PBS lave duas vezes.
- Conte as células usando um contador automatizado de células. Defina o número de células com 3-5 x 107 células/mL de PBS para injetar o 3-5 x 106 células/rato em 100 µ l por via intravenosa (IV) através da veia da cauda.
- Para executar a cauda veia injeções, imobilize os ratos em protecções adequadas. Aquecer a área traseira e a cauda dos ratos deve ser injetado por meio de uma lâmpada de luz vermelha, colocada entre 20 a 25 cm.... os ratos para 1-3 min permitir que a cauda veia vasodilatação.
Nota: Isso ajuda a deteção de veia de facilidade e administração da suspensão celular. - Certifique-se (com a mão colocada entre os ratos e a lâmpada) que não é demasiado quente para os ratos e quando as veias da cauda são claramente visíveis, dirijam-se à injeção. Injete as células na veia de cauda lateral ou dorsal utilizando uma seringa de 1mL com uma agulha de calibre 2516.
2. imunização (Endo-free OVA + adjuvante)
- Coloque os ratos transplantados com OT-eu células (etapa 1.7, Figura 1) em uma câmara de anestesia e administrar isoflurano em oxigênio por uma máquina de anestesia14.
- Quando o mouse está dormindo sob anestesia, tirá-lo da câmara e raspar o pelo do mouse sobre a área sobre o glúteo superficial (laterais, parte inferior das costas), usando uma máquina de corte de cabelo elétrico, a fim de realizar uma injeção limpa com uma boa visão da área de aplicação.
- Injete 50 µ l da vacina, s.c. na área depilada, usando uma agulha de calibre 25.
3. isolamento de linfócitos e mancha para análise de citometria de fluxo
- Isolamento de linfócitos e splenocytes
- Abater os ratos vacinados por inalação de CO2 seguida por deslocamento cervical.
- Extraia o distantes e drenagem dos linfonodos e baço e colocá-los em separado placas de Petri contendo 100 µm poro malha copos para libertação de moagem e células de tecidos. Siga os passos 1.1.2 através de 1.1.3.
- Decante o sobrenadante após centrifugação e ressuspender as pelotas de célula no mesmo volume de remanescente PBS (aprox. 100 µ l).
- Coloração para análise de citometria de fluxo
- Num tubo de centrífuga de 15 mL prepare uma mistura de mestre que contém os anticorpos coloração nas concentrações descritos na tabela 1, assim, produzindo uma mistura concentrada de coloração de 2x. Prepare-se volume suficiente do mestre mix ter 100 µ l por amostra. Misture as células e a mestre mistura 1:1 e incubar é a 4° C por 30 min.
Nota: O volume final de coloração por exemplo deve ser 200 µ l (100 µ l de célula pelota + 100 µ l do mix de mestre de anticorpo). - Lave as células duas vezes por centrifugação, conforme descrito em 1.1.3, adicionar 10 mL de PBS, duas vezes.
- Ressuspender as células coradas em 0,5-1 mL de PBS para a aquisição e a suspensão de transferência para tubos de citômetro de fluxo. Sempre manter as amostras no gelo e protegido da luz.
- Num tubo de centrífuga de 15 mL prepare uma mistura de mestre que contém os anticorpos coloração nas concentrações descritos na tabela 1, assim, produzindo uma mistura concentrada de coloração de 2x. Prepare-se volume suficiente do mestre mix ter 100 µ l por amostra. Misture as células e a mestre mistura 1:1 e incubar é a 4° C por 30 min.
4. fluxo Cytometry
- Sempre pré-filtre as amostras de células usando filtros de 70-100 µm.
- Prepare a coloração única compensação controles para o fluorophores detalhadas na tabela 1 (grânulos ou células).
Nota: Compensação deve ser executada no citômetro ou análise software17,18,19 e aplicada a todas as amostras. - Siga a estratégia associada representada na Figura 2. Brevemente, populações de portão na altura de avançar dispersão vs área de dispersão para a frente (Figura 2A) e novamente dispersão lateral ampla vs área de dispersão lateral (SSA, Figura 2B) a fim de excluir parelhas.
- Portão a população de Figura 2B plotando BV 650 (autofluorescência) vs FITC (CFSE) a fim de discriminar o verdadeiro CFSE manchado células de altas autofluorescente de células. Incluem grânulos ou células coradas com anticorpos conjugados a BV 650 em controles de compensação. Este enredo (Figura 2), da BV 650 vs FITC é usado para portão OT-eu CFSE manchado células.
- Portão da população de C da Figura 2 para a Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8) a fim de distinguir células derivadas de doador vs ratos destinatários.
Nota: Células derivadas de OT-eu ratos doadores são Thy1.1+ (CD90.1), (WT C57BL/6, destinatários) derivado de ratos células são Thy1.2+ (CD90.2) (Figura 2D). Alguns laboratórios têm OT-eu ratos em um fundo de Thy1.2 e WT (C57BL/6) em um Thy1.1. Neste caso você tem que usar um anticorpo contra Thy1.2 para OT-eu celular gating. - Re-portão CD8+ células de Thy1.1+ população plotando-a em um portão constituído por 450 BV (CD4) vs APC (CD8) (Figura 2E).
