Summary
本文演示了在样品制备过程中, 通过改造晶体结构来增强 MALDI 质谱中的碳水化合物离子信号的协议。
Abstract
样品制备是质谱 (MS) 分析碳水化合物的关键过程。虽然基质辅助激光解吸/电离 (MALDI) MS 是碳水化合物分析中的选择方法, 但碳水化合物样品的不良离子信号和数据重现性仍然是严重的问题。对于碳水化合物的定量分析, 必须有一个有效的分析协议, 提供卓越的数据质量。该视频演示了用于提高信号强度和减少 MALDI 中碳水化合物数据变化的样本准备协议。在样品滴的干燥和结晶后, 在质谱分析前, 甲醇对晶体形态进行了改造。用 MALDI 成像质谱 (IMS) 检测碳水化合物信号的增强。实验结果表明, 晶体的改造调整了晶体结构, 重新分配了碳水化合物的分析。与常规 MALDI 中的干液滴制备方法相比, 甲醇转化碳水化合物晶体形貌明显改善了信号强度、离子图像分布和数据稳定性。由于此处演示的协议不涉及样本组成的变化, 它们通常适用于各种碳水化合物和矩阵。
Introduction
碳水化合物分析是一个重要而具有挑战性的课题。碳水化合物和他们的衍生物在活有机体扮演重要角色1,2,3。这些分子结构复杂, 易于分解。由于分离和检测方面的困难, 其中许多不能清楚地描绘出来。虽然基质辅助激光解吸/电离 (MALDI) 质谱 (MS) 已被应用于分析范围广泛的生物分子, 由于其灵敏度和可理解的结果4, 分析碳水化合物使用 MALDI-MS 继续由于这种分子的电离效率低5, 这是一个主要的挑战。化学衍生是提高碳水化合物6、7的电离效率的常用方法, 但这种过程是时间和样本消耗。此外, 衍生物碳水化合物的电离效率仍然低于蛋白质。因此, 在不需要复杂程序的情况下, 改进 MALDI 中碳水化合物信号的方法是必要的。
MALDI-MS 在定量分析中的应用是另一个具有挑战性的课题。MALDI 的一个主要问题是它的灵敏度和数据重现性主要依赖于样品制备协议和实验参数。在许多情况下, 由于异质样品形貌和分析物分布, MALDI 的定量分析是不可靠的。一个众所周知的例子是用 25-苯甲酸酸 (DHB) MALDI 基质制备的样品。当 DHB 在周围环境下慢慢结晶时, 分析物被纳入基体晶体的程度是不可预知的, 因为结果样品显示不规则的形貌。这种样品通常由大针状和细晶体组成。当 DHB 使用挥发性溶剂和/或加热样品板制备时, 快速干燥过程会产生更均匀的细晶, 并取得更好的定量结果8、9、10。这种技术被称为 MALDI 样品的 "再结晶"。这种改进归因于在快速结晶过程中更好地将分析物纳入精细基体晶体中。我们还表明, 调整样品制备环境减少了碳水化合物信号的异质性和改进的定量结果11,12。这些研究结果表明, 样本形态学是确定碳水化合物信号质量的关键因素。为了制定日常分析的一般策略, 需要有一个有效的样本改革方法来提高碳水化合物的灵敏度。
我们有系统地研究了 MALDI-MS 样品形态学和碳水化合物敏感性的相关性, 在最近的报告13。利用几个重要的碳水化合物和矩阵得到的结果表明, 重结晶干 MALDI 样品能较好地实现最佳信号增强。用甲醇 (甲醇) 快速再结晶法对用常规干液滴 (DD) 方法制备的试样形貌进行了改造。详细的样品准备协议在这里展示。该协议包括样品板预处理、样品沉积和再结晶、质谱分析等三主要步骤。所使用的碳水化合物包括唾液酸化酶 (SLea) 和 maltoheptaose (MH)。DHB 用作模型矩阵。结果表明, 再结晶后碳水化合物信号强度和空间分布明显改善。这种方法可应用于其他常用基质的样品, 包括24、6-trihydroxyacetophenone (行动计划推行) 和αcyano-4-hydroxycinnamic 酸。这种方法是一种一般的方法, 可以很容易地集成在实验室例行的碳水化合物分析。
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Protocol
1. 样品板预适应
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样品板的清洗
