Um ensaio de Neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima

Resumo

Aqui, vamos demonstrar o desempenho de um modelo de lesão medular mínima em um rato adulto que poupa o nicho central canal habitação endógena células tronco neurais (NSCs). Mostramos como o ensaio de neurosphere pode ser usado para quantificar a ativação e migração de NSCs definitivos e primitivos, após lesão.

Resumo

Células-tronco neurais (NSCs) na medula espinhal dos mamíferos adulta são uma população relativamente mitotically quiescente de periventriculares células que podem ser estudados em vitro usando o ensaio de neurosphere. Este ensaio formadoras é uma poderosa ferramenta para estudar a resposta de NSCs para fatores exógenos em um prato; no entanto, isto também pode ser usado para estudar o efeito de manipulações na vivo com a compreensão apropriada dos pontos fortes e limitações do ensaio. Uma manipulação do interesse clínico é o efeito da lesão na ativação endógena do NSC. Modelos atuais de lesão da medula espinhal fornecem um desafio para estudar isto como a gravidade dos modelos comuns de contusão, compressão e transecção causar a destruição do nicho NSC no local da lesão onde residem as células-tronco. Aqui, descrevemos um modelo de lesão mínima que causa danos localizados na superfície dorsolateral superficial do piso inferior torácica (T7/8) da medula espinhal rato adulto. Este modelo de lesão poupa o canal central ao nível da lesão e permite a análise de NSCs que residem no nível da lesão em vários pontos de tempo após lesão. Aqui, nós mostramos como o ensaio de neurosphere pode ser utilizado para estudar a ativação de duas populações distintas, relacionadas com lineally, de NSCs que residem na região periventricular da medula espinhal - NSCs primitivos e definitivos (pNSCs e dNSCs, respectivamente). Demonstramos como isolar e cultura estes NSCs da região ao nível da lesão e o local da lesão de substância branca periventricular. Nossas dissecações pós-cirúrgica da medula espinhal mostram aumento do número de pNSC e neurospheres dNSC-derivado da região periventricular das cordas feridas comparados aos controles, falando de sua ativação através de lesão. Além disso, após lesão, neurospheres dNSC-derivado pode ser isolado do local da lesão — demonstrando a capacidade de NSCs para migrar do seu nicho periventricular para locais de ferimento.

Introdução

O sistema nervoso central contém uma subpopulação de células-tronco multipotentes, auto renovadora que têm a capacidade de dar origem a todas as células nervosas maduro diferentes tipos^1,2,3,4. Essas células-tronco neurais (NSCs) residem em nichos especializados do cérebro e da medula espinhal e pode ser ativadas após lesão para proliferar, migrar e se diferenciar em células maduras neurais. NSCs e seus descendentes foram mostrados para migrar para o local da lesão, em lesão cortical modelos^5,6. No cérebro, NSCs foram mostrados para migrar dos ventrículos laterais para o local da lesão, onde eles se diferenciar em astrócitos que contribuem para a formação de cicatriz glial⁷. Na medula espinhal, no entanto, poucos estudos foram feitos para perguntar se esses mesmos NSCs endógenos podem ser aproveitados para promover a recuperação após a lesão da medula espinhal. De fato, atualmente há um debate sobre se a ativação da pilha de haste piscina na medula espinhal exige um dano físico direto do nicho periventriculares revestem o canal central⁸ ou se os danos para a coluna vertebral cabo parênquima (deixando o tronco nicho de célula intacto) é suficiente para ativar endógena NSCs⁹.

Um número de modelos de lesão (SCI) da medula espinhal têm sido utilizado para estudar a fisiopatologia da lesão aguda e crônica. Estes modelos também tem sido usados para testar potenciais terapias para tratar SCI através de neuroproteção, imunomodulação e desenvolvimento celular transplante/substituição estratégias^10,11,13. Modelos atuais incluem compressão e/ou contusão lesões, que causam déficits funcionais em grande escala, bem como lesões extensas e cavitações no cabo^14,15. Cicatrizes gliais resultantes podem abranger diversos segmentos da coluna vertebral juntamente com a maioria de largura/circunferência do¹⁶da medula espinhal. Assim, enquanto estes modelos são clinicamente relevantes, arranjaram um desafio significativo para estudar a resposta de NSCs endógenas após lesão. Existem modelos de químicos da lesão que pode ser adaptado para causar formas mais leves de lesão que pode poupar o canal central¹⁷. No entanto, esses tipos de lesão focar a desmielinização associada com SCI e não são modelos clinicamente relevantes para o dano físico e/ou mecânico associado com Sci traumático.

