Artigo de método

Avaliação de agentes de indução Hyperpermeability vasculares na pele com o ensaio de milhas

DOI:

10.3791/57524

⸱

19 de junho de 2018

 ,  , 
1UCL Institute of Ophthalmology, University College London

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para medir o vazamento vascular induzido pela administração intradérmica de agentes de promoção de permeabilidade na pele murino. Esta técnica pode ser usada para determinar a capacidade das moléculas de promover ou inibir vazamento vascular ou para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular.

Resumo

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A principal função do endotélio vascular em organismos vertebrados é servir como uma barreira entre o sangue e cada tecido do corpo, através do qual a permeabilidade do endotélio, de células do sangue, macromoléculas do plasma e água pode ser adaptada de acordo com a necessidade fisiológica. Em certas doenças, citocinas e fatores de crescimento são liberados em que se destinam a barreira endotelial para aumentar transitoriamente a permeabilidade vascular; no entanto, sua presença prolongada pode causar hyperpermeability vascular crônica e edema do tecido-prejudiciais desse modo. O ensaio de milhas é uma técnica na vivo que permite aos pesquisadores estudar hyperpermeability vascular através da medição de proxy de escapamento vascular. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado sobre como executar esse procedimento no mouse, que é o organismo modelo mais amplamente usado para estudar patologia e fisiologia dos mamíferos. O procedimento envolve a injeção intravenosa de corante azul de Evans para rotular a albumina circulante seguida por múltiplas injecções intradérmicas de agentes de indução permeabilidade e soluções de controle de veículos em oposição os flancos do mouse. Por conseguinte, corante azul de Evans gradualmente vaza para a derme, onde se acumula e pode ser extraído para quantificação como escapamento induzida pelo agente indutor de permeabilidade em relação ao veículo. O ensaio de milhas pode ser executado em tipo selvagem ou geneticamente modificado em modelos do rato e pode ser combinado com a administração de drogas para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular e identificam agentes/metas capazes de induzir ou bloqueio hyperpermeability.

Introdução

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A principal função do sistema cardiovascular é permitir a transferência de gases, nutrientes e resíduos entre a circulação e tecidos em todos os órgãos. Vasos sanguíneos têm níveis de órgão específico de permeabilidade basal para permitir tais intercâmbios1. Por exemplo, os vasos sanguíneos nos rins são altamente permeáveis, enquanto a barreira hemato-encefálica constitui uma interface altamente impenetrável e apertado2,3,4. As células endoteliais que formam o revestimento interno dos vasos sanguíneos fornecem uma barreira física entre a circulação e tecidos subjacentes e regulam a permeabilidade vascular de forma órgão específico. No entanto, certos estímulos causam um colapso parcial da barreira endotelial para aumentar o extravasamento de fluido de circulação para o interstício acima os níveis basais de1. Tal hyperpermeability é observado, por exemplo, em locais de trauma do tecido, na inflamação, tumores, durante a sepse, nos olhos com doença neovascular ou no cérebro e coração, quando a isquemia do tecido ocorre devido a um acidente vascular cerebral ou infarto do miocárdio, respectivamente 5 , 6 , 7 , 8. quando cronicamente elevada, hyperpermeability leva ao edema, que por sua vez, provoca danos nos tecidos, tais como perda de visão no olho doença9. Assim, a resposta vascular hyperpermeability de modelagem é desejável para compreender os mecanismos que aumentam a permeabilidade endotelial e para testar a eficácia de agentes projetado para inibir isto.

O ensaio de milhas é uma técnica bem estabelecida, comumente usada e relativamente simples que mede escapamento vascular na vivo como uma medida de substituto de hyperpermeability vascular. Mesmo que isso não leva em conta a composição de fatores que podem aumentar o vazamento vascular independentemente do Regulamento da barreira endotelial, tais como pressão arterial ou o fluxo de sangue, o ensaio de Miles geralmente é pensado para fornecer um método confiável para avaliar o permeabilidade-modulando a atividade de substâncias e identificar os sinalização mediadores que promovem a sua actividade. Nesse sentido, o ensaio de Miles tem sido parte integrante de inúmeros estudos que identificaram mediadores de hyperpermeability vascular e seus mecanismos de ação10,11,12,13, 14,15, como o fator de crescimento vascular endotelial VEGF-A que foi originalmente identificada como o fator de permeabilidade vascular VPF16.

