Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar os folículos nos ovários culturas de ratos jovens sem seccionamento serial. Usando a imunofluorescência todo órgão e tecido de compensação, seccionamento físico é substituído com seccionamento óptico. Este método de preparação da amostra e visualização mantém a integridade do órgão e facilita a quantificação automatizada de células específicas.
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Artigo de método
Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pesquisa no campo da biologia reprodutiva de mamíferos, muitas vezes envolve avaliar a saúde geral dos ovários e testículos. Especificamente, nas fêmeas, aptidão ovário frequentemente é avaliada pela visualização e quantificação dos folículos e ovócitos. Porque o ovário é um tecido tridimensional opaco, abordagens tradicionais exigem laboriosamente, cortar o tecido em numerosas seções seriais para visualizar células por todo o órgão inteiro. Além disso, porque a quantificação por este método geralmente envolve apenas um subconjunto das seções separadas pelo diâmetro aproximado de um oócito de pontuação, é propenso a imprecisão. Aqui, um protocolo é descrito que em vez disso, utiliza compensação de tecido de todo órgão e mancha da imunofluorescência de ovários de rato para visualizar os folículos e ovócitos. Em comparação com as abordagens mais tradicionais, este protocolo é vantajoso para a visualização de células dentro do ovário por vários motivos: 1) o ovário permanece intacto em toda a preparação das amostras e processamento; 2) pequenos ovários, que são difíceis de seção, podem ser examinados com facilidade; 3) celular quantificação é alcançada mais facilmente e com precisão; e 4) o órgão todo fotografado.
Introdução
A fim de estudar a composição celular e características morfológicas dos ovários de mamíferos, os cientistas muitas vezes dependem de experiências na vivo seguidas de reagidos coloração dos ovários de parafina incorporado. Mais recentemente, porém, cultura de ovário todo órgão tem provado para ser uma alternativa eficaz para estudar a função ovárica1,2,3,4 , porque a técnica pode ser acoplada com melhor visualização e ferramentas de quantificação. Tradicionalmente, a análise da morfologia ovariana depende reconstrução tridimensional....
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Protocolo
Institucional Cuidado Animal da Universidade de Cornell e Comissão de utilização (IACUC) aprovou todos os métodos descritos aqui, sob o protocolo n. o 2004-0038 JCS.
1. preparação dos instrumentos e meios de cultura
- Limpe a área de trabalho limpa com 10% de lixívia e permitir que a lixívia ficar na superfície da área de trabalho pelo menos 5 min. Depois de 5 min, retire a excesso lixívia com toalhas de papel limpo e 70% de etanol (EtOH). Limpar o microscópio dissecar cuidadosamente com 70% EtOH.
Nota: É importante que a área de trabalho seja pelo menos semi estéril para evitar contaminação de culturas de órgão. - Enrole....
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Resultados
Este protocolo inclui 6 etapas principais a seguir dissecação dos ovários, conforme descrito na Figura 1. Figura 2 , Figura 3 , Figura 4 destacar as características mais inovadores do presente protocolo, que incluem a otimização do tecido de compensação para os ovários e quantificação de oócito todo tecido usando FIJI.......
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Discussão
O estudo da reprodução dos mamíferos requer usando e quantificação de células especializadas que não são rotineiramente passíveis de cultura de células. No entanto, sistemas de cultura ex vivo são eficazes na manutenção do ovário e do folículo viabilidade1,15. Durante a cultura do ovário, o tecido requer uma maior área de superfície para a troca de nutrientes através da difusão. Portanto, 5 - dia velho rato ovários são ideais em tamanho e forma para a cu.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Rebecca Williams e Johanna Dela Cruz do Cornell BRC Imaging e Andrew Recknagel para sugestões úteis e assistência técnica. Este trabalho foi financiado de institutos nacionais de subsídio de saúde S10-OD018516 (para Cornell Imaging Facility), T32HD057854 para J.C.B. e R01-GM45415 para J.C.S.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tesoura de micro dissecação 4.5", reta, pontas afiadas | Roboz | RS-5912 | Tesoura de micro dissecação |
| Pinça estilo joalheiro 4-3/8", estilo 5 | Pinça de ponta fina | Integra Miltex | 17-305X |
| Tesoura de íris micro 4", pontas retas e afiadas | Integra | Miltex 18-1618 | ou tesoura de mola micro dissecante |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiótico-Antimicótico (100X) | Gibco | 15240062 | Usado na Etapa 1.3.1 |
| Prato Tratado com Cultura de Tecidos de 35 mm | Corning | 430165 | |
| Nunc & trade; Placa de suporte de 24 poços para inserções de cultura de células | ThermoFisher Scientific | 141006 | Tamanho dos poros: 8μ m |
| Paraformaldeído (PFA) | Microscopia Eletrônica Sciences | 15710 | Solução de 16% |
| 1X Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | agitador tridimensional |
| Soro de cabra normal | VWR | 103219-578 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Azida de sódio (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Solução de borohidreto de sódio (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use a solução, em vez do forma de comprimido ou pó |
| Álcool Polivinílico (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Solúvel em água fria |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polietilenoglicol éter terc-octilfenílico |
| Filtros de seringa | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Seringas | BD | 309695 | |
| Camundongo anticorpo anti-p63 (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Diluição 1:500 |
| Coelho anticorpo anti-MVH | Abcam | ab13840 | Diluição 1:600 |
| Alexa Fluor® anti-rato para cabras 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Diluição 1:1000 |
| Alexa Fluor® anti-coelho para cabras 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Diluição 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Ureia | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Software de processamento de imagem | ||
| Pipetas de transferência de plástico descartáveis | VWR | 414044-034 |
Referências
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N.
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Reimpressões e permissões