Para lidar com as limitações dos modelos de lesão atual, nós adaptamos um agulha faixa mínima SCI modelo, originalmente desenvolvido no rato⁹, para a aplicação em um modelo do rato adulto. Nosso modelo de lesão adaptado pode criar uma lesão consistente na região dorsolateral da medula espinhal do mouse e poupar o canal central para o nível da lesão. A vantagem desse modelo é que ele permite o estudo da cinética de NSC após lesão e sua potencial migração radial para o local da lesão. O uso de um modelo de mouse também permite o uso de ratos transgénicos que permitem o monitoramento de linhagem de NSCs endógenos e seus descendentes após lesão. As propriedades do NSCs mais podem ser avaliadas usando uma forma modificada do ensaio em vitro neurosphere que é introduzida no presente protocolo.

O ensaio de neurosphere é um em vitro formadoras ensaio que permite o isolamento de NSCs na presença de mitógenos. Em densidades de chapeamento clonal, NSCs individuais proliferam para dar origem a colônias esféricas flutuantes de células que são compostas por uma pequena subpopulação de NSCs e uma grande maioria dos progenitores^18,19. Em nosso protocolo, demonstramos o isolamento de duas distintas, relacionadas a lineally NSCs da região periventricular da medula espinhal — sob condições de linha de base e seguir nosso modelo SCI mínimo. Definitiva neural da haste nestin expressa de células (dNSCs) e a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e são cultivados na presença de fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF) e heparina (juntos denominada EFH)²⁰. Estes dNSCs são raros na medula espinhal ingênuo, dando origem a muito poucas neurospheres em vitro. No entanto, mostramos que os dNSCs são ativados mínimo SCI, expandindo os números dos neurospheres isolada da região periventricular²¹a seguir. Células-tronco neurais primitivas (pNSCs) estão a montante do dNSCs na linhagem de células-tronco neurais. pNSCs são excessivamente raros, expressos níveis baixos do marcador pluripotência Oct4 e leucemia responsivo de fator inibitório (LiF)²². pNSCs não formam neurospheres quando isoladas de rato adulto medula espinhal devido à presença de proteína básica de mielina (MBP) em culturas primárias; no entanto, pNSC neurospheres pode ser isolado de ratos deficientes de MBP e seus números são lesões seguintes expandida — semelhantes a dNSCs²¹. Finalmente, mostramos que neurospheres dNSC-derivado pode ser isolado do local da lesão em cedo vezes seguindo mínimo Sci. Estes resultados demonstram que o nosso modelo de lesão e ensaios podem avaliar as características de ativação de periventriculares NSCs tais como sua capacidade de proliferar e migrar em resposta a lesões.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de cuidado Animal da Universidade de Toronto e está em conformidade com o "guia para o cuidado e uso de animais experimentais" (2^nd Edition, conselho canadense no cuidado Animal, 2017).

1. cirurgia de lesão medular mínima

Nota: Antes da cirurgia certifique-se de que todos os materiais e instrumentos cirúrgicos são esterilizados por métodos apropriados (figura 1A).

