Summary
Dette arbeidet gir en metode for fabrikasjon av droplet-baserte microfluidic plattformer og anvendelse av polyakrylamid mikrosfærer for microsphere PCR forsterkning. Microsphere PCR-metoden gjør det mulig å få enkelt-strandet DNA amplicons uten skille double-strandet DNA.
Abstract
Slippverktøy-baserte microfluidics gjør at pålitelig produksjonen av homogen mikrosfærer i mikrovæskekanalen, kontrollert størrelse og morfologi av innhentet microsphere. En microsphere copolymerized med en acrydite-DNA sonde ble vellykket fabrikkert. Metoder som asymmetrisk PCR, exonuclease fordøyelsen og isolasjon på streptavidin-belagt magnetiske perler kan brukes å syntetisere single-strandet DNA (ssDNA). Men kan ikke disse metodene effektivt bruke store mengder høyrenset ssDNA. Her beskriver vi en microsphere PCR protokoll detaljering hvordan ssDNA kan være effektivt forsterket og atskilt fra dsDNA ved pipettering fra et PCR reaksjon rør. Forsterkningen på ssDNA kan brukes som potensielle reagenser for DNA microarray og DNA-SELEX (systematisk utviklingen av ligander av eksponentiell berikelse) prosesser.
Introduction
Single-strandet DNA (ssDNA) har vært grundig vurdert som et molekylær anerkjennelse element (MRE) på grunn av dens iboende egenskaper for DNA-DNA hybridisering1,2. Utviklingen av ssDNA syntetiske systemer kan føre til biologiske programmer som DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostikk og integrert molekylær sensing basert på supplerende interaksjoner4,5.
Hittil har mikrometer skala polymer partikler blitt vist med microfluidic enheter. Flere microfluidic teknikker har vist seg for å være kraftig for å produsere svært homogen mikrosfærer på kontinuerlig flyt i microchannel miljø6,7.
I studiet av Lee et al. 8, en dråpe-baserte microfluidic plattform for microfluidic syntese av copolymerizable oligo-microsphere og ssDNA forsterkning ble rapportert. Den microfluidic består av to PDMS (polydimethylsiloxane) lag: en øvre del med et microfluidic kanal nettverk for å generere microsphere og en bunn flatt del. Disse består av tre typer PDMS fluidic kanaler: 1) en flyt fokusere kanal for slippverktøy generasjon, 2) en serpentin kanal for å blande to løsninger og 3) en sekvensiell polymerisasjon kanal for microsphere størkning. Når to ikke blandbar flyter innføres i én PDMS fluidic kanal, kan strømmer bli tvunget gjennom smale orifice strukturen. Flyt atferd som kanal geometri, vannmengde og viskositet påvirke størrelsen på og morfologi av microsphere. Derfor kan main flytende stream deles inn i Mikroskala monospheres9,10.
Her tilbys en detaljert microsphere PCR-protokoll for forsterkningen på ssDNA. Først er en dråpe-baserte microfluidic enheten designprosessen beskrevet. Deretter er veien i hvilke polyakrylamid mikrosfærer kan være functionalized med tilfeldige DNA mal på en utfyllende måte forklart. Til slutt vises en microsphere PCR-protokoll for å forsterke ssDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikasjon av en PDMS Microfluidic plattform
- Forberede 20 mL væske PDMS prepolymer ved å blande polymer base og katalysator i Volumforholdet 10:1. Hell 10 mL væske PDMS på en forberedt SU-8 mold på en silicon wafer for øvre del av microfluidic nettverket. For flat nederst, hell samme volum av flytende PDMS på silisium kjeks uten en mold struktur.
Merk: Microfluidic nettverket er designet i en CAD-programmet og deretter konverteres til et photomask for å dikte opp en mester bruke typisk klima og jordsmonn (se Supplerende tall). Denne malen består av negative photoresist SU-8 mold silisium wafer11. - Plass to silisiumskiver belagt med flytende PDMS prepolymer på kokeplate og cure på 75 ° C i 30 min.
