Summary
هنا نقدم البروتوكولات للذرة الغربية بريسيلولار ميكروينجيكتينج وجمع الأجنة روتوورم غرض أداء الاختبارات الوظيفية الجينومية مثل تحويل الخط وتحرير كريسبر/Cas9-الجينوم.
Abstract
روتوورم الذرة الغربية (فكر) هو الآفات هامة من الذرة، وهو معروف لقدرته على سرعة التكيف مع استراتيجيات إدارة الآفات. على الرغم من أن تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) ثبت أن تكون أداة قوية لدراسة البيولوجيا فكر، لها حدودها. على وجه التحديد، [رني] نفسها عابرة (أي لا يؤدي إلى وراثة مندلية طويلة الأجل من النمط الظاهري المرتبطة بها)، وذلك يتطلب معرفة تسلسل الحمض النووي للجين المستهدف. الأخير يمكن أن يكون الحد إذا كان النمط الظاهري لمصلحة سيطرة الجينات المصانة سيئة، أو حتى رواية، لتحديد أهداف مفيدة سوف تكون صعبة، إذا لم يكن من المستحيل. ولذلك، ينبغي توسيع عدد الأدوات في الجينوم مربع الأدوات لوكر بوضع الأساليب التي يمكن استخدامها لخلق سلالات متحولة مستقرة وتمكين دراسات استقصائية مستقلة عن تسلسل الجينوم وكر. هنا، نحن بالتفصيل الأساليب المستخدمة في جمع وميكروينجيكت بريسيلولار فكر الأجنة مع الأحماض النووية. بينما البروتوكولات المبينة في هذا التقرير تهدف إلى خلق فكر محوره وراثيا، تحرير كريسبر/Cas9-الجينوم يمكن أيضا إجراء باستخدام نفس البروتوكولات، مع الفرق الوحيد هو تكوين الحل حقن الأجنة.
Introduction
الذرة الغربية روتوورم (فكر)، ظهرت فيرجيفيرا فيرجيفيرا، هو الآفات هامة من الذرة1. من المثير للاهتمام، يبدو فكر التغلب على مراقبة تدابير أكثر سرعة من الآفات الزراعية الأكثر نظراً لأنها ليس فقط التكيف مع الناحية الفسيولوجية ولكن أيضا سلوكيا2،3،،من45، 6-على مدى العقد الماضي، تم التحقيق كأسلوب تحكم محتملة لفكر7،8تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني])، أداة الجينوم وظيفية قوية، وتستخدم أيضا كوسيلة لدراسة الجينات الدالة9. ومع ذلك، بينما [رني] كثيرا ما يؤديها microinjection من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (dsRNA) في الأنواع الأخرى، أمر نادر في وكر [رني] على أساس حقن. وفي الواقع، هناك فقط بضعة تقارير من [رني] عبر microinjection من دسرنا في فكر9. والسبب أن فكر يمكن تحقيق مستويات عالية من الجينات ضربة قاضية عن طريق ابتلاع دسرنا7،10، حتى تسمح بدراسة تأثيرات جنينية بتغذية دسرنا إلى الأم11. بينما يجعل هذا الأسلوب فكر مادة ممتازة لتحليل الجينوم الوظيفي عن طريق [رني]، قد تباطأ التقدم المحرز في وضع منهجيات ل microinjection الجنينية في هذه الأنواع.
وعلى الرغم من القوة [رني]، وهناك عدد قليل من العيوب. على سبيل المثال، ليست كل الجينات الرد على قدم المساواة على [رني]. ويمكن جعل هذا التغير تفسير النتائج تحليل الجينوم الوظيفي أكثر صعوبة. أيضا, [رني] عابرة ولا تولد الطفرات الموروثة. من ناحية أخرى، تحول الفعل، أداة الجينوم وظيفية أخرى، يمكن أن تولد الطفرات الموروثة عن طريق إدخال عنصر قابلة ملحوظ في12،الجينوم13. وهذا يجعل التحول germline أداة ممتازة لخلق سلالات متحولة لاستخدامها في الدراسات الوراثية على المدى البعيد. يمكن أيضا استخدام التحول إنقاذ طفرة بتقديم نسخة وظيفية من الجينات إلى جينوم متحولة14. وعلاوة على ذلك، تحول الخط هو حجر الزاوية لمجموعة متنوعة من التقنيات الوراثية الجزيئية. بالإضافة إلى انقطاع و/أو إنقاذ وظيفة الجينات، يمكن استخدام تحويل germline محسن محاصرة15والجينات الملائمة16، على أساس Gal4 التعبير حمل خارج الرحم17والطفرات على نطاق الجينوم18.