1. Construa um arco de apoio torácico, acumulando 4 – 5 quadrados de gaze e gravando-os juntos no meio para obter um rolo fixo de gaze.
2. Posicione o mouse na câmara de indução e iniciar a anestesia com isoflurano 5%. Confirme a ausência de um reflexo de pitada de dedo do pé antes de prosseguir, bem como ao longo do processo. Como a cirurgia pode demorar mais de 30 min para completar, otimize para a exposição mínima de isoflurano (5 min a 5%) e o tempo restante de 2 – 3%.
3. Transferi o mouse para um cone de nariz ligado à máquina anestésica em dose de manutenção de isoflurano de 2 – 3%. Use a máquina de cortar cabelo para remover a pele do dorso do animal do meio da costas até as pescoço/orelhas para expor uma área retangular ampla da pele para a cirurgia.
4. Transferi o mouse para um instrumento estereotáxica colocando seu nariz do cone de nariz anexada e estabilizando o crânio com barras de orelha. Manter o isoflurano em 5% durante a colocação das barras de orelha e inferior para 2-3%, quando o mouse é segura no dispositivo estereotáxica.
5. Administrar medicações analgésicas pré-operatório intraperitonealmente — Meloxicam (2,0 mg/kg). Aplica generosamente lubrificação do olho para os olhos de rato aberto para evitar a dessecação da córnea quando sob anestesia.
6. Coloque o arco de apoio torácica debaixo do abdômen do mouse enquanto endireitar o corpo do rato e espinha puxando levemente a base da cauda. Use fita de etiquetagem de laboratório para proteger a cauda e pernas estendidas todos em uma posição de estrela, como. Uma vez seguro, empurre o arco de apoio torácica rostral, do abdome para o tórax superior do mouse — para sustentar a coluna torácica (figura 1B).
7. Prepare um campo cirúrgico estéril, desinfecção a superfície de pele pele-recortado preparada na etapa 1.3 com etanol a 70%, seguida de iodo-povidona. Repita duas vezes. Aplica um pano cirúrgico estéril para manter um campo largo esterilizado.
8. Usando uma lâmina de bisturi de #10, faça uma incisão vertical paralelo ao eixo longitudinal do animal do ponto médio de ambas as lâminas do ombro para a curvatura da coluna torácica. Retrai a pele para expor o tecido mole e o contorno da coluna vertebral (Figura 1).
9. Identifica a borda inferior da almofada gorda supraescapular (isto demarca o nível vertebral T4/5). Com a mesma lâmina #10, com cuidado, mas com força, corte ao longo de ambos os lados do osso T5-T8/9 para desanexar os tendões de costas-musculares da coluna vertebral.
10. Introduza os dentes de afastadores os locais de incisão de cada lado da coluna vertebral. Ajuste a exposição expandindo retractores para elevar suficientemente a espinha sem colocar demasiada pressão sobre as camadas de músculo retraído (Figura 1).
11. Sob o microscópio cirúrgico, limpe cuidadosamente o residual músculo e outros tecidos moles sobrejacentes a espinha para expor o osso vertebral (Figura 1E). Identifica as vértebras que serão removidas por apertando o processo espinhoso das vértebras com fórceps dentado e movê-lo ligeiramente até e para baixo.
    Nota: Isto deve permitir a identificação das articulações intervertebrais e expor as pequenas aberturas (Forame intervertebral) por baixo das vértebras de interesse.
12. Inserir uma cabeça da tesoura curva cega em ambos os lados do Forame intervertebral exposto, caudal para a lâmina vertebral para ser extirpado e cortar as ligação articulações intervertebrais bilateralmente.
13. Levantar a lâmina para cima e corte a fixação superior da lâmina para isolar e remover o osso.
    Nota: Isto irá expor o saco dural intacto que contém a medula espinhal (Figura 1F). Pode haver excessivo sangramento que pode ser controlado, colocando pré-cortados gaze de 1 x 1 cm para as áreas afetadas e/ou lavagem com PBS estéril.
14. Com a veia de linha média dorsal, servindo como um marco, insira uma haste de 45° dobrados de uma ponta de agulha 30G (com agulha bisel voltado para cima) na superfície dorsolateral da medula espinhal (aproximadamente 1 mm de profundidade) em aproximadamente lateral de 0,5 mm para cada lado da linha média.
15. Mova a agulha ~ 2 mm de caudal para rostral (paralelo à linha média) para que toda a extensão do bisel da agulha é inserida no cordão. Remova a agulha, refazendo via o caminho de entrada (Figura 1).
    Nota: Não deve haver nenhum sangramento mas inchaço do tecido espinhal pode ser visto neste passo.
16. Para fechar o ferimento, remover o retractor e suturar os músculos das costas em ambos os lados da lesão junto na linha média usando uma sutura de 6-0. Use uma sutura de seda 4-0 estéril para posteriormente fechar a pele sobrejacente.
17. Aplique pomada antibiótica para o topo da pele para prevenir infecção pós-operatória, usando a ponta de um cotonete de algodão suturado superficial. Administre analgésicos no pós-operatório de 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea, juntamente com fluidos (1 mL de solução de Ringer lactato).
18. Desligue o isoflurano vaporizador e oxigênio. Remova o mouse o local em uma gaiola limpa com nenhum fundamento e dispositivo estereotáxica.
19. Coloque o rato na gaiola cerca de 30 cm de uma lâmpada de calor para a recuperação da anestesia e monitor comportamento após acordar. O rato deve acordar dentro de 5 a 10 min e têm a função de membro posterior com possível paresia e/ou fraqueza de cauda ao acordar.
20. Monitorar o comportamento do mouse ao longo dos próximos dias e fornecer cuidados pós-operatórios adequados e analgésicos (i.e., mash, lactato de solução fluido subcutâneo, 0,1 mg/kg a buprenorfina Ringer 2 x diariamente por via subcutânea para 2-3 dias e peso adequado acompanhamento ) em conformidade aos regulamentos de instalações de animais locais e a nível individual como recuperação podem variar.

