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Summary

Um protocolo para melhorar os sinais de íon de carboidrato em espectrometria de massa MALDI por reformas estruturas cristalinas durante os processos de preparação de amostra é demonstrado.

Abstract

Preparação da amostra é um processo crítico na análise de espectrometria de massa (MS) de hidratos de carbono. Apesar de dessorção/ionização de laser assistida por matriz (MALDI) MS é o método de escolha na análise de hidrato de carbono, reprodutibilidade de dados e sinal pobre do íon de amostras de hidrato de carbono continuam a ser problemas graves. Para análise quantitativa de hidratos de carbono, um protocolo eficaz analítico, oferecendo qualidade superior dos dados é necessário. Este vídeo demonstra os protocolos de preparação de amostra para melhorar a intensidade do sinal e minimizar a variação de dados de carboidratos em MALDI-MS. Após a secagem e cristalização de gotas da amostra, a morfologia do cristal é reformada por metanol antes da análise de espectrometria de massa. A melhoria no sinal de hidrato de carbono é examinada com espectrometria de massa MALDI imagem (IMS). Resultados experimentais mostram que a reforma de cristal ajusta estruturas cristalinas e redistribui os analitos de hidrato de carbono. Em comparação com o método de preparação de gotas secas em convencional MALDI-MS, reforma morfologias de cristal de hidrato de carbono com metanol mostra significativamente melhor intensidade de sinal, distribuição de imagem de íon e estabilidade de dados. Desde os protocolos demonstrados neste documento não implicam mudanças na composição da amostra, eles são geralmente aplicáveis aos vários hidratos de carbono e matrizes.

Introduction

Análise de carboidratos é um assunto importante e desafiador. Carboidratos e seus derivados desempenham importantes funções no vivendo organismos^1,2,3. Estas moléculas têm complicado estruturas e são propensas a se decompor. Muitos deles não podem ser claramente caracterizados devido às dificuldades de separação e deteção. Apesar do laser assistida por matriz (MALDI) de dessorção/ionização espectrometria (MS) foi aplicada a análise de uma ampla gama de biomoléculas, devido à sua sensibilidade e resultados compreensíveis⁴, analisar carboidratos usando MALDI-MS continua para ser um grande desafio devido a eficiência de ionização baixa de tais moléculas⁵. Derivatização química é uma maneira comum para melhorar a eficiência de ionização de hidratos de carbono^6,7, mas tais procedimentos são tempo e consumo de amostra. Além disso, a eficiência de ionização pyrazole hidratos de carbono é ainda menor do que de proteínas. Assim, o desenvolvimento de métodos para melhorar o sinal do hidrato de carbono em MALDI-MS sem procedimentos complicados é necessário.

A aplicação de MALDI-MS para análise quantitativa é um outro assunto desafiador. Um grande problema de MALDI-MS é que sua sensibilidade e dados reprodutibilidade depende criticamente protocolos de preparação de amostra e parâmetros experimentais. Em muitos casos, a análise quantitativa por MALDI-MS é confiável devido morfologias amostra heterogênea e distribuição do analito. Um exemplo bem conhecido é amostras preparadas com uma matriz MALDI (DHB) ácido benzoico-2,5. Quando DHB se cristaliza lentamente sob ambiente ambiental, a extensão da incorporação do analito em cristais de matriz é imprevisível, porque resultantes amostras mostram morfologias irregulares. Tais amostras são geralmente compostos por cristais em forma de agulha e bem grandes. Quando DHB é preparado usando um solvente volátil e/ou uma placa da amostra aquecida, um processo de secagem rápido resulta em cristais bem mais homogêneas e melhor resultados quantitativos^8,9,10. Essa técnica é conhecida como “recristalização” de amostras MALDI. A melhoria é atribuída a melhor incorporação de analitos cristais matriz bem durante o processo de rápida cristalização. Também demonstrámos que ajustar o ambiente de preparação de amostra reduzida a heterogeneidade de sinal de hidrato de carbono e melhoria de resultados quantitativos^11,12. Os achados nestas obras sugerem que a morfologia da amostra é um fator crítico na determinação de qualidade de sinal do hidrato de carbono. Para desenvolver uma estratégia geral para análise diária, um método de reforma de amostra eficiente proporcionando sensibilidade melhorada de carboidratos é necessário.