Originalmente desenvolvido por milhas e milhas para estudar a permeabilidade vascular em cobaias17, seu ensaio foi posteriormente adaptado para usando ratos, que são agora o organismo modelo de escolha para elucidar os mecanismos moleculares da permeabilidade vascular Regulamento, devido a sua excelente adequação para manipulação genética. Brevemente, corante azul de Evans por via intravenosa é injetado em ratos adultos e autorizado a circular por 30 minutos (Figura 1). Agentes de indução permeabilidade contra o controle do veículo em seguida são injetados por via intradérmica em vários sites em opostos os flancos do rato para induzir vazamento vascular (Figura 1). Por conseguinte, albumina ligados a Evans corante azul extravasates e acumula-se na derme (Figura 1). Após abate humanamente o mouse, azul de Evans é extraído da derme e o nível de vazamento vascular calculado como uma relação do teste de substância para veículo-induzida de densidade óptica (Figura 2).

Protocolo

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Todo o trabalho animal foi realizado seguindo UK Home Office e as orientações institucionais de bem-estar Animal e o corpo de revisão ética (AWERB).

1. preparação Mouse

Nota: Realizar experimentos em ratos adultos pelo menos 8 semanas de idade, até 6 meses de idade. Para demonstrar a reprodutibilidade técnica e sincronismo consistente para cada etapa deste procedimento entre animais diferentes, use um mínimo de 2 e máximo de 6 ratos para cada sessão experimental. Para avaliar o efeito de uma mutação em uma substância indutora de permeabilidade em camundongos geneticamente modificados, idealmente, use 2 ratos mutantes e 2 controles littermate por experimentos.

  1. 24 h antes da estimulante vascular hyperpermeability, anestesiamos ratos usando uma inalação adequada anestésica como isoflurano. Use 3% de isoflurano para indução de anestesia, o braço endireitante reflexo é perdido e o mouse não está respondendo a estímulos externos. Use o isoflurano 1,5% para a manutenção da anestesia (certifique-se de que o mouse tem taxas respiratórias constantes). Sob anestesia, raspe cuidadosamente ambos os flancos de cada rato com um barbeador elétrico, evitando danos à pele.
    Nota: A anestesia é utilizada para evitar causando estresse ao animal e para minimizar o movimento durante o barbear, o que pode resultar em danos à pele.
  2. Retorne o mouse raspado para sua gaiola em casa. Para camundongos machos, coloque cada macho em uma gaiola individual após a recuperação da anestesia para evitar a luta e, portanto, danificar a pele. Para ratos fêmeas, devolvê-los em um grupo de sua gaiola em casa.
    Nota: Se um comportamento de lutando é observado entre ratos masculinos na gaiola, antes do procedimento, separá-los em gaiolas individuais para 3 dias antes do experimento para permitir que o dano potencial da pele curar.
  3. Monitore os ratos até recuperar a consciência (geralmente dentro de alguns segundos) e movimentar a gaiola (geralmente dentro de 1 min).