2. Neurosphere do ensaio dissecação

Nota: Siga os procedimentos de cultura de tecido estéril adequada em todo.

1. Preparação da solução enzimática
   1. Adicione 32 mL de Earle está equilibrado sal solução (EBSS) à albumina ovomucoid inibidor contendo o frasco de vidro e suavemente vórtice até dissolver.
   2. Adicionar 5 mL de EBSS para um frasco de vidro previamente repartidas papaína e coloque em banho-maria 37 ° C para dissolver. A solução se tornará claro (solução 1).
   3. Tomar 500 µ l de EBSS e adicionar para o pre-repartida DNase que eu vidro frasco para obter uma concentração de 1 mg/mL (solução 2). Misture-os muito delicadamente inclinando-se o frasco e para trás e adicionar 250 µ l desta mistura a solução 1.
      Nota: Todas as soluções feitas (solução 1 e 2) são suficientes para processamento de duas peças de tecido. Se o processamento mais peças de tecido, acomodar com mais preparação da solução.
2. Dissecação e preparação do tecido
   1. Lugar uma limpeza de laboratório embebido em isoflurano na gaiola do rato e permitir que 2-3 min para vapores anestesiar completamente do mouse. Eliminatória seguinte, remover o rato da gaiola e confirmar a ausência de um dedo do pé-pitada reflexo.
   2. Execute o deslocamento cervical com um objeto pontiagudo de metal(ou seja, cartão de gaiola de metal) para abater o animal. Pulverize o animal euthanized meados de volta de seu pescoço generosamente com etanol a 70%.
   3. Na base do crânio, use uma tesoura para cortar a cabeça e descartar em um saco de bio. Fazer uma incisão na pele ao longo de todo o comprimento da parte traseira para expor o músculo e contorno ósseo vertebral (Figura 2A).
   4. Levantar o aspecto medial de cada escápula (IE., omoplata — identificado por sobrejacente do tecido) e usar tesouras para cortar tecidos moles (entre a escápula e vértebras). Separado inteiramente para expor a coluna vertebral subjacente.
   5. Seguindo a curvatura da coluna vertebral, insira o mesmo par de tesouras da abertura torácica superior e isolar a coluna vertebral, cortando-se anexada costelas, músculos e órgãos internos (Figura 2B).
   6. Insira uma tesoura no caudal forame vertebral/abertura e corte as articulações intervertebrais em ambos os lados das lâminas (superfície dorsal). Tome especial cuidado para não danificar o cabo intacto. Continue esse processo até o nível desejado e/ou o comprimento do fio é exposto.
   7. Corte com cuidado a spinal nerve(s) estendendo-se lateralmente da medula antes de transferir o tecido da medula espinhal em uma placa de Petri com fluido cerebrospinal artificial regular. Manter a amostra em gelo (Figura 2).
   8. Sob um microscópio de dissecação, corte o tecido da medula espinhal para incluir ~ 2 mm rostral e caudal para o local da lesão. Usar dois pares de pinças para separar com cuidado o cabo em 2 metades longitudinalmente ao longo das fissuras dorsais e ventrais (Figura 2').
   9. Com micro-tesouras, corte matéria branca dorsolateral ferida. Coloque a peça em um tubo cônico de 15 mL.
   10. Segurando uma metade da medula espinhal para baixo com fórceps, provocar e remover matéria branca usando um outro par de pinças bem ao longo da extensão rostrocaudal da medula espinhal para isolar a região periventricular desejado. Repita para a outra metade da medula espinhal.
   11. Coloque pedaços de tecido periventricular em um tubos cónicos 15ml separado. Use micro-tesouras e picar delicadamente o tecido contra as paredes dos tubos cónicos.
       Nota: As modificações de dissociação de tecido são de papaína dissociação sistema protocolo²³ e de procedimentos de preparação de tecido descrito anteriormente²⁴.
   12. Adicionar 2,5 mL de nova solução 1 (passo 2.1.3) a amostra de tecido e coloque sobre um roqueiro a 37 ° C por 30 min.
