Fazendo, testando e usando potássio íon seletivo microeletrodos em fatias de tecido do cérebro de um adulto

Summary

Íons de potássio contribuem para o descanso potencial de membrana das células e a concentração extracelular de K⁺ é um regulador crucial da excitabilidade celular. Descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K⁺-seletivos microeletrodos. Usar tais eletrodos permite a medição da dinâmica de concentração de K⁺ eletricamente evocada em fatias hippocampal adultas.

Abstract

Íons de potássio contribuem significativamente para o descanso potencial de membrana das células e, portanto, a concentração extracelular de K⁺ é um regulador crucial da excitabilidade da célula. Alterou a concentrações extracelulares K⁺ vai afectar a excitabilidade de celular e potenciais de membrana de descanso deslocando o equilíbrio entre Estados fechados, abertos e inativados para canais dependentes de voltagem íon que fundamentam o potencial de ação iniciação e condução. Portanto, é valioso para medir diretamente o extracelular K⁺ dinâmica na saúde e Estados doentes. Aqui, descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K⁺-seletivos microeletrodos. Nós lhes implantado em fatias hippocampal cérebro de um adulto para medir evocada eletricamente dinâmica de concentração de K⁺ . O uso criterioso de tais eletrodos é uma parte importante do kit de ferramentas necessária para avaliar os mecanismos celulares e biofísicos que controlam a concentração extracelular de K⁺ no sistema nervoso.

Introduction

Concentrações de íons potássio estão fortemente regulamentadas no cérebro, e suas flutuações exercem uma poderosa influência sobre o potencial de membrana descanso de todas as células. À luz destas contribuições críticas, um objectivo importante da biologia é determinar os mecanismos celulares e biofísicos que são usados para regular firmemente a concentração de K⁺ no espaço extracelular em diferentes órgãos do corpo^{1 , 2}. a capacidade de medir concentrações de K⁺ com precisão, constitui um requisito importante nestes estudos. Apesar de muitos componentes que contribuem para a homeostase ....

Protocol

Todos os animais de experimentos foram conduzidos em conformidade com o Instituto Nacional de saúde-guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de pesquisa Animal do Chanceler a Universidade da Califórnia, Los Angeles. Todos os ratos foram alojados com comida e água disponível ad libitum em um ambiente de claro-escuro de 12 h. Todos os animais eram saudáveis sem alterações comportamentais óbvias, não estavam envolvidos em estudos anteriores e foram sacrificados durante o ciclo de luz. Dados de experimentos foram coletados de ratos adultos (6-8 semanas de idade para todos os experimentos).

1. pr....

Results

Para a medição selectiva de extracelular K⁺, preparamos íon-seletivo microeletrodos revestidos com uma camada hidrofóbica através de silanização de pipetas de vidro de borosilicato limpo (figura 1A). Este revestimento permite que o ionóforo K⁺ contendo valinomicina para descansar na ponta do eletrodo e permitir apenas K⁺ fluxo através de uma abertura estreita na ponta do eletrodo (figura 1B). Depo.......

Discussion

O método que descrevemos aqui nos permitiu avaliar a dinâmica de K⁺ , em resposta à estimulação elétrica de colaterais de Schaffer em fatias hippocampal agudas de ratos adultos. Nosso método de preparação K⁺ microeletrodos seletiva de íons é semelhante a procedimentos anteriormente descritos^12,13,14,15. No entanto, este método tem vantagens sobre configurações de eletrodo .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac camundongos endogâmicos	Taconic	Stock#B6
Microscópio	Olympus	BX51
Extrator de eletrodos	Sutter	P-97
Ag/AgCl pellet de aterramento	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Dispositivos Moleculares	n/a
Instrumentos de precisão feitos	CMF28G	microfil 28G
Haste de tungstênio	A-M Systems	716000
Eletrodos de estimulação bipolares	FHC	MX21XEW (T01)
Isolador do estímulo Instrumentos	de precisão do mundo	A365
Grama S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Pipetas de vidro borossilicato	Instrumentos de precisão mundial	1B150-4
A a D placa	Digidata 1322A	Axon Instruments
Amplificador de sinal	Multiclamp 700A ou 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computador	Dell	n/a
Cloreto de sódio	Sigma	S5886
Cloreto de Potássio	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Bicarbonato de Sódio	Sigma	S5761
Fosfato de Sódio Monobásico	Sigma	S0751
D-glicose	Sigma	G7528
Cloreto de Cálcio	Sigma	21108
Cloreto de magnésio	Sigma	M8266
valinomicina	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimetil-3-nitrobenzeno	Sigma	40870-25ml
Borato de potássio tetraquis (4-clorofenil)	Sigma	60591-100mg
5% dimetildiclorossilano em heptano	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Ácido clorídrico	Sigma	H1758-500mL
Sacarose	Sigma	S9378-5kg
Pipeta Micromanipulador	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Lente objetiva	Olympus	PlanAPO 10xW