- Exibir a população fechada na Figura 2E usando um display de histograma do CD8+ células mostrando CFSE (FITC, canal 530/15 - laser azul-), portão a população proliferada, incluindo intensidades de 102 até o nível onde populações a indivisa de controle são (intensidades 10 ~5, dependendo a eficácia do CFSE mancha e a configuração da tensão com o citômetro de fluxo) (Figura 2F).
- Que uma porta adicional (não mostrado na Figura 2) plotagem FITC vs L/D marcador (450/20 canal, laser UV) a fim de avaliar as células mortas, em paralelo à avaliação de proliferação.
- Adquira pelo menos 5000 eventos para os controles de compensação e 10,000 eventos (portão E, Figura 2) das amostras em um citômetro de fluxo. Executar o citômetro de fluxo médio ou baixo (não excedam as taxas de fluxo de 20.000 eventos/s).
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Resultados
Para testar os tratamentos utilizando uma combinação diferente de adjuvantes (ADJ1 e ADJ2), avaliamos a capacidade de geração de CTL medindo-se a proliferação de OT enviaram transferido-eu CD8+ T células por citometria de fluxo (Figura 2). Por isso, nós anteriormente manchadas de células isoladas da drenagem dos gânglios linfáticos e baço (tabela 1). Medindo-se a proliferação de CD8+ T células nos linfonodos e baço, fomo...
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Discussão
Vacinas modernas são idealmente composedof antígeno purificado e adjuvantes, com a possível adição de um sistema de entrega como lipossomas, vírus-como partículas, nanopartículas ou vetores ao vivo. Um aspecto fundamental durante a criação de uma vacina é escolher o certo adjuvante de acordo com as necessidades clínicas. Parte do escopo poderia envolver favorecendo um humoral vs. resposta imune celular (ou ambos), a eleição de um local contra uma resposta imune sistêmica (ou ambos) e o tipo de memória que a vacina deve g...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Estamos em dívida com nossos assistentes técnicos: U. Bröder e H. Shkarlet, que nos ajudou durante procedimentos experimentais. Este trabalho foi parcialmente financiado por subvenções e da UE (contrato n º 601738, UniVax e TRANSVAC2, contraem n º 730964), uma subvenção de Helmholtz-gemeinschaft (HAI-IDR). As fontes de financiamento não influenciou a pesquisa concepção, geração do manuscrito ou decisão de enviá-lo para publicação.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order Flow Cytometer | |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Corante de Proliferação |
| MojoSort 480007Mouse CD8 Cell Isolation | Beads e anticorpos para seleção negativa de células T CD8 intocadas. | ||
| Kit de coloração de células mortas azuis fixáveis VIVAS/MORTAS, para excitação UV | Sondas moleculares | L23105 | Marcador de células mortas |
| CD90.1 (Thy-1.1) Anticorpo monoclonal (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | |
| anticorpo APC anticorpo CD8a anti-rato | BioLegend | 100712 | anticorpo |
| BV421 Rato anti-rato CD4 | BD | anticorpo | 740007 |
| Z2 coulter Contagem de partículas e analisador de tamanho | Beckman Coulter | 9914591DA | Contador de células. Z2 Contador automatizado de partículas/células |
| EndoGrade Ovalbumina (10 mg) | Hyglos(Alemanha) | 321000 | Ovalbumina livre de endotoxina testado. |
| Filtro de Células 100µ m nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µ Copos de malha de poros M). |
| Frascos de amostra | Beckman Coulter | 899366014 | Frascos de amostra para camundongos C57BL/6 de contador automatizado Z2 |
| (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Alemanha) | A empresa agora é Envigo | |
| OT-I (fundo C57BL/6, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Alemanha) | Consanguinidade em nossas instalações para animais. Empresa de onde adquiriu agora é Envigo | |
| FACS tubos | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Tubos de poliestireno de fundo redondo |
| Falcon Tubos de 15 mL Fischer | (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Tubos de centrífuga cônica |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (solução salina tamponada com fosfato), pH 7,2 |
| Lâmpada vermelha (lâmpada de aquecimento) | Dirk Rossmann GmbH (Alemanha) | 405096 | Lâmpada de aquecimento (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurano) | Abbott Laboratories (EUA) | 5260.04-05. | Isoflurano anestésico (balão de 250 mL). |
| Máquina de anestesia de mesa/máquina de anestesia móvel com absorvedor de CO2 | Parkland Scientific | V3000PK | máquina de anestesia de isoflurano. |
| Meio RPMI 1640 | Gibco (distribuído pela ThermoFischer) | 11-875-093 | Meio base com glutamina (500 mL) |
| Solução antibiótica Pen-Strept (Gibco) | Gibco (distribuído pela ThermoFischer) | 15-140-148 | Penicilina-estreptomicina Gibco (10.000 U/mL) |
| Soro fetal de boina (Gibco) | Gibco (distribuído pela ThermoFischer) | 10082147 | Soro fetal bovino, certificado, inativado pelo calor, origem americana |
| Tampão de lise ACK (100 ml) | Gibco (distribuído pela ThermoFischer) | A1049201 | Tampão de lise de sangue total de cloreto de amônio (ACK), adequado para lise de eritrócitos em suspensões de baço também |
| Placas de Petri de plástico | Nunc (distribuído pela ThermoFischer) | 150340 | Placa de Petri de plástico de 60 x 15 mm, |
| Filtro de aglomerado de células | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μ m, estéril |
Referências
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Reimpressões e permissões