2. endovenosa injeção de Evans Blue Dye

  1. Em um fluxo laminar, prepare soluções estéreis separadas do maleato de pirilamina de inibidor da histamina (4 µ g / µ l de soro fisiológico a 0,9%) e do corante azul de Evans (1% p/v em soro fisiológico a 0,9%). Esterilize, passando as soluções através de um filtro de 22 µm.
  2. Utilize uma seringa de 1ml estéril com uma agulha 30G intraperitonealmente injetar cada rato com 10 µ l pirilamina maleato solução/grama de peso corporal (figura 1A). Para realizar a nuca de injeção, primeira, o mouse e em seguida incline-a para que a cabeça é direcionada para o chão e o abdômen é dirigido para cima. Injete nos quadrantes inferiores do abdómen longe da linha média para evitar bater a bexiga.
    Nota: O peso dos ratos entre 8 semanas e 6 meses de idade geralmente varia entre 15 e 30 g. maleato de pirilamina inibem a liberação de histamina endógena, que caso contrário seria promover vazamento vascular, independentemente do agente a ser testado.
  3. Coloque o mouse em uma câmara de calor de 37 ° C por 10 min promover a vasodilatação. Como alternativa, use uma lâmpada de calor apropriado, focada na cauda para promover a vasodilatação se é permitida a utilização de uma lâmpada de calor pelas diretrizes éticas do locais.
  4. Mova o um mouse de cada vez para uma retenção de rato e esfregar o rabo com etanol a 70% para limpar a área de injeção e promover vasodilatação.
  5. Usar uma seringa estéril 1 mL com agulha 30G para administrar 100 µ l corante azul de Evans por via intravenosa na veia cauda (figura 1B). Imediatamente, aplica pressão para o local da injeção, segurando a cauda entre um dedo e o polegar para prevenir hemorragias.
    Nota: A visualização da veia da cauda pode ser melhorada direcionando o lamplight para a área de injeção. Mais detalhes sobre a realização de injeções intravenosas na veia de cauda de rato podem ser encontrado em um protocolo publicado18.
  6. Permitir que o corante circular por 30 min.

3. estimular Hyperpermeability Vascular

  1. Usando soluções estéreis em um fluxo laminar, dilua o agente indutor de permeabilidade de interesse a uma concentração que permite que a dose final a ser entregue em um volume de 20 µ l.
    Nota: No experimento de exemplo mostrado na Figura 1-Figura 2, que VEGFA é utilizado para estimular hyperpermeability vascular em uma concentração de 2,5 ng / µ l de PBS, render uma dose total de 50 ng e PBS é usado como um controle de veículo.
  2. Carrega o agente indutor de permeabilidade dos juros e o controle do veículo em 2 separado 300 µ l seringas esterilizadas com uma agulha de 31 mil. Carregar a solução suficiente para injetar cada rato com 20 µ l da solução em triplicado (ou seja, preparar 60 µ l de agente e veículo por rato, mais volume adicional para contabilizar o volume morto da agulha).
  3. Anestesia o primeiro rato a ser testado com isoflurano (3% para a indução de anestesia, reflexo de endireitamento é perdida e o mouse não está respondendo a estímulos externos e 1,5% para a manutenção da anestesia, certificando-se de que o mouse tem taxas respiratórias constantes).
  4. Por via intradérmica, injete 20 µ l do agente promover a permeabilidade do flanco do mouse (Figura 1). Verifique se a agulha está em um ângulo de 15° para a pele. Seleção para a formação de uma bolha levantada dentro da pele que indica uma injeção bem sucedida. Repeti a injecção intradérmica em 2 locais adicionais, um distante menos de 1 cm.
  5. Vire o mouse para expor o flanco 2 e repita injeções triplicadas com a solução de controle de veículo. Grave no papel a posição de cada injecção para facilitar a sua identificação para posterior coleta de amostras de pele.
    Nota: Lidar com a pele de rato com cuidado nesta fase; por exemplo, evite beliscar a pele quando efectuar injecções intradérmicas.
  6. Retorne o mouse injetado para sua gaiola em casa e monitorar o mouse até que ele recupera a consciência (geralmente dentro de alguns segundos) e se move em torno da gaiola.
  7. Enquanto o primeiro rato recupera, imediatamente repita os passos 3.3 e 3.5 com o segundo botão do mouse e assim por diante (até 6 ratos màxima por sessão). Manter um registo do tempo que cada rato foi injetado para ajustar o tempo em que se proceda à etapa subsequente.

