Summary
Her, viser vi udførelsen af en minimal rygmarv skade model i et voksen mus, der skåner den centrale kanal niche bolig endogene neurale stamceller (NSCs). Vi viser, hvordan neurosphere analysen kan bruges til at kvantificere aktivering og migration af endelige og primitive NSCs efter skade.
Abstract
Neurale stamceller (NSCs) i den voksne pattedyr rygmarven er en forholdsvis mitotically inaktiv befolkning på periventricular celler, der kan blive undersøgt in vitro- ved hjælp af neurosphere assay. Denne kolonidannende assay er et kraftfuldt værktøj til at studere NSCs svar på eksogene faktorer i en skål; Dette kan dog også bruges til at studere effekten af i vivo manipulationer med den rette forståelse af styrker og begrænsninger af analysen. En manipulation af den kliniske interesse er effekten af skade på endogene NSC aktivering. Nuværende modeller af rygmarvsskader giver en udfordring at studere dette som sværhedsgraden af fælles kontusion, kompression og transection modeller forårsage ødelæggelse af NSC niche i stedet for skaden, der hvor stamcellerne findes. Her, beskriver vi en minimal skade model, der forårsager lokaliserede skader på den overfladiske dorsolateral overflade af de lavere thorax niveau (T7/8) af voksen mus rygmarven. Denne skade model skåner den centrale kanal på skade, og tillader analyse af de NSCs, der findes på niveauet af læsion på forskellige tidspunkter efter skade. Her, vi viser, hvordan neurosphere analysen kan udnyttes til at studere aktivering af de to særskilte, lineally-relaterede, populationer af NSCs, der bor i regionen rygmarven periventricular - primitive og endelig NSCs (pNSCs og dNSCs, henholdsvis). Vi demonstrere, hvordan at isolere og kultur disse NSCs fra regionen periventricular på niveauet af skade og hvide substans skaden site. Vores post-operative rygmarven dissektioner Vis øgede antallet af pNSC og dNSC-stammer neurospheres fra regionen periventricular af tilskadekomne snore i forhold til kontrol, taler til deres aktivering via skade. Desuden, efter skade, dNSC-afledte neurospheres kan isoleres fra skaden site — demonstrere evne til NSCs at migrere fra deres periventricular niche til steder af skade.
Introduction
Det centrale nervesystem indeholder en delpopulation af selvstændig fornyelse, Multipotente stamceller, der har kapacitet til at give anledning til alle de forskellige modne neurale celle typer1,2,3,4. Disse neurale stamceller (NSCs) er bosat i specialiserede nicher i hjernen og rygmarven og kan aktiveres efter skade for at formere sig, overflytte, og skelne modne neurale celler. NSCs og deres afkom har vist sig at migrere til skaden site i kortikal skade modeller5,6. I hjernen, har NSCs vist sig at migrere fra laterale hjertekamrene til stedet, skaden hvor de differentiere i astrocytter, der bidrager til glial ar dannelse7. I rygmarven, dog har få studier gjort for at spørge, hvis disse samme endogene NSCs kan udnyttes til at fremme nyttiggørelse efter rygmarvsskade. Faktisk er der i øjeblikket en debat om, om aktiveringen af stamceller pool i rygmarven kræver en direkte fysisk beskadigelse af periventricular niche foring den centrale kanal8 eller hvis skaderne på spinal ledning parenkym (forlader stilken celle niche intakt) er tilstrækkelig til at aktivere endogene NSCs9.
En række rygmarv skade (SCI) modeller har været brugt til at studere Patofysiologi af akutte og kroniske skade. Disse modeller har også været brugt til at teste potentielle behandlingsformer til at behandle SCI gennem neuroprotection, immunomodulation og udvikle celle transplantation/udskiftning strategier10,11,13. Nuværende modeller omfatter komprimering og/eller kontusion skader, som forårsager store funktionelle mangler samt omfattende læsioner og cavitations i ledningen14,15. Deraf følgende glial ar kan spænde over flere spinale segmenter flertal på bredde/omkreds af rygmarven16. Således, mens disse modeller er klinisk relevant, de har råd til store udfordringer til at studere svar af endogene NSCs efter skade. Der er kemiske modeller af skade, der kan tilpasses for at forårsage mildere former for skade, der kan afse den centrale kanal17. Men disse typer skader fokusere på demyelinering forbundet med SCI og er ikke klinisk relevante modeller for de fysiske og/eller mekaniske skader forbundet med traumatiske SCI.
