Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

Javad Alizadeh; Shahla Shojaei; Simone da Silva Rosa; Adel Rezaei Moghadam; Amir A. Zeki; Mohammad Hashemi; Marek J. Los; Joseph W. Gordon; Saeid Ghavami

doi:10.3791/57646

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Artigo de método

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

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DOI:

10.3791/57646

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11 de novembro de 2018

Javad Alizadeh¹^,² , Shahla Shojaei¹^,²^,³ , Simone da Silva Rosa¹ , Adel Rezaei Moghadam¹^,² , Amir A. Zeki⁴ , Mohammad Hashemi⁵ , Marek J. Los⁶^,⁷^,⁸ , Joseph W. Gordon¹^,⁹ , Saeid Ghavami¹^,²^,¹⁰

¹Department of Human Anatomy and Cell Science, Rady Faculty of Health Sciences, Max Rady College of Medicine, University of Manitoba, ²Biology of Breathing Theme, Children Hospital Research Institute of Manitoba, University of Manitoba, ³Department of Biochemistry, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, ⁴Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, Center for Comparative Respiratory Biology and Medicine, ⁵Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, ⁶Department of Molecular Biology, School of Pharmacy with the Division of Laboratory Medicine in Sosnowiec, Medical University of Silesia, ⁷Centre de biophysique moléculaire - UPR 4301, Centre national de la recherche scientifique (CNRS) CS80054, ⁸LinkoCare Life Sciences AB, ⁹College of Nursing and Children's Hospital Research Institute of Manitoba, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, ¹⁰Health Policy Research Center, Institute of Health, Shiraz University of Medical Sciences

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para investigar a Prenilação e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carregamento de GTPase. Esse protocolo consiste em dois métodos detalhados, nomeadamente o fracionamento de membrana e uma GTPase-lig da imunoabsorção do ensaio. O protocolo pode ser utilizado para medir a Prenilação e GTP carregamento de diferentes outras GTPases pequenas.

Resumo

A família de GTPase pertence à superfamília de Ras e inclui aproximadamente 20 membros em seres humanos. As GTPases Rho são importantes na regulação das diversas funções celulares, incluindo a dinâmica do citoesqueleto, motilidade celular, polaridade da célula, orientação axonal, tráfico vesicular e controlo do ciclo celular. Mudanças na sinalização de GTPase desempenham um papel essencial de regulamentar em muitas condições patológicas, tais como câncer, doenças do sistema nervoso central e doenças do sistema imunológico-dependente. A modificação pós-traducional de vinculação de GTP e GTPases Rho (ou seja, Prenilação por intermediários de via do mevalonato) são fatores-chave que afetam a ativação desta proteína. Neste trabalho, dois métodos simples e essenciais são fornecidos para detectar uma gama ampla de GTPase Prenilação e atividades de vinculação de GTP. Detalhes dos procedimentos técnicos que têm sido utilizados são explicadas passo a passo neste manuscrito.

Introdução

As GTPases Rho são um grupo de pequenas proteínas (21-25 kDa), que são bem conservadas ao longo da evolução e formar uma única subfamília na superfamília de Ras de pequenas GTPases. Cada subfamília dentro desta superfamília, há um núcleo de domínio compartilhado G que está envolvido na atividade GTPase e nucleotídeos troca¹. A diferença entre a família Rho e as outras subfamílias de Ras é a presença de um "domínio de inserção de Rho" dentro da vertente β 5^th e^th 4 hélice α no pequeno domínio GTPase².

Com base na classificação recente, as GTPases Rho são consideradas uma f....