- Manuelt løsner herdet PDMS laget fra SU-8 mold. Juster 1,5 mm diameter runde hull boksesekk verktøyet til olje-porten på replikerte microfluidic nettverket for grensesnitt mikron skala flyt kanaler med de makroen prøvene. Slå ut gjennom hullet manuelt.
- Gjenta dette stansing prosessen tre ganger for dannelsen av de to løsningene og utløp porten.
- Utføre hydrofile overflatebehandling på både øvre og nedre PDMS lag ved hjelp av en håndholdt corona behandlet12 i flere sekunder per prøve.
- Stable to plasma-behandlet PDMS lag og varme ved 90 ° C i 30 minutter ved hjelp av en varm plate for PDMS-til-PDMS bånd forarbeide. Angi trykksatt vann bruker sprøytepumpen i tre innløp porter for strukturelle bånd og lekkasje testing av fabrikkerte enheten.
2. produksjon av polyakrylamid Oligo-mikrosfærer
- Forbered perle-blanding i tabell 1.
- Vortex og kort sentrifuge standard ssDNA acrydite merket probe (Ap, 100 μM) og acrylamide:bis (19:1) lagerløsning.
- Forberede løsning jeg ved å blande 25 μL 40% akrylamid bis løsning, 10 μL ssDNA (acrydite sonde), 10 μL 5 x TBE buffer (1.1 M Tris, 900 mM borate, 25 mM EDTA) og 5 μL vann. Forberede løsning II med 50 μL av 20% ammonium persulfate.
- Forberede to sprøyter individuelt fylt med løsning jeg og løsning II, og montere dem på pumpen å innføre løsning flyter inn i microfluidic-plattformen. Forberede mineral olje blandet med 0,4% TEMED for overflaten herding av microsphere.
Merk: TEMED er godt kjent som en fri radikal stabilisator. Frie radikaler kan akselerere hastigheten av polymer formasjon med ammonium persulfate (APS) for å katalysere akrylamid polymerisasjon. - Fyll en glassflaske med 4 mL av mineralolje generere en kontinuerlig strøm.
- Sette inn to rør til to porter i hetten glassflaske som et microfluidic reservoar: pneumatiske porten for bruk av trykkluft inn glassflaske fra luftkompressoren og væske havnen for å forsyne trykk olje til micro channel-nettverk fra glassflaske. Koble rør mellom glassflaske og olje havnen i microfluidic enheten.
- Koble rørene til to løsning portene i microfluidic enheten for å forsyne de to løsningene fra sprøyten pumpene. Sette inn rør til uttaket porten for å overføre den genererte microsphere til begeret.
- Angi inntakets sprøytepumpen 0,4 - 0,7 mL/h. Juster trykkluft presset av kompressoren bruker en regulator (82-116 kPa). Angi rotasjonshastighet (500 rpm) magnetisk rørestang baren i glass begeret på en kokeplate. Operere sprøytepumpen og levere den komprimerte luften generert av en ekstern kompressor i glassflaske/på kontrollen en elektromagnetisk ventil13.
- Observere dannelsen av mikrosfærer i flyt-fokus geometrien og herding av genererte mikrosfærer i glass begeret med en digital mikroskop.
Merk: Microsphere størrelse og produksjon hastighet er avhengig av hastigheten løsninger og stort trykk som brukes for mineralolje strømmen (tabell 2).
3. utfører polyakrylamid Oligo-mikrosfærer teller
- Hemocytometer kvantifisering, ta en liten mengde (ca 100 μL) i vandig løsning av polyakrylamid oligo-mikrosfærer og sted på glass hemocytometer og forsiktig fylle microsphere suspensjon opp av teller kammeret.
Merk: For ytterligere opplysninger, se http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer. - Bruk en mikroskop og hånd telleapparat teller for å telle mikrosfærer i ett sett med 16 torg. Deretter flytter hemocytometer til neste sett med kammer og bære på telle før alle fire sett med 16 hjørner telles.
- Bestemme gjennomsnittlig microsphere telle og beregne antall mikrosfærer i opprinnelige perle suspensjon.
- Overføre 100 μL mikrosfærer slik 1,5 mL microcentrifuge. Fjerne nedbryting gjennom milde sentrifugering (400 x g) og pipettering.