في الآونة الأخيرة، تم تطوير أدوات تمكن من تحرير الجينوم المتطورة. وتشمل هذه الأدوات Nucleases المستجيب أكتيفاتورليكي النسخ (TALEN) و19،نظام كريسبر/Cas9-نوكلاس20. وميزة هذه الأدوات الجديدة أنها توفر الباحثين القدرة على حمل فاصل الحمض النووي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في ما يقرب من أي موقع داخل تقريبا أي الجينوم. بمجرد فعل، يمكن إصلاح هذه الفواصل أما نهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل، الذي يمكن أن يعرض عمليات الحذف أو الإدراج في الجينات المستهدفة، أو من خلال إصلاح الموجه من التماثل، الذي يمكن حفز حضور بناء هندسيا، استبدال الجينات كاملة أو المناطق الوراثية21،22. ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق microinjection الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي و/أو البروتين في أجنة صغار جداً.
الأهم من ذلك، خلافا دسرناس المستخدمة ل [رني] والأحماض النووية والبروتينات المستخدمة للخط التحول والجينوم التحرير لا يمكن بسهولة عبر أغشية الخلية. ولذلك، يجب أن microinjection بلازميد السلطات الوطنية المعينة، مرناس، و/أو البروتينات تجري خلال مرحلة بلاستوديرم المخلوي (أي قبل الجنين الحشرات سيلولاريزيس). وهذا يجعل توقيت حقن عامل حاسم. على سبيل المثال، في melanogaster المورفولوجية، تحتاج الأجنة بالحقن خلال ساعتين بعد وضع البيض12. ولذلك، يجب أن تراعي وضع بروتوكول microinjection الجنينية ناجحة لفكر أفضل الظروف لوضع البيض الإناث، فضلا عن الأسلوب الأمثل لجمع كميات كافية من الأجنة بريسيلولار.
جهد لتحقيق مجموعة واسعة من الأدوات الوراثية الجزيئية للتأثير على فكر الأحياء يتطلب تطوير أساليب جمع وميكروينجيكتينج بريسيلولار فكر الأجنة. هنا نقدم الإرشادات التفصيلية، جنبا إلى جنب مع نصائح والخدع، لمساعدة الآخرين على استخدام التقنيات المستندة إلى التحول في فكر للبحث. بالإضافة إلى توسيع نطاق التكنولوجيات المحورة وراثيا لفكر لاستخدامها في الدراسات الجينومية الوظيفية، تمكن هذه التقنيات أيضا استراتيجيات مكافحة الآفات الجديدة القوية مثل الجينات محرك23،24 لفحصها في هذه المهمة اقتصاديا مكافحة الآفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-مستوى مستعمرة تربية البالغين فكر
- الحصول على كمية كافية من فكر الكبار (500-1,000) من مختبر الشركة أو بحوث موثوق بها (انظر الجدول للمواد على سبيل مثال) ووضع في قفص3 30 سم.
ملاحظة: استخدام سلالة غير ديابوسينج ينصح بشدة. - إعداد فكر مصطنع يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة النظام الغذائي وصب طبقة سمكها سم 1 في حاوية أوز 38 (انظر الجدول للمواد). بعد خلط، تخزين النظام الغذائي غير المستخدمة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
- وضع طبق بتري (100 × 15 ملم) مع نظام غذائي الكبار (10-15 جم) في قفص3 30 سم. إضافة نظام غذائي أكثر عندما تكون المواد الغذائية منخفضة أو الجافة.
- وضع قارورة (300 مل) بالماء، مغطاة كرة القطن، والذي يستخدم للاحتفاظ في مكان لفة القطن (6 "× 3/8")، تخدم كمصدر لمياه. تغيير الماء عند تشغيله منخفضة.
- 14:10 خفيفة دورة في حشرة تربية الحاضنة والحفاظ على فكر في 26 درجة مئوية مع رطوبة 60%.