- 在清洗过程中, 应佩戴丁腈橡胶手套, 以避免样品板的污染。
- 用100.0 毫升洗涤剂溶液 (1.0 毫克/毫升) 洗手样品板。
- 用蒸馏-去离子水 (DDW) 洗手样品板。
- 用30.0 毫升的甲醇冲洗样品板表面。
- 把样品板放在600毫升烧杯中, 装满 DDW, 直到样品板完全浸入水中。
- 把烧杯放在超声波浴中 (见 材料表), 油脂实验15分钟 (200 W, 40 赫) 的样品板。
- 取出样品板, 用加压氮气吹掉水滴。
- 在样品板上存入0.2 µL 甲醇, 以检查甲醇是否扩散到其他点。
注:如果甲醇与其他点合并, 重复步骤 1.1. 3-1. 1.5;如果没有, 请继续下一步。
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干燥室温度的调节
- 在稳定的条件下使用干燥室来干水滴, 如前所述11、12、13。特别是, 使用 2.1-2.5 的步骤中描述的详细过程, Y. m。等等。201612。简要：
- 用室温氮气在恒定流速下清洗干燥室, 保持低相对湿度环境。
- 保持样品板温度恒定在规则-(25 °c) 或快速干燥条件 (50 °c), 由温度控制铜块在烘干室调控。
- 在稳定的条件下使用干燥室来干水滴, 如前所述11、12、13。特别是, 使用 2.1-2.5 的步骤中描述的详细过程, Y. m。等等。201612。简要：
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基质和分析物溶液的制备
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基质溶液的制备
- 溶解 DHB 在50% 乙腈 (ACN): 50% DDW 准备0.1 米溶液。
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糖类分析剂的制备
- 在 DDW 中溶解 SLea , 准备 10-4米溶液。
- 在 DDW 溶解氢, 准备 10-4米溶液。
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基质溶液的制备
2. 样品沉积和再结晶
注:本文介绍了分析小样本和常规量样品的优化过程。在沉淀溶液之前, 确保样品板温度在所需温度下稳定下来。如果样品在一个大面积上扩散到其他样品点, 在再结晶过程中, 准备一个新的样品或重复步骤1.1。
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对样品的少量 (0.1 µL) 的分析
注意:为尽量减少采样和时间消耗, 已经制定了以下步骤。它适用于数量有限或快速 IMS 的实际样品定量分析。- 预混料0.25 µL DHB 溶液和0.25 µL 的 SLea或 MH 溶液在离心管。
- 涡旋混合溶液使用涡旋混合器为 3 s。
- 在微型离心机中, 旋转2秒 (2000 x g) 的混合溶液。
- 使用吸管抽出0.1 µL 的预混溶液, 并立即将其存放在样品板上。
注:在沉积少量样品时,不要将预混溶液保存在吸管的尖端, 超过十年代。 - 等待样品晾干。表 1列出了典型的干燥时间。
- 用吸管将0.2 µL 的甲醇放在干燥的样品点上。样品马上就会弄湿并晾干。
注:确保沉积过程在3秒内完成, 以避免甲醇的显著蒸发损失。 - 用显微镜检查样品。如果晶体形貌不像预期的那样 (见图 1所示的结果), 重复步骤 2.1. 1-2. 1.6 准备新样品。
- 戴上丁腈橡胶手套, 小心从烘干室取出样品板。
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对样品的常规量 (1 µL) 进行分析
注:下面的步骤是为了最大限度地利用 MALDI 样本量的碳水化合物样品的均匀性而制定的。该过程适用于常规和定量分析。再结晶过程将样品和基体均匀地重新分配到较大的区域。- 预混料2.5 µL DHB 溶液和2.5 µL SLea或 MH 溶液在离心管内。
- 用涡流混合器对 5 s 的预混溶液进行涡旋。