4. quantificação de azul de Evans acumulada dentro da derme

  1. Abate cada rato por deslocamento cervical 20 min depois de ter recebido as injeções intradérmicas, observando a mesma ordem em que os ratos foram injetados.
    Nota: A duração do escapamento vascular pode variar de acordo com o agente indutor de permeabilidade usado, e, portanto, o tempo entre a injeção intradérmica e abate pode precisar otimizar.
  2. Lugar cada abatidos mouse sobre suas costas e pino seus pés em uma placa de cortiça enroladas com um tecido limpo (Figura 1).
  3. Usando a tesoura sem corte, faça uma incisão vertical de aproximadamente 3-4 cm da parte inferior do abdome até o peito do rato morto. Com fórceps e um bisturi, embora provoque a pele de ambos os flancos para revelar o lado interno da derme e sites de acumulação de azul de Evans (Figura 1E). Segure a pele frouxa e remover a gordura das regiões em torno do local da fuga com um bisturi. Se necessário, tire uma foto representativa para demonstrar a magnitude do vazamento de azul de Evans na pele.
  4. Impostos especiais de consumo pele regiões compreendendo o corante azul de Evans vazado para cada site usando fórceps e um bisturi, injetaram com o agente indutor de permeabilidade ou veículo.
    Nota: tenha cuidado para limitar o tamanho da mesma forma as regiões da pele para certificar-se que, nos 4,7 etapa subsequente, uma parte semelhante do formamide volume vai ser adsorvida por cada amostra de pele, permitindo que o corante extraído ser diluído em um volume semelhante de formamida restante . O mapa de injeção registrado na etapa 3.5 ajudará a definir a área a ser excisada.
  5. Colocar cada amostra em um tubo de 1,5 mL e o rótulo em conformidade, certificando-se de cada amostra baseia-se na parte inferior do tubo. Armazene as amostras em - 20 ° C até utilização posterior. Se o processamento imediatamente, siga as etapas abaixo.
  6. Secar as amostras de pele durante a noite, colocando os tubos abertos em um forno ou dentro do poço de um bloco de aquecimento a 55 ° C.
  7. Para extrair o corante azul de Evans, adicionar 250 µ l de formamida deionizada para as amostras em uma coifa, feche os tubos. Certifique-se de amostras de pele são todos cobertas pelo formamide e incubam durante uma noite em um forno ou um bloco de aquecimento a 55 ° C.
  8. Centrifugar as amostras em uma centrífuga de bancada na velocidade máxima (> 10.000 x g) por 40 min.
  9. Em uma coifa, transferi 100 µ l do sobrenadante contendo corante de cada amostra em um poço separado de uma placa de 96 poços de fundo transparente, plana (Figura 2A).
  10. Pico de medida absorvância de azul de Evans a 620 nm, com uma leitura de referência de 740 nm em um espectrofotômetro.
    Nota: 620 nm é a absorvância de pico de Evans azul, enquanto 740 nm não é absorvida pelo azul de Evans e atua como um comprimento de onda de referência.
  11. Média as leituras de absorbância de injeções três vias do mesmo agente ou veículo para cada mouse para contabilizar a variabilidade técnica (Figura 2B).
  12. Calcule a diferença de dobra das leituras do agente indutor de permeabilidade contra o controle do veículo (Figura 2).

Resultados

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Usamos o Miles ensaio para avaliar a habilidade do VEGF-A para induzir vazamento vascular em relação ao controle do veículo (PBS) em camundongos C57/Bl6 de sua. Aqui, nós mostramos um representante experimento usando sua ratos estimulados com injeção intradérmica de solução de 20 µ l contendo 50 ng do VEGF-A em PBS ou PBS veículo apenas. Um claro aumento escapamento de corante azul de Evans em amostras de pele injetado com VEGF-A em comparação com PBS foi aparente em situ (Figura 1E) e após a extração do corante em formamida (Figura 2A). Quantificação de vários experimentos que ilustra 50 ng do VEGF-A induz significativamente mais Evans escapamento azul que PBS sozinho (Figura 2B), com uma média aumentar 3 vezes no escapamento vascular em relação ao veículo (Figura 2).