2-الجنين جمع والمحاذاة
- جعل دائرة جمع بيض لاستخدام أجار 1% في المياه في تعقيم 100 × 15 ملم2 طبق بيتري. تخزين في 4 درجات مئوية بعد أجار يتصلب.
- لجمع البيض وضعت حديثا، قم بوضع طبقة واحدة من ورق الترشيح، تليها 4 طبقات من القماش القطني (كل قطع بحجم) على سطح أجار (الشكل 1A).
ملاحظة: القماش القطني يمكن إعادة استخدامها، بعد غسلها في التبييض ويعقم، ولكن ليس من الضروري القيام بذلك لأول استخدام. لا يمكن إعادة استخدام ورق الترشيح ولا تحتاج إلى تعقيم. - ضع لوحة جمع البيض في قفص فكر في وقت متأخر في اليوم قدر الإمكان (في نهاية يوم العمل) وتغطي بورق ألمونيوم خيمة. الإجازة بين عشية وضحاها.
ملاحظة: وجود الأضواء على من 10:00 ص إلى 12: 00 صباحا (ح 14) التأخير بيضة زرع، مما يسهل جمع البيض الأصغر سنا ل microinjection دون الحاجة إلى موظفي المختبر على مكان الدائرة جمع في قفص في ساعة متأخرة من الليل. - إزالة الدائرة جمع البيض حوالي 8 أو 09:00 ص
- استخدام الملقط لالتقاط 1 طبقة من القماش القطني في وقت ومكان في كوب (500 مل) من الماء. أغسل البيض الخروج من القماش القطني بالتحريك بلطف (الشكل 1 باء وجيم 1).
- استخدام ماصة لمبة نقل البيض إلى آخر كوب (500 مل) من الماء. كرر x 2-3 لتنظيف البيض.
- استخدام ماصة لمبة لنقل البيض على ورق الترشيح (الشكل 1) مع التقليل من كمية المياه المرحل.
- يضع الورقة مسطحة (الشكل 2A) قطع السوداء تصفية الورق إلى شرائح واسعة كما الشريحة الزجاجية والشريط بثبات إلى الشريحة للتأكد.
ملاحظة: ورقة تصفية سوداء يساعد على تحسين الرؤية تحت المجهر بتقليل كمية الضوء المنعكس. - تطبيق الغراء غير سامة (انظر الجدول للمواد على سبيل مثال) إلى ورقة تصفية في الخطوط الدقيقة (الشكل 2). الإبقاء على أسطر الغراء أرق من القطر من البيض لتجنب الحصول على البيض المغلفة بالغراء.
- استخدام فرشاة غرامة لتحرك بلطف فكر البيض واحداً تلو الآخر من على ورق الترشيح إلى السطر الغراء. في محاولة لوضع البيض على الغراء قبل أن يجف والحفاظ على المسافة بيضة واحدة على الأقل لبين كل بيضة.
- تعظيم كفاءة الحقن بوضع عدة أسطر من البيض على شريحة واحدة من ورق الترشيح (الشكل 3).
- بعد أن وضعت كل البيض على ورق الترشيح، انتظر حتى كافة الغراء يجف قبل microinjection.
ملاحظة: لتحويل الخط والجينوم كريسبر/Cas9-بوساطة التحرير، حقن أجنة جميع ظهرا (12:00 م) حيث يكون الجنين أقدم القديم أي أكثر من 19 ساعة. ومع ذلك، ل [رني], هناك لا حدود زمنية لأنه، بوكر، دسرنا يمكن التنقل بين الخلايا. في الواقع، ل [رني]، الأجنة الشيخوخة قد يؤدي إلى تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة.
3-إعداد بلازميد السلطات الوطنية المعينة والحقن بالإبر
- إعداد الحمض النووي بلازميد سوبيركويليد عالية الجودة باستخدام تجارية خالية من الذيفان كيت (انظر الجدول للمواد على سبيل مثال).
- إعداد الحل الحقن، التحقق من تركيز كل بلازميد وثم الجمع بين مساعد بلازميد (250 نانوغرام/ميليلتر التركيز النهائي)، المانحة بلازميد (750 تركيز نانوغرام/ميليلتر النهائية) والفينول الأحمر المخزن المؤقت (20% تركيز النهائي). دوامة الحل بإيجاز والطرد المركزي لمدة 3 دقيقة بأقصى سرعة ممكنة يعجل الجسيمات التي يمكن أن تسد الإبرة.