- 在微型离心机中, 旋转2秒 (2000 x g) 的混合溶液。
- 使用吸管抽出1.0 µL 的预混溶液, 并立即将其存放在样品板上。
注:在沉积样品后不要再使用剩余的预混溶液。 - 等待样品晾干。表 1列出了典型的干燥时间。
- 用吸管将1.5 µL 的甲醇放在干燥的样品点上。样品马上就会弄湿并晾干。
注:在高试样温度 (50 °c) 的情况下, 应在5秒内进行再结晶步骤, 以最大限度地减少甲醇在吸管尖端的蒸发。 - 用显微镜检查样品。如果晶体形貌不像预期的那样 (见图 1所示的结果), 重复步骤 2.2. 1-2. 2.6 准备新样品。
- 戴上丁腈橡胶手套, 小心从烘干室取出样品板。
3. 质谱数据的采集与分析
注:分析是使用一个商用飞行时间质谱仪 (材料表), 配备了 MALDI 离子源。该仪器由特定的控制软件 (材料表) 操作, 具有预优化的提取延时和激光能量。光谱以线性模式记录, 其质量范围为 m/z = 0-1500。样品板电位为±25凯文, 每种光谱平均10个激光射击。用户应使用兼容的软件进行仪器优化和样本分析, 并遵循仪表制造商的说明。
- 打开仪表控制软件 (见材料表)。
- 将样品板插入质谱仪中。
- 在软件中选择预优化的数据采集方法。
- 使用成像软件为 IMS 注册整个采样区域 (见材料表)。
注:如果不执行 IMS, 请跳过此步骤。 - 在控制软件的批处理模式下开始数据采集。
- 在数据采集完成后, 用成像软件绘制出离子图像。
- 如果没有离子图像记录数据, 则使用分析软件 (参见材料表) 分析质量谱。
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Representative Results
图 1显示了用 DD 和再结晶方法制备的 SLeA混合 DHB 的代表性 SEM 图像。DD 法制备的典型 DHB 形态为边缘处的大针状晶体和样品点中心的精细晶体结构。这种针状晶体的典型长度为100µm。经甲醇再结晶后, 试样的面积较大, 均匀地覆盖着细小的鳞片状晶体。"鳞片" 晶体的长度约为20-50 µm. 再结晶样品提供比传统 DD 样品所生产的更大的有效表面积。
IMS 结果表明, 鳞片状晶体通常会产生较高的碳水化合物信号强度和更均匀的空间分布。在常规 DD 样品中, 碳水化合物离子信号主要分布在样品斑点的外围。图 2显示了系统性红斑狼疮A和 MH 的 IMS 结果, 并无甲醇再结晶。再结晶后, SLeA和 MH 信号的分布与样品斑点的亮场图像吻合较好。此外, 所有再结晶碳水化合物样品显示在信号强度上的显著增强, 这些结果从 DD 样本。在定量分析中, 由于信号强度和均匀性较高, 再结晶显著提高了数据质量。
再结晶增强碳水化合物信号强度对正负离子模式均有效。图 3比较了 sodiated (正离子模式) 和 deprotonated (负离子模式) 碳水化合物对 DD 样品的信号强度。平均而言, SLeA和 MH 样品的再结晶, 分别以3.9 和3.3 的因子增加 sodiated 信号。对于 deprotonated SLeA, 离子信号通常是由大约4.7 的因子在再结晶后增强。
图1。用 DHB 基质制备 SLeA的 SEM 图像。样品用干滴和再结晶法制备。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。用干滴和再结晶法制备 SLeA和 MH 的图像质谱的典型结果.离子图像代表 sodiated 或 deprotonated 分析物的分布。所有亮场和离子图像都以相同的比例显示。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。用不同的样品制备方法得到碳水化合物信号强度.黑条: sodiated SLeA (m/z: 843);红条: deprotonated SLeA (m/z: 819);蓝色条: sodiated MH (m/z: 1175)。误差线表示标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.