4. utfører DNA hybridisering på overflaten av polyakrylamid Oligomicrosphere
Merk: En identisk DNA sonde med en 5'-NH2-gruppen i stedet for 5-acrytide endring legges til løsning jeg og testet for Ap-inneholder mikrosfærer parallelt. DNA hybridisering resultater er vist i figur 2. Cy3-merket utfyllende oligonucleotide sonder (cAp) løsningen bør plasseres i et mørkt rom.
- Resuspend Cy3-cAp bruker 100 μL 1xTE buffer (TE buffer: 10 mM Tris og 1μM EDTA, pH 8.0) for å oppnå en siste konsentrasjon av 100 μM. For eksempel resuspend 1 pmol cap i 100 mL TE buffer og overføring til et microcentrifuge rør dekket med aluminiumsfolie.
Merk: For strand sekvenser, se tabell 3. - Legge til 100 μM Cy3-cap en bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge rør som inneholder Ap-copolymerized mikrosfærer.
- Trykk røret noen ganger å blande og ruge ved romtemperatur i mørket 1t.
- Forkaste nedbryting og fjerne gjenværende buffer gjennom pipettering.
- Skyll tre ganger med 500 μL TE buffer.
- Resuspend mikrosfærer av trykke forsiktig microcentrifuge røret. Deretter gjentar du trinn 4.4.
- Plasser mikrosfærer på objektglass (75 mm x 50 mm) og dekk med aluminiumsfolie før bildebehandling.
5. asymmetrisk PCR for forsterke ssDNA
- Forberede en asymmetrisk PCR reagens blanding forsterke ssDNA som skal analyseres. Tine reagenser i Tabell 4 på is. Ikke Oppbevar Taq polymerase enzymet (50 U/µL) på is, men heller lagre den på 20 ° C til nødvendig.
- Forsiktig vortex reagenser og deretter kort sentrifuge rør på 10.000 x g for 10 s.
- Kombinere alle reagenser som beskrevet i Tabell 4.
- Plasser prøver i en thermocycler og starte den asymmetriske PCR under følgende betingelser: 25 sykluser (95 ° C for 30 s, 52 ° C for 30 s og 72 ° C for 30 s), 85 ° C i 5 min, holde på 4 ° C.
6. Microsphere PCR for forsterke ssDNA
Merk: Denne delen beskriver protokollen for forsterke ssDNA i et PCR reaksjon rør. Microsphere PCR reaksjoner ble utført i 50 μL av reaksjonen. Detaljert sekvensene brukes til å forsterke ssDNA vises i tabell 5. I dette tilfellet kan Ap på overflaten av mikrosfærer anneal til tilfeldige DNA maler på en utfyllende måte. Dette er et svært viktig skritt for å produsere komplementære DNA tilnærmingene (antisense DNA strand, Figur 3). DNA utvidet brukes som mal for microsphere PCR forsterkning.
- Klargjør microsphere PCR reagens blandingen. Tine reagenser i tabell 6 på is; imidlertid ikke holde Taq polymerase enzymet på is. Lagre den på 20 ° C til nødvendig.
- Forsiktig vortex reagenser og deretter kort sentrifuge rør på 10.000 x g for 10 s.
- Få ca ~ 25 mikrosfærer gjennom mikroskopiske teller.
Merk: Antall mikrosfærer i en reaksjon rør beregnes et lys mikroskop med 40 X forstørrelse. Om ~ 25 mikrosfærer brukes for microsphere PCR forsterkning. Mer informasjon er i trinn 3. - Kombinere alle reagenser som beskrevet i tabell 6.
- Plasser prøver i en thermocycler og starte den asymmetriske PCR under følgende betingelser: 25 sykluser (95 ° C for 30 s, 52 ° C for 30 s og 72 ° C for 30 s), 85 ° C i 5 min, holde på 4 ° C.
- Følgende forsterkning, tilsett 8 μL av 6 x lasting buffer og laste inn 15 μL av hver prøve i 2% agarose gel. Deretter utfører geleelektroforese på 100 V for 35 min i 1 x TAE (Tris-acetate-EDTA, 40 mM Tris acetate, 1 mM EDTA, pH 8.2) buffer.