- سحب زجاج البورسليكات الإبر (نقلت 1 مم، معرف 0.58 ملم، طول 10 سم) استخدام ساحبة ميكروبيبيتي نوع المشتعلة/براون. للتخزين، وتأمين الإبر سحبت على الوجهين شريط مثبت في طبق بتري أو حاوية أخرى واضحة.
ملاحظة: للنظام ساحبة ميكروبيبيتي، كانت الإعدادات المستخدمة: الحرارة = 335، سن الفيل = 4، حطي = 40، DEL = 200، بول = 100. - الردم إبرة حقن باستخدام مايكرو-لودر تلميح (انظر الجدول للمواد) بيبيت 0.5-1.0 ميليلتر إلى أسفل داخل الإبرة، قرب نهاية مدبب. إزالة فقاعات من طرف الإبرة في حالة حدوث أي.
- أدخل إبرة حقن في حامل الإبرة.
- فتح غيض الإبرة بكسر بلطف مع زوج خير من الملقط، أو بلطف لمس/سحب الحافة على الشريحة ساترة أو الزجاج.
ملاحظة: الهدف هو أن يكون افتتاح أصغر التي ما زال يسمح مزيج حقن ليخرج (فتحات أصغر عموما تتطلب أعلى ضغط الحقن). لا تتطلب الإبر مشطوف هذه الخطوة نظراً لأنها مفتوحة مسبقاً.
4-microinjection والرعاية ما بعد الحقن
- استخدام الرسام ما يرام، بعناية الرطب سطح البيض 1-3 مع المياه المعقمة، وإدراج الإبرة وحقن الحل. حقن كل بيضة قبل أن يجف السطح. ابحث عن ظهور كمية صغيرة من اللون الأحمر داخل البيض أثناء الحقن للإشارة إلى microinjection ناجحة. سحق، أو إزالة أي البيض التي تبدو تالفة، فارغة، أو خلاف ذلك لا يمكن أن يكون حقن.
ملاحظة: على الرغم من ضغط الحقن يختلف باختلاف حجم الإبرة أثقب، 10-13 هذه المبادرة نقطة انطلاق جيدة. - بعد أن يتم حقن كل البيض، إزالة ورق الترشيح من الشريحة الزجاجية.
- ضع ورق الترشيح على سطح طبق أجار 1% (المذكورة أعلاه).
- استخدام البارافين البلاستيك فيلم لختم الطبق، ووضعت في الحشرات 26 درجة مئوية تربية الحاضنة لمدة 12 يوما.
ملاحظة: الفيلم البارافين سيساعد على منع التلوث عبر العفن بين الأطباق. ومع ذلك، يمكن تقليل أي معاملة أخرى لمنع نمو البكتيريا والعفن بقاء الأجنة حقن.
5-استزراع وتفقيس الأجنة
- بدء التحقق من الأجنة 12 يوما بعد الحقن لليرقات فقست حديثا وتستمر يوميا خلال الأسابيع المقبلة 2.
- نقل اليرقات، باستخدام فرشاة الجميلة، إلى مربع تربية مع الذرة المنبتة والتربة.