Examinámos, sistematicamente, a correlação entre sensibilidade de morfologia e hidrato de carbono de amostra em MALDI-MS em um recente relatório¹³. Os resultados obtidos usando vários carboidratos importantes e matrizes de mostrar que o melhor acessório de sinal é cumprido por recristalização secas amostras MALDI. A morfologia das amostras preparadas usando o método convencional da gota secos (DD) é reformada por recristalização rápida com metanol (MeOH). Os protocolos de preparação de amostra detalhada são demonstrados aqui. O protocolo consiste em três etapas principais, incluindo amostra placa pré-condicionamento, deposição de amostra e recristalização e análise de espectrometria de massa. Os carboidratos utilizados incluem sialyl-lewis (SLe^A) e maltoheptaose (MH). DHB é usado como uma matriz de modelo. Os resultados mostram que intensidade de sinal do hidrato de carbono e distribuição espacial aumentou consideravelmente após a recristalização. Esse método pode ser aplicado para amostras com outras matrizes populares, incluindo 2.4.6-trihydroxyacetophenone (THAP) e α– cyano-4-hidroxicinâmicos ácido. Este método serve como uma abordagem geral que pode ser facilmente integrada na rotina do laboratório para análise de carboidratos.

Protocol

1. placa pré-condicionamento da amostra Limpeza da placa de amostra Use luvas de nitrilo para evitar a contaminação da placa da amostra durante a limpeza. Lave a placa da amostra com 100,0 mL de solução de detergente (1,0 mg/mL). Lave a placa da amostra com água destilada-deionizada (DDW). Enxague a superfície da placa de amostra com 30,0 mL de MeOH. Colocar a placa de amostra em um béquer de 600 mL e preenchimento com DDW até a placa da amostra está totalmente imerso em água. Coloque o copo em um ultra-som do banho (ver tabela de materiais) e proceda à sonicação a placa da amostra por 15 min (200 W, 40 kHz). Retire a placa da amostra e explodir em gotas de água usando nitrogênio pressurizado. Depósito de 0,2 µ l de MeOH na placa de amostra para verificar se o MeOH se espalha para outros pontos.Nota: Se MeOH funde-se com outros pontos, repita as etapas 1.1.3-1.1.5; Se não, prossiga para a próxima etapa. Regulação da temperatura da câmara de secagem Use uma câmara de secagem em condições estáveis para secar as gotas, conforme descrito anteriormente,11,12,13. Em particular, use o procedimento detalhado descrito nos passos 2.1-2.5 de UO, Y.-M. et al. 201612. Brevemente: Limpe a câmara de secagem por nitrogênio de temperatura em uma taxa de fluxo constante para manter um ambiente de baixa umidade relativa. Manter a amostra placa temperatura constante a regular – (25 ° C) ou condições de secagem rápida (50 ° C), regulamentada por um bloco de cobre de controlo de temperatura na câmara de secagem. Preparação de soluções de matriz e analito Preparação das soluções-matriz Dissolver DHB em 50% acetonitrila (ACN): 50% DDW para preparar uma solução 0,1 M. Preparação de analitos de hidrato de carbono DissolvaA de SLe em DDW para preparar uma solução de M-4 10. Dissolva o MH em DDW para preparar uma solução de 10-4 M. 2. amostra de deposição e recristalização Nota: Os procedimentos otimizados para analisar quantidades pequenas e regulares de amostras são descritos aqui. Certifique-se de que a temperatura da placa de amostra é estabilizada na temperatura desejada, antes de depositar as soluções. Se a amostra se espalha sobre uma área grande para cobrir outros pontos de amostra durante a recristalização, preparar uma nova amostra ou repita o passo 1.1. Para a análise de uma pequena quantidade (0,1 µ l) de amostraNota: as etapas a seguir foram desenvolvidas para minimizar o consumo de amostra e tempo. É apropriado para análise quantitativa de amostras reais com uma quantidade limitada ou IMS rápida para análise de quantificação. Premix 0,25 µ l de solução de DHB e 0,25 µ l de SLeA ou MH solução em um tubo de microcentrifugadora. Vórtice a solução mista usando um misturador do vortex para 3 s. Spin para baixo a solução mista em uma centrífuga mini por 2 s (2000 x g). Use uma pipeta para retirar 0,1 µ l da solução pré-misturada e imediatamente depositá-lo na placa de amostra.Nota: Quando depositar uma pequena quantidade de amostra, Não manter a solução pré-misturada na ponta da pipeta para mais de 10 s. Espere para o exemplo para secar. Tempos de secagem típicos estão listados na tabela 1. Use uma pipeta para depositar 0,2 µ l de MeOH direita até o ponto de amostra seca. A amostra vai ficar molhado e secar imediatamente.Nota: Certifique-se de que o processo de deposição é terminado em 3 s para evitar a evaporação significativa perda de MeOH. Examine a amostra usando um microscópio. Se as morfologias de cristal não são como eu esperava (ver Figura 1 , por exemplo dos resultados desejados), repita os passos 2.1.1-2.1.6 para preparar uma nova amostra. Usar luvas de nitrilo e Retire cuidadosamente a placa da amostra da câmara de secagem. Para a análise de uma quantidade regular (1 µ l) de amostraNota: As etapas a seguir são desenvolvidas para maximizar a homogeneidade das amostras de hidrato de carbono com a quantidade de amostra utilizada normalmente MALDI. O processo é adequado para a rotina e análises quantitativas. O processo de recristalização redistribui as amostras e matrizes uniformemente para áreas maiores. Premix 2,5 µ l de solução de DHB e 2,5 µ l SLeA ou MH solução em um tubo de microcentrifugadora. Vórtice a solução pré-misturado com um misturador do vortex para 5 s. Spin para baixo a solução mista em uma centrífuga mini por 2 s (2000 x g). Use uma pipeta para retirar 1,0 µ l da solução pré-misturada e imediatamente depositá-lo na placa de amostra.Nota: não uso o restante pré-misturado solução novamente após depositar as amostras. Espere para o exemplo para secar. Tempos de secagem típicos estão listados na tabela 1. Use uma pipeta para depositar 1,5 µ l de MeOH direita até o ponto de amostra seca. A amostra vai ficar molhado e secar imediatamente.Nota: Em casos com temperatura de placa de alta da amostra (50 ° C), a etapa de recristalização deve ser feita dentro de 5 s para minimizar a evaporação de MeOH na ponta da pipeta. Examine a amostra usando um microscópio. Se as morfologias de cristal não são como eu esperava (ver Figura 1 , por exemplo dos resultados desejados), repita os passos 2.2.1-2.2.6 para preparar uma nova amostra. Usar luvas de nitrilo e Retire cuidadosamente a placa da amostra da câmara de secagem. 3. dados de espectrometria de massa aquisição e análise Nota: A análise é executada usando um comercial tempo-de-voo espectrômetro de massa (Tabela de materiais) equipado com uma fonte de íon MALDI. O instrumento é operado pelo software de controle específicos (Tabela de materiais) com energia de laser e atraso de extração previamente otimizada. Espectros são gravados na modalidade linear com uma escala em massa de m/z = 0 – 1500. A potencial de placa da amostra é ± 25 keV e cada espectro em média 10 tiros de laser. Os usuários devem realizar a otimização do instrumento e análise de amostras usando o software compatível e siga as instruções do fabricante do instrumento. Abra o software de controle de instrumento (ver Tabela de materiais). Insira a placa da amostra o espectrômetro de massa. Selecione o método de aquisição de dados previamente otimizada no software. Registre-se a região de toda a amostra para IMS usando o software de imagem (consulte a Tabela de materiais).Nota: Ignore este passo se não fazendo o IMS. Inicie a aquisição de dados em modo em lote do software controle. Plotar as imagens de iões utilizando o software de imagem após a conclusão da aquisição de dados. Analisar usando software de análise de espectros de massa (veja a Tabela de materiais) se os dados são registrados sem uma imagem de íon.