For at løse de aktuelle skade modellers begrænsninger, har vi tilpasset en nål spor minimal SCI model, oprindelig udviklet i rotte9, til anvendelse i en voksen musemodel. Vores tilpasset skade model kan skabe en sammenhængende læsion af rygmarven mus dorsolateral regionen og Skåne den centrale kanal i omsætningsled skade. Fordelen ved denne model er, at den tillader undersøgelse af NSC kinetik efter skade og deres potentielle radial migration til stedet, skaden. Brug af en musemodel tillader også brug af Transgene mus, der tillader afstamning sporingen af endogene NSCs og deres afkom efter skade. Egenskaberne for NSCs kan yderligere vurderes ved hjælp af en modificeret form af den i vitro neurosphere analyse, der introduceres i denne protokol.
Neurosphere analyse er en in vitro- kolonidannende assay der tillader dyrkning af NSCs i nærværelse af mitogens. Ved klonede plating tætheder formere individuelle NSCs for at give anledning til frit svævende sfæriske kolonier af celler, der består af en lille delpopulation af NSCs og et stort flertal af stamfaderen18,19. I vores protokol, vi vise isolering af to særskilte, lineally-relaterede NSCs fra regionen periventricular af rygmarven — baseline betingelser og efter vores minimal SCI model. Endelig neurale stamceller celler (dNSCs) udtrykkelige nestin og glial fibrillære sure protein (GFAP) og dyrkes epidermal vækstfaktor (EGF), fibroblast vækstfaktor (FGF) og heparin (sammen kaldet EFH)20. Disse dNSCs er sjælden i rygmarven naive, giver anledning til meget få neurospheres i vitro. Vi viser imidlertid, at dNSCs aktiveres efter minimal SCI, udvide antallet af neurospheres isoleret fra periventricular region21. Primitive neurale stamceller (pNSCs) er opstrøms af dNSCs i det neurale stamceller afstamning. pNSCs er overordentlig sjælden, udtrykkelig lave niveauer af pluripotency markør Oct4, og leukæmi hæmmende faktor (LiF) lydhør22. pNSCs ikke er en neurospheres når isoleret fra voksne mus rygmarven på grund af tilstedeværelsen af myelin grundlæggende protein (MBPS) i primære kulturer; men pNSC neurospheres kan isoleres fra MBP mangelfuld mus og deres antal er udvidet følgende skade — svarende til dNSCs21. Endelig viser vi, at dNSC-afledte neurospheres kan isoleres fra stedet, skaden på tidligt gange efter minimal SCI. Disse resultater viser, at vores skade model og assays kan vurdere aktivisering Karakteristik af periventricular NSCs som deres evne til at formere sig og vandrer som reaktion på skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev godkendt af Animal Care Udvalget på University of Toronto og er i overensstemmelse med den "Guide til the Care og brugen af forsøgsdyr" (2nd Edition, canadiske Rådet på Animal Care, 2017).
1. minimalt rygmarv skade kirurgi
Bemærk: Før kirurgi Sørg for at alle kirurgiske instrumenter og materialer er steriliseret ved egnede metoder (figur 1A).
- Opbygge en thorax støtte svangen af rullende op 4-5 pladser i gaze og tape dem sammen i midten for at opnå en fast rulle gaze.
- Placere musen i salen, induktion og indlede anæstesi med 5% isofluran. Bekræfte fravær af en tå knivspids refleks, før du fortsætter, samt på hele proceduren. Da operationen kan tage op til 30 min til at fuldføre, optimere for minimal isofluran eksponering (5 min på 5%) og den resterende tid på 2-3%.
- Overføre musen til en næsen kegle knyttet til den bedøvende maskine på 2-3% isofluran vedligeholdelsesdosis. Bruge hårklippemaskiner for at fjerne skind fra dorsum af dyr fra midten tilbage op til nakken/ørerne til at afsløre en bred rektangulære område af huden for kirurgi.
- Overføre musen til et stereotaxisk instrument ved at placere sin næse i den vedlagte næse kegle og stabilisere kraniet med øre barer. Vedligeholde isofluran på 5% under placering af øre barer og lavere tilbage til 2-3%, når musen er sikret i enheden stereotaxisk.
- Administrere præoperativ smertestillende medicin intraperitoneal — Meloxicam (2,0 mg/kg). Generøst anvende eye smøring på åben mus øjne at forhindre hornhinde udtørring når under anæstesi.
- Placer thorax støtte svangen under musen maven mens glatning ud mus krop og ryg af let trækker på basis af halen. Brug laboratorium mærkning tape til at sikre halen og alle udvidet lemmer i en stjerne-lignende holdning. Når sikker, skubbe thorax støtte svangen rostrally, fra mus maven mod den øvre brystkasse — så afstive den brysthvirvelsøjlen (figur 1B).