   13. Triture levemente o tecido na solução com uma ponta de pipeta de 1.000 µ l. Centrifugar a suspensão de célula nublado x g durante 5 min à RT
   14. Preparar a solução 3 com 2,7 mL de equilibrada solução Earle está de sal, 300 µ l de solução de inibidor ovomucoid (etapa 2.1.1) e 150 µ l do DNase eu solução (etapa 2.1.3).
   15. Descartar o sobrenadante da etapa (etapa 2.2.13) e ressuspender em 1,5 mL de solução 3 da etapa anterior (etapa 2.2.14).
   16. Esta nova suspensão de célula (etapa 2.2.15) em cima de 5 mL de solução de inibidor de ovoimucoid (etapa 2.1.1) em um novo tubo cônico de 15 mL para criar um gradiente descontínuo de densidade da camada. Centrifugar x g por 5 min à RT.
   17. Descartar o sobrenadante e ressuspender em 2 mL de mídia neurobasal. Centrifugar x g por 3 min em RT.
   18. Descartar o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de mídia neurobasal. Filtre a suspensão usando um coador de célula 20 µm seguido de 4 mL de mídia para um volume total de 5 mL.
3. Chapeamento
   1. Preparar meios de cultura para o crescimento de neurosphere, completando neurobasal mídia com fator de crescimento epidérmico (20 ng/mL) / fator de crescimento fibroblástico (20 ng/mL) / heparina (2 µ g/mL) [para NSCs definitivos] ou leukemina fator inibitório (10 ng/mL) [para NSCs primitivos]. Adicione 10 mL de qualquer mídia para um balão de cultura de tecidos de 25 mL.
   2. Use um hemocytometer e corante Trypan azul para calcular o número de células em suspensão (etapa 2.2.18)²⁵. Uma vez calculado, adicionar células para frascos de cultura de tecidos preparados (etapa 2.3.1) para uma densidade clonal de 10 células / µ l e lugar frasco de cultura de tecidos com células adicionados em incubadora para 24 h (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO₂).
      Nota: Um exemplo da técnica da contagem é a seguinte: Tome 10 µ l de suspensão de células e misture com 10 µ l de corante azul de Tripan. Adicione 10 µ l desta mistura em um hemocytometer. Sob um microscópio óptico de 10x, contar o número de células vivas e soma todas as células contadas dentro 4 dos 4 x 4 quadrantes. Use a fórmula: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] para dar o volume da suspensão de células para ser banhado em cada frasco de cultura de tecidos de 25 mL para garantir densidade clonal (10 células / µ l).
   3. Após 24h, suavemente agite o frasco e despeje o conteúdo em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar x g por 5 min à RT.
   4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 a 2 mL de mídia neurobasal fresco.
   5. Repita a etapa 2.3.2 para contar o número de células em suspensão e placa células em densidade clonal em uma placa de cultura de tecido de 24-poço contendo 500 µ l cada de seus meios respectivos mitógeno complementado (EFH para crescimento de NSC definitivo) e LIF para crescimento de NSC primitivo.
      Nota: Usar a fórmula adaptada (5.000 / [X células/4) x 2 x 10 x 1.000) para calcular o volume de suspensão de célula para ser banhado em cada bem contendo 500 µ l de mídia.
   6. Coloque placas contendo células na incubadora (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO₂) para crescer por 7 dias.
4. Contando
   1. Após 7 dias em cultura, remover placas e ver os sob um microscópio de luz. Quantificar neurospheres pela contagem de colônias esféricas que são > 80 µm de diâmetro para culturas dNSCs e > 50 µm de diâmetro para culturas de pNSCs.
      Nota: Se desejar, neurospheres pode ser ainda mais passadas²⁶ ou diferenciadas. Se as células não são mais necessários, elimine adicionando peróxido de hidrogênio acelerado aos poços (cerca de 1 mL) por 20 min para que a cor do meio fica amarela. Em seguida, descarte.