figure-results-1
Figura 1: indução de escapamento vascular no ensaio de Miles. Representação esquemática (top painéis) e imagens correspondentes (painéis de fundo) das etapas sequenciais ao realizar o ensaio de Miles no mouse. (A) pirilamina maleato é injetado intraperitonealmente para evitar a liberação de histamina endógena de 10 a 30 minutos antes da injeção intravenosa (B) de 100 µ l 1% Evans azul para a cauda da veia do mouse. (C), 30 min depois, vascular escapamento é induzido pela injeção intradérmica do agente (50 ng do VEGF-A; verde círculos) contra o controle do veículo (PBS; círculos brancos). (D, E) Para acessar sites de acumulação de azul de Evans, o mouse é abatidos 20 minutos após as injeções intradérmicas e a pele de ambos os flancos dissecados e encurralados. i.p.: intraperitoneal; i.v.: intravenosa; identificação: intradérmica; escala de bares, 1 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: quantificação de escapamento vascular no ensaio de Miles. (A) Evans corante azul é extraído em formamida de amostras de pele obtidos de cada injeção intradérmica na Figura 1 e carregado em uma placa de 96 poços para ler com um Espectrofotômetro de absorção. (B, C) Representação gráfica das leituras de absorbância de múltiplas experiências traçando valores (B) a absorvância normalizada (densidade óptica, OD) de ambos o agente indutor de permeabilidade (VEGF-A; escuro verde círculos) e veículo (PBS; cinza círculos), ou (C) a prega mudança de OD para o agente contra o veículo (barras de erro: SEM). As leituras de absorvância do PBS triplicado e amostras de VEGF-A, mostradas em (A) são em média e mostradas em (B, C) como círculos brancos ou verdes, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Desde sua primeira descrição em 195217, o ensaio de Miles forneceu pesquisadores com um método relativamente rápido, simples e confiável para estudar os mecanismos moleculares de hyperpermeability vascular. Por exemplo, o ensaio de Miles tem sido usado para testar a capacidade e/ou potência dos diferentes agentes para induzir hyperpermeability19,20,21 ou para testar a eficácia do bloqueio hyperpermeability agentes8 ,22,23. Como outro exemplo, agentes que induzem a permeabilidade vascular foram testados em ratos geneticamente modificados e seus controles littermate para determinar os requisitos de receptores específicos e sinal transducing proteínas para hyperpermeability induzida pelo ligante respostas10,11,12,13,14,15,20,23. Várias versões modificadas do ensaio Miles desde tem sido usadas, por exemplo no que diz respeito o palpador usado. Assim, azul de Evans tem sido substituída em alguns estudos com fluorescência-etiquetada dextranos de tamanhos diferentes ou microesferas11,13.

A principal vantagem do ensaio Miles sobre outros ensaios para investigar mecanismos hyperpermeability vascular é que é relativamente fácil de executar e não requer equipamento caro. Além disso, como uma em vivo técnica, este vazamento vascular modelos de ensaio no contexto de vasos intactos, ao contrário de vazamento através de medição em vitro ensaios tais como trans bem ensaios de fluxo ou trans-resistência elétrica endotelial ( Ensaios TEER), que incidem, unicamente, sobre a monocamada endotelial. Os ensaios alternativos na vivo de hyperpermeability vascular podem diferir o Miles ensaio descrito aqui, utilizando uma rota de entrega diferente para o agente indutor de hyperpermeability ou analisando o escapamento vascular em locais diferentes, para exemplo pela entrega sistémica de um agente através da veia da cauda seguido de exame de escapamento vascular nos pulmões ou a traqueia11,13,15. Uma limitação do ensaio Miles é que a injeção intradérmica de certos agentes pode, em princípio, também influenciam a pressão arterial e fluxo além do rompimento da barreira endotelial e, portanto, influenciar a permeabilidade vascular também indiretamente. No entanto, este ensaio recentemente tem sido mostrado para medir a permeabilidade vascular induzida por VEGF-A, independentemente de efeitos na pressão arterial sistêmica15. Outra limitação do ensaio Miles é que camas vasculares em tecidos diferentes podem responder diferentemente a permeabilidade-promoção agentes e os resultados obtidos com um ensaio de Miles na pele podem, portanto, não ser representativa, por exemplo, do que ocorre na pulmão ou cérebro.