7. AC confocal mikroskopi oppkjøp
Merk: Resultatene av microsphere-DNA sonde hybridisering er fotografert under en AC confocal mikroskop. Bildeanalyse utføres med ImageJ.
- Fastsette hybridisert mikrosfærer til scenen av mikroskopet i en holder.
- Velg laser (Helium/Neon laser, 543 nm linje) og slå den på i laser kontroll.
- Velg linsen mikroskop kontroll.
- Velg ønsket filteret for Cy3 og kanal konfigurasjon kontroll.
- Start eksperimentet og observere prøven. Innstillinger for AC confocal mikroskopet oppsummeres i Tabell 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fabrikkert polymere slippverktøy-baserte microfluidic plattformen består av to PDMS lag (figur 1a). Tre typer microfluidic kanal nettverk brukes for å generere mikrosfærer: 1) flyt-fokus geometri som vist i figur 1b, 2) en serpentin kanal for å blande løsning jeg og løsning II og 3) en polymerisering kanal for microsphere herding. Høyden på alle kanaler var 60 μm. Hvor kanalen for miksing og polymerisasjon var 74.35 mm og 94.45 mm, henholdsvis. Bredden på microchannel for to ikke blandbar væske renner og en for mineralolje flyten var 100 μm og 200 μm, henholdsvis. Orifice strukturen som brukes for microsphere formasjonen var 50 μm lengde og 25 μm bredde. Vinkelen på diffuser strukturen var 37°. En lab-basert pneumatiske control system for kontinuerlig flyt av mineralolje og to sprøyte-pumper for løsning strømmen (figur 1 c) ble brukt til å generere mikrosfærer i microfluidic plattformen (figur 1 d). Produksjon fart av mikrosfærer var ca 30 mikrosfærer per sekund når infusjonshastigheten løsninger og brukt press var på 0,6 mL/t og 108 kPa, henholdsvis (tabell 2). Diameter i micro channel er 78.7 ± 2.5 m. På-flow syntesen av mikrosfærer kan manipuleres vellykket med den microfluidic enheten. Bead størrelser ble målt etter hevelse. Gjennomsnittlig diameteren på den resulterende mikrosfærer var 150.4 ± 12,8 m. Størrelsesvariantene var om lag 8,5%. Mikrosfærer gjennomgå hevelse i vann, noe som resulterer i en enorm størrelse økning.
Egenskapen copolymerizable for microsphere kan varieres. Vi innlemmet en 5'-acrydite-DNA sonde i microsphere løsningen (løsning jeg, se tabell 1). Etter co polymerisasjon, en komplementære DNA sonde er merket med fluorescerende farge, Cy3, ved romtemperatur for 1 h. Confocal mikroskopi kan brukes å bevise syntese av copolymerizable oligomicrospheres også så funksjonelt hybridisering på den overflaten av mikrosfærer. Fluorescerende bilder av microsphere vises i figur 2. Hvis mikrosfærer er riktig functionalized med 5-acrydite-DNA sonden, bør de føre dekning av fluorescerende aktivitet på overflaten under hybridisering eksperimentet. Om copolymerization ikke oppstår riktig, ville optisk microsphere bildet viser interne-kontaminering inne mikrosfærer. Som vist i figur 2, er det ingen forstyrrelser av tilfeldig-interiør orientering. Dette resultatet tillot oss å utføre DNA sonde presentasjonen i en 3-dimensjonale (3D) ordning og microsphere PCR. Det bør bemerkes at en identisk DNA sonde med en 5'-NH2-gruppen i stedet for en 5'-acrytide endring ikke copolymerize under-flow syntese av microsphere8.