Representative Results

Imagens SEM representante de SLeA misturado com DHB preparado usando DD e métodos de recristalização são mostrados na Figura 1. Uma morfologia típica de DHB como preparado pelo método DD é grandes cristais em forma de agulha na borda e estruturas cristalinas bem no centro dos pontos de amostra. Os comprimentos típicos de tais cristais em forma de agulha são ~ 100 µm. Após a recristalização por MeOH, a amostra tem uma maior área cobert…

Discussion

Heterogeneidade da amostra é que um problema crucial no DD MALDI-MS. é o mais usado método de preparação de amostra, mas os cristais resultantes são altamente heterogêneos. Tais exemplos mostram reprodutibilidade pobre sinal de tiro-ao-shot e amostra-para-amostra. Portanto, procurando por “sweet spots” em áreas de amostra durante a aquisição de dados é um procedimento comum em experimentos MALDI. Tais amostras heterogêneas são impróprias para quantificação em análises de rotina.

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Materials

<strong>Reagent</strong>
Detergent powder	Alconox	242985
Methanol	Merck	106009
Acetonitrile	Merck	100003
2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)	Alfa Aesar	A11459
sialyl-lewis A (SLe<sup>A</sup>)	Sigma-Aldrich	S1782
Maltoheptaose	Sigma-Aldrich	M7753
Pipette tips	Mettler Toledo	17005091
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
<strong>Equipment</strong>
Milli-Q water purification system	Millipore	ZMQS6VFT1
Powder-free nitrile gloves	Microflex	SU-690
600 mL beaker	Duran	2110648
Ultrasonic cleaner	Delta	DC300H
Hygrometer	Wisewind	5330
Nitrogen gas flowmeter	Dwyer	RMA-6-SSV
K-type thermocouples	Digitron	311-1670
Vortex mixer	Scientific Industries	&nbsp;SI-0236
Mini centrifuge	Select BioProducts	Force Mini&nbsp;
Pipette	Rainin	pipet-lite XLS
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Temperature controllable drying chamber	This lab
Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer	Bruker Daltonics
MTP 384 target plate polished steel BC	Bruker Daltonics	8280781
Flexcontrol Version 3.4	Bruker Daltonics		Control software
Fleximaging Version 2.1	Bruker Daltonics		Imaging software
Flexanalysis Version 3.4	Bruker Daltonics		Analysis software