ملاحظة: قد ينمو العفن في طبق أجار، ولكن لا يزال سوف تفقس اليرقات في معظم الحالات. ابحث عن اليرقات بعناية داخل القالب للقبض على كل منهم. وقد نقل إلى غطاء الطبق بعض اليرقات وقد تتعثر في التكثيف. - تربية اليرقات في 26 درجة مئوية بعد فكر القياسية تربية أساليب25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان أحد الاعتبارات هامة عند وضع هذا البروتوكول المرحلة التنمية الجنينية في وقت microinjection. على وجه التحديد، يتطلب تحويل germline microinjection من السلطات الوطنية المعينة من قبل سيلولاريزاتيون الجنينية. وهذا لأن السلطات الوطنية المعينة لا يمكن بسهولة عبر أغشية الخلية. محاولات لتصور مراحل تطور فكر الجنينية استخدام وصمة عار نووية باءت بالفشل لأن يذوب ديتشوريونيشن الأجنة فكر أساسا جميع الأغشية الواقية مسؤولة عن سلامة الجنين. ومع ذلك، كان محل هذا الخط من التحقيق قبل صعوبة أخرى – الحصول على كميات كافية من الأجنة في الوقت مناسب. في الحقل، فكر الإناث تضع بيضها في التربة، ومن ثم ينبغي أن يكون ليس من المستغرب أن الإناث يكمن فقط في المختبر، البيض في الظلام. وهذا يجعل مجموعات النهار قصيرة (2-4 ح) صعبة. للتغلب على هذه المشكلة، قد أنجز وضع بيضة واحدة بين عشية وضحاها ووجد أن تسفر عن كميات كبيرة من الأجنة. على الرغم من أن عملية جمع (الشكل 1) ووضع الأجنة (الشكل 2) ل microinjection مرهقة إلى حد ما، إذا فعلت بسرعة هذا البروتوكول يتيح microinjection الأجنة الموجودة بين ح 2-19 القديمة في وقت الحقن، ولا مضى عليها أكثر من 24 ساعة إذا كان يتم إجراء الحقن في الوقت لاحق. مقارنة بين أوقات التنمية بين فكر والأنواع الأخرى تشير إلى أن الأجنة فكر ينبغي أن يظل بريسيلولار في 24 ساعة بعد وضع البيض (انظر المناقشة).
أول المحاولات الرامية إلى تحويل الخط من فكر تشارك الحقن المشارك (الشكل 3) مساعد (المصدر ترانسبوساسي) والجهات المانحة (ينقول) البلازميدات في الأجنة بريسيلولار. وكان علامة التحول بلازميد المانحة جينات البروتينات فلورية خضراء (اجفب) يقودها أحد المروجين active مؤثرا من كاستانيوم تريبوليوم (المروج26ألفا-tubulin ). وكانت معدلات البقاء على قيد الحياة الجنينية البالغين0 المنخفض (الجدول 1)، ولكن ز 26 تم استردادها. لتحديد إذا كان العنصر المانحة إدراج أي الخلايا الجرثومية، ز1 أجنة تم فرزهم للتعبير اجفب. رغم الواقع تحديد النسل الفلورسنت (الشكل 4)، فحص الأجنة فكر مع مصدر الضوء المكثف ثبت أن قاتلة27. الجولة القادمة لتحويل الخط المستخدمة بلازميد الجهات مانحة جديدة، واحدة تمتلك مورثة بروتين فلورسنت أحمر (دسريد) يقودها أحد المروجين active مؤثرا من melanogaster المورفولوجية (بروتين الصدمة الحرارة 70 مروج28 ). في حين كانت معدلات البقاء على قيد الحياة تحسنت كثيرا (الجدول 1)، تنتج الكبار الباقين على قيد الحياة سوى يرقة دسريد إيجابية واحدة (الشكل 5). بيد أن هذه التجارب كانت غنية بالمعلومات وبخاصة فيما يتعلق باثنين. أولاً، أنها اكتشفت أن microinjection بسبب التأخير في التنمية، مما أدى تمديد وقت-إلى-هاتش إلى. بدلاً من أن جميع الأجنة الفقس في غضون أسابيع 2، دبرت حقن الأجنة بين microinjection بوست أيام 12 و 26، مما يتطلب فترة رصد لضمان جمعت جميع hatchlings. وثانيا، لوحظ أن اليرقات فقست حديثا كانت نشطة إلى حد ما. زحف على غطاء حيث أن الحصول على عالقاً، وهرب في بعض الأحيان من طبق أجار. تم التغلب على هذه المسائل بختم أطباق بيتري مع فيلم بارافين وفحص أغطية واجار بعناية ل hatchlings.