Når du arbeider med mikrosfærer, er manipulere 3D overflaten med en DNA oligo-sonde en mye raskere prosess14. Derfor kan en på-flow microsphere syntese plattform gi et verktøy for ssDNA forsterkning og rensing, som beskrevet i Figur 3. Anti-følelse DNA malen (-, supplerende mal) kan utvides ved å legge til en tilfeldig DNA mal (+, mal). I dette tilfellet først copolymerized 5'-Ap gir en 3-OH slutt for DNA polymerisasjon etter annealing til den komplementære malen (76 nt). Microsphere PCR kan utføres i en enkelt PCR microtube functionalized mikrosfærer, en tilfeldig DNA mal og en Tag-videresende primer. For å skille den resulterende ssDNA amplicons fra tilfeldige DNA mal (+ mal, 76 nt), frem Primeren har en ekstra 24 nukleotid brikke. Hvis frem primeren ikke har en ekstra brikke sekvens, er det svært vanskelig å gjenkjenne mellom ssDNA amplicons og den første tilfeldige DNA-malen.
En asymmetrisk PCR-eksperiment ble utført. Vi var i stand til å observere dsDNA forurensninger som vist i Figur 4. I de fleste tilfeller er det nødvendig å isolere ssDNA streptavidin-belagt magnetiske perler og exonuclease fordøyelsen. Men gjør microsphere PCR effektiv bruk av en enkelt primer (Tag fram primer) å samle ssDNA i vandige fasen. Det forventes at dsDNA forurensninger vil legge til overflaten av mikrosfærer. Derfor fås ssDNA amplicons gjennom pipettering uten behov for sentrifugering. Den resulterende ssDNA ble demonstrert å syntetisk størrelse markører (76 nt ssDNA og 100 nt ssDNA) gjennom gel geleelektroforese analyse.
Figur 1: microfluidic plattformen. (a) fabrikkerte microfluidic plattform, (b) forstørret visning av flyt-fokus geometri, (c) eksperimentelle set-up, og (d) tatt bilder viser kontinuerlig generasjon av mikrosfærer. 1: micro kanal struktur for flyt fokusere geometri, 2: for miksing løsninger, 3: for microsphere størkning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: fluorescerende avlesning av DNA hybridisering på overflaten av mikrosfærer. 5 Acrydite-modifisert DNA sonder (Ap) var i stand til å hybridizing med komplementære Cy3 merket DNA sonder (cAp). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: illustrasjon av microsphere PCR protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: sammenligning mellom konvensjonelle asymmetrisk PCR og microsphere PCR. M; ssDNA markør (76mer og 100mer), Lane 1; Asymmetrisk PCR, Lane 2; Microbeads PCR. Gjengitt med tillatelse fra tidligere arbeid8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | Volum i blanding (μL) | Siste konsentrasjon | |
| Løsning jeg | 40% Acrylamide:bis løsning (19:1) | 25 | 10% |
| 100 μM Acrydite sonde (Ap, 5' - Acrydite-(TTTTTTT, koblingsfunksjonalitet sekvens) AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3') | 10 | 10 ΜM | |
| 5 x TBE buffer (Tris-base-EDTA) | 10 | 0.5 X | |
| Vann | 5 | - | |
| Løsning II | 20% ammonium persulfate | 50 | 10% |
| Løsning III | TEMED (NNN′,N′-Tetramethylethylenediamine) | 8 | 0.40% |
| Mineralolje | 1000 | - | |
Tabell 1. Reagens blanding komponenter for på-flow polyakrylamid microsphere syntese.
| Tilstanden | Microsphere produksjon fart |
|
| Løsning strømningshastighet | Oljetrykk | |
| (mL/t) | (kPa) | (per sekund) |
| 0,4 | 82 | 7.1 |
| 0,5 | 94 | 13.3 |
| 0,6 | 108 | 28,9 |
| 0,7 | 116 | 36,5 |
Tabell 2. Sammendrag av operative forhold og produsert microsphere.
| DNA sonde | Sekvenser |
| Cy3 merket utfyllende oligonucleotide sonde (cAp) | 5-Cy3-AGATAGTAAGTGCAATCT-3 " |
| Tag (første 24 nt)-videresende primer | 5'-GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3 " |
Tabell 3. Oppstartsrekkefølgen av DNA sonder.