Resultados

Após a cirurgia, os ratos devem experiência mínimos déficits motor, que podem incluir a cauda e possível paresia do membro posterior para até 24 h. Após este tempo, os ratos não devem experimentar nenhuma paralisia do membro posterior e/ou paresia e alterações mínimas na marcha.

A Figura 3 mostra resultados representativos de ensaio de neurosphere 5 dias após a lesão mínima da medula espinhal. Os nú...

Discussão

Durante o procedimento cirúrgico, existem alguns passos críticos onde o pesquisador deve prestar particular atenção a fim de obter resultados óptimos e minimizar a variabilidade entre os animais. Deve ter cuidado com a anestesia inalada (isoflurano) durante a cirurgia como anestésico foi mostrado para ter efeitos neuroprotective com exposição prolongada²⁷. Nesse sentido, ao estudar a capacidade regenerativa da medula espinhal após lesão, fazer um esforço para realizar a cirurgia, mais rapidamente ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Retrátil Agricola	Fine Science Tools	17005-04
Tesoura de Mola Moria Vannas-Wolff (Curvada)	Ferramentas de Ciência Fina	15370-50	Personalize ao encomendar para obter pontas embotadas
Pinça Graefe (Reta, 1 x 2 Dentes)	Ferramentas Fine Science	11053-10
Pinça Graefe Extra Fina (Curvada, Serrilhada)	Ferramentas Fine Science	11152-10	Ou qualquer outra pinça para sutura
Hartman Hemostats (Straight)	Fine Science Tools	13002-10	Ou qualquer outra apropriada para sutura
Bisturi Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Ou qualquer outra
máquina de cortar cabelo	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	ou qualquer outra
máquina de cortar cabelo apropriada instrumento	Stoeling	51500	ou qualquer outra
Buprenorfina			ou qualquer apropriado sancionado pela minha instalação de cuidados com animais
Meloxicam			ou qualquer sancionado apropriado pela instalação de cuidados com animais
Tears Naturale PM	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	ou qualquer outro
Isoflurano	Baxter International Inc	DIN 02225875	ou qualquer outro apropriado para anestesia
Q-tips Cottom Swabs	amazon.ca
Gaze de Algodão	Fisher Scientific	13-761-52
30 G Agulhas	Becton Dickinson	305106	Para Lesões
25 G Agulhas	Becton Dickinson	305122	Para Injeções de Drogas
Seringas de 1 mL	3090659 Becton Dickinson		para injeções de drogas
Seringas de 3 mL	309657	Becton Dickinson	para injeções de fluidos
4-0 uoftmedstore.com de sutura		2297-VS881	para sutura da pele
6-0 uoftmedstore.com de sutura		VS889	para sutura muscular
Pomada de polisporina	amazon.ca	102051
Vaporizador de isoflurano	VetEquip	901806
tubos cônicos de 15 mL	ThermoFisher		Qualquer
placa de Petri	ThermoFisher		qualquer
Trypan Blue	ThermoFisher		apropriado Qualquer
hemocitômetro	ThermoFisher		Qualquer
centrífuga	apropriadaThermoFisher		Qualquer
apropriado Ferramentas de Dissecção Padrão	Ferramentas de Ciências
Finas Microscópio de Dissecção	Zeiss	Stemi 2000
Microscópio de Contagem	Olympus	CKX41
Neural Basal-A Médio	Invitrogen	10888-022
B27	Invitrogen	17404-044
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15070
L-Glutamina	Gibco	25030
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	12700075
30% Glicose	Sigma	G6152	1 M, 9,01 g em 100 mL dH2O
1 M Glicose
7,5% NaHCO3	Sigma	S5761	155 mM, 1,30 g em 100 mL dH2O
155 mM NaHCO3
1 M HEPES	Sigma	H3375	23,83 g em 100 mL dH2O
Apo-Transferrina	R& D Systems	3188-AT
Putrescine	Sigma	P7505
Insulina	Sigma	I5500
Selênio	Sigma	S9133
Progesterona	Sigma	P6149
Sistema de Dissociação de Papaína	Worthington Biochemical Corporation	PDS	1 frasco de papaína pode ser usado para 2 amostras
Fator de Crescimento Epidérmico	Invitrogen	PMG8041	Pó reconstituído com 1mL de Mistura Hormonal e aliquotado em frascos de 20uL para ser armazenado no freezer
Fator de Crescimento de Fibroblastos	Invitrogen	PHG0226	Pó reconstituído com 0,5 mL de Mistura Hormonal e aliquotado em 20 μ Frascos L para serem armazenados no freezer
Heparina	Sigma	H3149
Fator Inibidor de Leucemia	em Casa
Hemocitômetro
Azul
Tripano 24 Placas de poços	NUNC
2 M NaCl	Sigma	S5886	11,69 g em 100 mL dH2O
1 M KCL	Sigma	P5405	7,46 g em 100 mL dH2O
1 M MgCl2	Sigma	M2393	20,33 g em 100 mL dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1,59 g em 100 mL dH2O