تم اختبار النسخة النهائية من هذا البروتوكول حقن قبل ميكروينجيكتينج الأجنة وكر مع المخزن المؤقت لوحدها أو مع مساعد والعين-مروج (3xP329) تميز المانحة الحمض النووي والبلازميدات. كعنصر تحكم إضافية، تم تناول مجموعة أخرى من الأجنة مطابق تماما ولكن قد لا ميكروينجيكتيد. تم حقن أربع مجموعات من الأجنة أما الحل الحقن. تم حقن مجموعة أجنة 485 مع المخزن المؤقت، ومن تلك، 148 دبرت (معدل هاتش = 30.5 في المائة، الجدول 1). 1,450 الأجنة حقن مع بلازميد السلطات الوطنية المعينة، دبرت 289 (معدل = 26.8 في المائة). من المثير للاهتمام، من 470 الأجنة التي خضعت لنفس شروط التعامل مع البيض، ولكن دون microinjection، دبرت 250 فقط (معدل = 53.2 في المائة). أن معدل البقاء على قيد الحياة من الأجنة أونينجيكتيد هو 20% أعلى من معدلات البقاء على قيد الحياة لحقن الأجنة أمر متوقع بسبب أضرار microinjection أمرا لا مفر منه. ومع ذلك، يعتبر فارق ضئيل بين حقن المخزن المؤقت وحقن الحمض النووي، مما يوحي بكمية الحمض النووي تجري إضافة مقبول لفكر (انظر المناقشة). كما أن هذه النتائج تظهر أن تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة على مدى الجهود المبذولة سابقا. النجاح في إقامة خطوط معدلة وراثيا باستخدام هذا الأسلوب قد ذكرت في مكان آخر من27.
رقم 1: جمع البيض. A) الدائرة جمع البيض. ب) وضع طريقة عرض Zoomed في قسم دائرة بيضة بعد بيضة 24-ح. ملاحظة، تشير الأسهم إلى الموقع من عدد قليل من البيض. ج) غسل البيض من القماش القطني. د) النقل النهائي لفكر البيض. ملاحظة، القوس يشير إلى المنطقة مع كثافة فكر الأجنة (أي الحد الأدنى من المياه). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: إعداد شريحة حقن. A) السوداء تصفية ورقة مسجلة محكم لشريحة مجهر قياسية. ب) Zoomed في عرض مقطع من حقن الشريحة أثناء عملية الإعداد. ملاحظة، يشير السهم #1 إلى موقع صف من البيض، وخط #2 جزئية من الغراء و #3 pin المستخدمة لنشر الغراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: حقن الأجنة. شريحة حقن مع ثمانية صفوف من البيض. نظراً لزاوية إبرة الحقن، يمكن حقن الصفوف المتتالية للأجنة بمجرد تحريك المسرح. ملاحظة الصبغ الأحمر في إبرة حقن الإيدز إلى حد كبير تصور الحقن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الجنين1 ز المعدلة وراثيا. الأجنة من الكبار فكر أنه حقن يشترك مع بيجيباك--على أساس والبلازميدات مساعد والجهات المانحة كجنين مبكر. الجنين الأخضر الساطع إيجابي للتعبير البروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب) في حين البعض الآخر لا. التعبير اجفب تحركها مروج تريبوليوم كاستانيوم ألفا-tubulin 26. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: يرقة1 ز المعدلة وراثيا. يرقات الطور الثالث كان له أصل حقن يشترك مع بيجيباك--على أساس والبلازميدات مساعد والجهات المانحة كجنين مبكر. يرقة متوهجة حمراء على اليسار إيجابي للتعبير دسريد، بينما اليرقة على الحق وليس. التعبير دسريد تحركها المروج المورفولوجية melanogaster الصدمة الحرارة 70 28. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| تجربة | العلاج | بيض | فقست | معدل هاتش |
| [ااكسب] #1 | ΑtubEGFP--الجهات المانحة | 910 | 57 | 6.3% |
| [ااكسب] #2 | hsp70DsRed--الجهات المانحة | 1580 | 211 | 13.4 في المائة |
| [ااكسب] #3 | 3xP3EGFP--الجهات المانحة | 1450 | 389 | 26.8 في المائة |
| المخزن المؤقت | 485 | 148 | 30.5 في المائة | |
| لا--حقن | 470 | 250 | 53.2 في المائة |
الجدول 1: البيانات Microinjection. هاتش معدلات من ثلاث تجارب microinjection في الأجنة فكر، إظهار العدد الإجمالي لحقن البيض والعدد الكلي لليرقات التي دبرت بنجاح ومعدل هاتش.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن microinjection لوكر مع دسرناس غرض [رني] تم الإبلاغ عن9، هذا هو البروتوكول الأول إرساء أفضل الممارسات فيما يتعلق ميكروينجيكتينج بريسيلولار وكر الأجنة، عملية حاسمة لإجراء تحول الخط و/أو جينوم كريسبر/Cas9 التحرير في هذه الأنواع. Microinjection الناجح للأجنة فكر يعتمد على عوامل كثيرة، كما كفاءة التحويل. أدناه مناقشة بعض القضايا الرئيسية التي تؤثر على نتائج استخدام هذا البروتوكول للتحول germline في هذا الخنفساء.