Idade e peso do animal podem influenciar o escapamento observado no ensaio de Miles. Para minimizar o efeito dessas variáveis, pesquisadores devem usar littermates ou da mesma forma tamanho e envelhecido ratos como controles. Ao avaliar os mutantes do mouse para um determinado gene de interesse, os ratos devem ser gerados através um heterozigoto contra littermates estratégia e sua reprodução heterozigoto usados como controles. Além disso, é aconselhável a utilização de anestésicos de gás rapidamente reversível, tais como o isoflurano, para evitar a vasoconstrição, o que foi descrita por algumas drogas anestésicas administrada através de injeções parenterais24,25. A injeção de corante azul de Evans na veia lateral da cauda do rato é um passo crítico no presente protocolo e grandemente pode influenciar a qualidade da experiência e dados. Assim, pesquisadores devem ser competentes na realização de cauda veia injeções e irá provavelmente precisar de experiência prévia ou prática antes do início que do ensaio as milhas experimentar. Alternativamente, os investigadores poderiam usar outras vias intravenosa entregar Evans azul, tais como a injeção retro-orbital se eles são experientes com isso. Injeção intradérmica de permeabilidade-promover soluções podem causar danos agente independente à pele. Portanto, injecções intradérmicas não deve exceder 20 µ l de volume, devem sempre ser realizadas na presença do inibidor da histamina e normalizadas para injeções de controle do veículo.

O ensaio de Miles tem sido utilizado por muitos pesquisadores para avaliar os componentes da VEGF-A via de sinalização, por exemplo, porque a permeabilidade vascular VEGF A-induzida provoca ascite em pacientes de câncer16 e edema prejudicando a visão em vários neovascular doença de olho7. Assim, nós e os outros têm usado o ensaio de Miles para comparar o VEGF-A fuga de vascular induzida em ratos que foram geneticamente modificados para a falta de componentes específicos do VEGF-A sinalização cascata12,13,14, 15 , 20 , 23. nosso estudo recente usando esta abordagem revelou que a principal isoforma de VEGF-A patológica, VEGF165, os sinais através de um complexo de VEGFR2 e NRP1, em que o domínio citoplasmático NRP1 promove a ativação de ABL quinase-mediada de quinases família SRC para evocar uma resposta de hyperpermeability14. VEGFA também promove o crescimento de vasos sanguíneos e pode, portanto, ser utilizada terapeuticamente para restabelecer o fluxo sanguíneo para os tecidos isquêmicos, se suas atividades hyperpermeability podem ser especificamente inibidas. Investigação para elucidar o mecanismo molecular que orienta o VEGF-A respostas das células endoteliais vasculares no sentido hyperpermeability vascular pode, portanto, identificar caminhos que podem ser manipulados seletivamente para inibir o edema patológico induzido VEGF-A em doenças, como câncer ou doença isquêmica ocular. O ensaio de milhas, sem dúvida, vai continuar a ser um método útil para apoiar estes e muitos outros tipos de estudos funcionais para elucidar os reguladores moleculares e efetores de hyperpermeability vascular.

Divulgações

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Os autores têm sem interesses conflitantes para declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Laura Denti, Valentina Senatore e o pessoal da unidade de recursos biológicos no Instituto de Oftalmologia da UCL para ajuda com a criação de rato e Camille Charoy para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Medical Research Council (Sr/N011511/1) C. Ruhrberg e uma bolsa de estudo britânico PhD de fundação do coração de gelo J.T. (FS/13/59/30649).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sal de maleato de pirilaminaSigma-AldrichP5514-5GRessuspender em PBS
Formamida DeionizadaSigma-AldrichS4117Use em armário de fumaça
Agulhas Microlance 30g x 0.5"BD 
Plastipak Estéril 1ml LuerBD 
Seriingas MicroFine Estéreis 0,3 ml - 8 mm - 30G BD 
Evans azulSigma AldrichE2129
Limitador
Câmara
Máquina de
IsofluranoMerialap/drugs/220/96
Scalpal 
Tesoura
Fórceps
Eppendorf tubos
Heatblock
Placa
Centrífuga refrigerada de bancada Fator
de crescimento endotelial vascular recombinante 165ReliatechM30-004
305106309659324826de mousede calorcortar cabelorombade cortiça

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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