| 样品 | 样品板 温度 (°c) |
样本量 (µL) |
干燥样品 时间 (s) |
甲醇干燥 时间 (s) |
适当的取样区域 扩展后 再结晶 (%) |
| SLeA | 25 | 0。1 | 100-150 | < 5 | 0-200 |
| 1 | 300-350 | < 10 | |||
| 氢 | 0。1 | 100-150 | < 5 | ||
| 1 | 200-350 | < 10 | |||
| SLeA | 50 | 0。1 | < 5 | < 5 | |
| 1 | < 10 | < 10 | |||
| 氢 | 0。1 | < 5 | < 5 | ||
| 1 | < 10 | < 10 |
表 1.试验参数和干燥条件在不同的样品板温度下。
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Discussion
样本异质性是 MALDI 中最常用的样品制备方法, 但合成的晶体是高度异构的。此类样本显示了低投篮和采样采样信号重现性。因此, 在数据采集过程中寻找样本区域中的 "甜点" 是 MALDI 实验中的一个常见过程。这种非均匀样本在常规分析中不适合量化。
在目前的研究中, MALDI 样品形态学通过再结晶优化。再结晶对碳水化合物信号强度和数据稳定性的改善归因于碳水化合物与基质之间的融合。由于大多数碳水化合物和基质的亲水性特性, 甲醇能有效地分解 MALDI 晶体和碳水化合物。观察表明, 甲醇的沉积和快速蒸发将大针状 DHB 晶体转化为细小的鳞片状晶体结构。这一过程也最大限度地减少抽样隔离和增加表面积。根据 IMS 数据, 经过改造的晶体为碳水化合物的电离提供了较好的微环境。特别是, 干燥室的使用是为精确控制的实验参数提供了参考条件。为了进行例行分析, 一般 MS 用户可以遵循环境下的协议来实现类似的增强效果。
再结晶增强的信号也可能是由于有效表面积的增加, 因为 MALDI 是由表面化学反应14,15控制。通过在不同试样温度11、12下制备样品, 研究了 MALDI 晶体的信号强度与有效表面积的关系。与再结晶法相比, 晶体尺寸发生较大变化, 通过调节试样在液滴干燥过程中的温度, 可以实现晶粒尺寸的精细调整。当样品板温度降低40摄氏度时, 当使用行动计划推行作为基质时, 行动计划推行针状晶体的平均尺寸减少10倍。观察表明, 随着晶体尺寸的降低, 碳水化合物信号强度增加13。然而, 降低试样温度不适合常规分析, 因为它不能有效地改变 DHB 的形态, 需要很长的准备时间。
为保证最佳再结晶效果, 应谨慎地进行制备工艺。首先, 新鲜样品混合物通过再结晶方法提供最佳的信号增强。一旦预混溶液暴露于周围环境, 溶液中就会发生预结晶, 从而改变最终的晶体尺寸和形貌。这种形态学变化大概是由于基质/分析物比的改变。观察表明, 这种样品的再结晶不能提供最佳的信号增强。因此, 吹打过程应高效率地操作, 以保护液滴在吸管尖端的预结晶。其次, 在完全改革样本中应采用适当的甲醇量。在再结晶过程中, 应尽快将甲醇沉积到样品表面, 以避免大量的蒸发损耗。如果沉积甲醇的体积不够, MALDI 样品晶体不会完全溶解。相比之下, 大量的甲醇将分散并减少样品的密度。建议在显微镜下观察样品形貌, 以确保晶体形貌在 MS 分析前得到适当的改造。如果晶体形貌没有完全改变 (见图 1和表 1供参考), 那么有必要用同样的程序来准备一个新的样品。
MALDI 中的最佳定量分析方法是利用 IMS 对改造后的样品进行分析。尽管改革显著减少了样本异质性, 但不同区域的分析信号强度仍可能有所不同 (图 2)。与对选定样本位置的手动检查相比, IMS 对整个采样区域进行了分析, 并对不确定性和数据变化进行了平均计算。观察表明, 用常规量 (1.0 µL 样品溶液) 制备的样品的再结晶在定量分析中提供了优异的碳水化合物样品均匀性 (步骤 2.2)。然而, IMS 分析这些样本消耗更多的分析时间比手动检查方法。为了实现快速 IMS 分析, 使用0.1 µL 样例解决方案 (步骤 2.1) 准备样品可以产生小样本区域并减少分析时间。
MALDI 样品的再结晶为 MALDI-MS 敏感和定量分析提供了优良的样品形态学。这一方法的基本原理得到了明确的证明。本研究开发的实验过程对一般实验条件来说是方便有效的。这些实验过程可以很容易地应用于常规分析, 无需额外的成本。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者没有确认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) | Alfa Aesar | A11459 | |
| sialyl-lewis A (SLeA) | Sigma-Aldrich | S1782 | |
| Maltoheptaose | Sigma-Aldrich | M7753 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 mL beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Mini centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | This lab | ||
| Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| MTP 384 target plate polished steel BC | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Flexcontrol Version 3.4 | Bruker Daltonics | Control software | |
| Fleximaging Version 2.1 | Bruker Daltonics | Imaging software | |
| Flexanalysis Version 3.4 | Bruker Daltonics | Analysis software |
References
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