الحصول على الأجنة بريسيلولار
الحمض النووي كما ذكر أعلاه، لا عبر أغشية الخلية يمكن دسرنا الطريق. وهذا يعني أن من الأهمية أن حقن الحمض النووي ومرناً، و/أو البروتينات قبل حدوث سيلولاريزيشن. نظراً لتوقيت حقن الحرجة، من المهم تحديد نافذة المحتمل ل microinjection ناجحة استناداً إلى المدة التي يستغرقها إجهاد فكر نونديابوسينج30 لإكمال امبريوجينيسيس. تم حساب هذا استناداً إلى دراسات تفصيلية عن توقيت مرحلة بلاستوديرم المخلوي في آخر بيتل، كاستانيوم تريبوليوم. في تريبوليوم، يحدث سيلولاريزيشن ح ~ 8 وظيفة البيض يكمن في31من 30 درجة مئوية. نظراً لأنه يأخذ أيام ~3.5 تريبوليوم إلى امبريوجينيسيس كاملة عند 30 درجة مئوية، سيلولاريزيشن يقام العاشرة الطريقة عملية. منذ الأجنة فكر يستغرق ما يقرب من 2 أسابيع وضع، قد لا يحدث سيلولاريزيشن حتى وضع البيضة بوست اليوم الثاني. ولذلك، كان من المفترض أن الإطار ل microinjection الناجح هو على الأقل 24 ساعة طويلة، الذي يعتبر مفيداً، حيث تتطلب فكر البيض بين عشية وضحاها زرع لتوفير كميات كافية من البيض ل microinjection. بينما تم استخدام هذا الأسلوب لنجاح ترانسجينيسيس27، من المتصور أنه يمكن تحسين النتائج عن طريق حقن الأجنة الأصغر سنا، شريطة التعامل مع الأجنة في وقت مبكر جداً لا يسبب لهم ضررا.
نوعية الحمض النووي والتركيز
ليس من المستغرب أن تركيز الحمض النووي يلعب دوراً محوريا في نجاح عملية التحول. وكان يعتقد منذ فترة طويلة أن إبقاء تركيز بلازميد الحمض النووي أدناه 1 ملغ/مل النهائي ضروري لتجنب السمية المحتملة ل حقن الأجنة32. على الرغم من أن من الواضح الآن إذا كانت القضايا سمية في الماضي بسبب الحمض النووي ذاته، أو بدلاً من ذلك نتيجة للملوثات التي تم ترحيلها من عملية تنقية بلازميد، هذه القاعدة قد تم ثبات التقيد بعقدين. ومع ذلك، مؤخرا اكتشفنا أن تتجاوز 1 ملغ/مل كان حد ممكن ليس فقط، بل أيضا أن القيام بذلك يمكن تحقيق أعلى معدلات التحول، مما أدى إلى تكهنات بأن عدم وجود سمية البيض قد يكون بسبب التقدم في مجموعات تنقية بلازميد، الناتجة في عدد أقل من الملوثات. ونظرا للوقت المطلوب للخلفية فكر، أي زيادة في معدلات التحول مفيد، حتى ولو أنه يؤدي إلى ارتفاع طفيف في معدلات الوفيات.
تليين سطح البيض قبل microinjection
خلافا تريبوليوم، يجب أن تكون خففت السطح الخارجي معظم (المشيمة) جنين فكر قبل microinjection. هذا خطوة حاسمة حتى عند استخدام الإبر الكوارتز. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تطبق على جنينا واحد قبل الحقن مباشرة المياه، ولكن يمكن تطبيقها على مجموعات من 2 إلى 3 أجنة في وقت واحد إذا كان يمكن أن يتحقق microinjection قبل ريهاردين تشوريونس. دون هذه الخطوة، ستفشل الإبر عموما لاختراق المشيمة، مما يتسبب في فشل محاولة حقن والتي قد تسبب تلفاً غيض الإبرة. وعلاوة على ذلك، إذا حدث الإبرة لاختراق بنجاح من المشيمة جافة، الحل الحقن عادة التسريبات مرة أخرى بسبب الضغط داخل الجنين أعلى من الضغط المحيط. بيد أنه من السهل التمييز بين الجافة من الأجنة (خففت) الرطب. على وجه التحديد، عندما تجف، الأجنة يكون مميز جامدة، مستديرة الشكل، بينما إضافة المياه يسبب لهم تفقد مظهرها كروية. تليين لا يسمح الإبرة لسهولة اختراق المشيمة لكن أيضا يقلل الضغط داخل الجنين ما فيه الكفاية أن الحل الحقن لا يتسرب.