| Reagens | Volumet for 1 x reaksjon (μL) | Siste konsentrasjon |
| Tilfeldig DNA-mal | 1 | 1 ng/μL |
| Tag fram primer | 1 | 0,4 ΜM |
| Omvendt primer | 1 | 0.02 ΜM |
| 10 x Taq buffer | 5 | 1 X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2.5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Vann | 37,8 | - |
| Totalt | 50 | - |
Tabell 4. Asymmetrisk PCR reagens blande komponenter i 20 L reaksjon.
| Mal | Sekvens | Lengde (nt) |
| Tilfeldig DNA-mal | 5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT (tilfeldig rekkefølge, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3 " | 76 |
| Tag-Forward primer (Tag-F) | 5'-GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3 " | 42 |
| Omvendt primer | 5'-AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3 " | 18 |
Tabell 5. Oppstartsrekkefølgen for Microsphere PCR.
| Reagens | Volumet for 1 x reaksjon (μL) | Siste konsentrasjon |
| Ap-mikrosfærer | ~ 25 mikrosfærer | - |
| Tilfeldig DNA-mal | 1 | 1 ng/μL |
| Tag-Forward primer | 1 | 0,4 ΜM |
| 10 x Taq buffer | 5 | 1 X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2.5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Vann | 37,8 | - |
| Totalt | 50 | - |
Tabell 6. Microsphere PCR reagens blande komponenter i 50 L reaksjon.
| Skann modus | Flyet |
| Skalering | X: 2,49 μm, Y: 2.49 μm |
| Stabelstørrelse | X: 1272.79 μm, Y: 1272.79 μm |
| Skanne zoom | 0,7 |
| målet | EC Plan-Neofluar 10 x / 0,3 M27 |
| Gjennomsnitt | 1 |
| Pinhole | Ch2: 104 um |
| Filtre | Ch3: LP 420 |
| Strålen splitters | MBS: HFT 488 / 543, DBS1: speil, DBS2: NFT 515, FW1: ingen |
| Bølgelengde | 543 nm 100.0% |
Tabell 7. Innstillinger for AC confocal mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forurensning av dsDNA er et stort problem i ssDNA forsterkning. Det er fortsatt vanskelig å minimere dsDNA forsterkning i konvensjonelle asymmetrisk PCR forsterkning15. Dessuten, selv om tekniske forbedringer for å generere ssDNA har aktivert til å øke effektiviteten av utvalg ytelse, er ssDNA isolasjon fortsatt problematisk på grunn av sin høye kostnader og ufullstendig rensing gir.
Asymmetrisk PCR er en av de mest utfordrende metodene under arbeid med ssDNA. Denne metoden gjelder ulike mengder primer (f.eks, 20: 1 ratio) for å generere store mengder ssDNA. Men er det svært vanskelig å optimalisere hver forsterkning reaksjon for å gi ssDNA. Dermed elimineres biprodukter (dsDNA) fra den resultants4.
For å generere ssDNA uten ekstra separasjon trinn, produsert vi polyakrylamid mikrosfærer å avsløre DNA sonder basert på acrydite copolymerization metoden. Vårt DNA vedlegg metoden var lett tilpasses ved hjelp av en dråpe-baserte microfluidic plattform. Copolymerized oligomicrospheres har Mikroskala diameter ble produsert. Følgelig ble microsphere PCR brukt til å forsterke ssDNA i en enkelt-tube reaksjon. Selvfølgelig, for å tilpasse denne fremgangsmåten for andre PCR-eksperimenter, kreves vanligvis justeringer (f.eksendre forsterkning syklusen, annealing temperatur og mal sekvenser). Avslutningsvis er microsphere PCR detaljert her, gjør det tilgjengelig for bioassay utvikling, DNA sekvensering og DNA microarray analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien er støttet av et prosjekt kalt "kooperativ Research Program for landbruk vitenskap og teknologiutvikling (Project nr. PJ0011642) "finansiert av Rural Development administrasjonen, Sør-Korea. Denne forskningen ble delvis støttet av stipend (NRF-2017R1A2B4012253) av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammet gjennom National Research Foundation (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtiden planlegging, Sør-Korea. Denne forskningen ble også støttet av stipend (N0000717) av programmet utdanning for Creative og industrielle konvergens finansiert av departementet for handel og industri energi, Sør-Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al.
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