الرطوبة والعفن
وتعقد في بيئة دافئة ورطبة طوال embryogenesis حقن الأجنة. هذه الشروط لا توفر بيئة مثالية لوكر التنمية بل أيضا تعزيز نمو العفن. خلال فترة الأسبوعين هذه، كثيرا ما العفن ينمو على أطباق أجار السكن الأجنة فكر. ولسوء الحظ، الأجنة تتطلب رطوبة عالية، وأسفرت المحاولات للحد من ذلك أقل بكثير من معدلات هاتش. من المثير للاهتمام، أن وجود العفن عموما أثر ضئيل في معدلات هاتش، مع معظم الأجنة الفقس دون مشاكل. وعلاوة على ذلك، العلاجات المضادة للفطور الضارة بفكر الأجنة، حيث يبدو أن أفضل طريقة للحد من نمو العفن لتفادي التلوث؛ تنظيف الأدوات والحاويات، ونظام microinjection قبل الاستخدام، ومحاولة للحفاظ على الوقت الذي تستغرقه ميكروينجيكتينج إلى أدنى حد منذ جراثيم العفن السائدة في العديد من البيئات المختبر.
الاستنتاجات
هذا البروتوكول يهدف إلى تمكين المزيد من الباحثين توظيف التكنولوجيا المعدلة وراثيا في أبحاثهم فكر ونأمل سوف تساعد في تطوير تكنولوجيات الوراثي إضافية لاستخدامها في هذه الحشرة. يمكن أن يكون تطورا على أساس الوراثي تجارب في Tribolium تكييفها لفكر، بمن فيهم33 من الطفرات والجينوم المستندة إلى كريسبر تحرير34. نظراً لأن هذه التقنيات تتطلب microinjection الأجنة بريسيلولار، هذا البروتوكول سيكون مفيداً ليس فقط لدراسات الجينوم الوظيفي القائم على ينقول و/أو كريسبر/Cas9-بوساطة الجينوم التحرير بل أيضا لاستراتيجيات إدارة الآفات على أساس علم الوراثة 35 , 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كان يؤيد هذا العمل بمنحه من "برنامج بحوث شركة مونسانتو الذرة روتوورم المعرفة"، ومنحة رقم AG/1005 (إلى MDL والبطاقة الصفراء) وأموال بدء التشغيل إلى MDL من نكسو. المنح المقدمة من الذرة روتوورم برنامج لشركة مونسانتو البحوث المعرفة (AG/1005) والمؤسسة الوطنية للعلوم، ونادي أيده منح 1244772 المجلس رقم (MDL). الكتاب يعلن لا تضارب المصالح. نادي MDL تصور وتصميم التجارب؛ FC, PW و SP إجراء التجارب؛ نادي و MDL تحليل النتائج؛ ونادي والحرس الوطني و MDL كتب المخطوطة. ونحن نشكر تيريزا اوليري ووليام Klobasa غورسكي ستيفاني قدموه من مساعدة الخبراء في فحص فكر. كما نشكر الدكتور واد الفرنسية (وزارة الزراعة-جمعية الإغاثة اﻷرمنية، والمختبر المركزي للبحوث الزراعية الشمالية، مؤسسة بروكينغز، والتنمية المستدامة) لشحنات بيض إنشاء مختبر المستعمرات وتوفير بروتوكولات تربية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).
- Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
- Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
- Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
- Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
- Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
- Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
- Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162 (2010).
- Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
- Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
- Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
- Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
- O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
- Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Jeggo, P. A.
- Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
- Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
- Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
- Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
- Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
- Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
- Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
- Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
- Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
- Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11 (2007).
- Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).