- Forbered en steril kirurgiske felt ved desinficering af pels-klippede hudområde forberedt i trin 1.3 med 70% ethanol, efterfulgt af povidon-jod. Gentag to gange. Anvend en steril kirurgiske drapere for at holde en bred sterilt felt.
- Brug en #10 skalpel klinge, lave et lodret snit parallelt med koeretoejets laengdeakse dyret fra midtpunktet af begge skulderbladene til krumningen af den brysthvirvelsøjlen. Trække huden til at udsætte blødt væv og rygsøjlen kontur (figur 1 c).
- Identificere den nederste kant af den suprascapular fedt pad (dette afgrænser T4/5 vertebrale niveau). Med den samme #10 blade, omhyggeligt men med kraft, skære langs begge sider af vertebrale knoglen T5-T8/9 at løsrive back-muskel sener fra kolonnen.
- Indsæt tænderne af retraktorer i snit websteder på hver side af rygsøjlen. Justere eksponeringen ved at udvide retraktorer for at tilstrækkeligt ophøje rygsøjlen uden at lægge for meget pres på tilbagetrukken muskel lag (fig. 1 d).
- Under kirurgisk mikroskop, ren forsigtigt den resterende muskler og andet blødt væv overliggende rygsøjlen for at udsætte den vertebrale knogle (figur 1E). Identificere ryghvirvler, der vil blive fjernet ved knugede spinosus processen af ryghvirvler med tandet pincet og flytte det lidt op og ned.
Bemærk: Bør dette give mulighed for identifikation af intervertebrale led og eksponere de små åbninger (intervertebral foramina) nedenunder ryghvirvler af interesse. - Indsætte et hoved af den buede afrundede saks i begge sider af den udsatte intervertebrale foramen, caudale til den vertebrale lamina at blive skåret ud ud, og skære de tilsluttende intervertebrale led bilateralt.
- Løft lamina opad og afbrød den øverste fastgørelse af lamina at isolere og fjerne knoglen.
Bemærk: Dette vil afsløre den intakt dural sac indeholder rygmarven (figur 1F). Der kan være overdreven blødning, som kan kontrolleres ved at placere forud skårne 1 cm x 1 cm gaze på de berørte områder og/eller vaske med steril PBS. - Med den dorsale midterlinje vene tjener som et vartegn, indsætte en 45° bøjet skaft af en 30 G kanyle tip (med nål facet opad) i den dorsolateral overfladen af rygmarven (ca 1 mm dybe) på ca 0.5 mm lateral til hver side af midterlinjen.
- Flytte nålen ~ 2 mm fra caudale til rostralt (parallelt med midterlinjen), således at hele længden af facet af nålen er indsat i ledningen. Fjern nålen ved sporet via stien til posten (figur 1 g).
Bemærk: Der skal være nogen blødning men hævelse af spinal væv kan ses på dette trin. - For at lukke såret, fjerne retractoren og sutur rygmuskler på begge sider af den skade, der er sammen i midterlinjen ved hjælp af en 6-0 resorberbar sutur. Bruge en 4-0 sterile silke sutur efterfølgende lukke den overliggende hud.
- Anvende antibiotisk salve til toppen af den overfladiske syet hud til postoperativ smittefare ved hjælp af spidsen af en vatpind. Administrere postoperativ smertestillende på 0,1 mg/kg af buprenorphin subkutant sammen med væsker (1 mL af laktat Ringers løsning).
- Sluk for isofluran vaporizer og ilt. Fjerne musen fra stereotaxisk enhed og sted i en ren bur med ingen sengetøj.
- Placere musen i bur ca 30 cm væk fra en varmelampe til nyttiggørelse fra anæstesi og overvåge adfærd efter vågne. Musen bør vågne op indenfor 5-10 min og har funktionen hind-ekstremitet med mulige parese og/eller hale svaghed når man vågner.
- Overvåge mus adfærd over de næste par dage og give ordentlig postoperativ pleje og analgetika (dvs., mash, laktat Ringers løsning væske subkutane, 0,1 mg/kg buprenorphin 2 x dagligt subkutant for 2-3 dage, og korrekt vægt overvågning ) i henhold til lokale Dyrefacilitet forordninger og på individuel basis som nyttiggørelse kan variere.
2. Neurosphere Assay dissektion
Bemærk: Følge ordentlig sterile vævskultur procedurer i hele.
- Enzymatisk rengøringsopløsning forberedelse
- Tilføje 32 mL af Earle's Balanced Salt løsning (EBSS) til albumin ovomucoid hæmmer indeholdende glasflaske og forsigtigt vortex indtil opløst.
- Der tilsættes 5 mL af EBSS til en pre anrettede papain hætteglasset og i et 37 ° C vandbad til at opløse. Løsningen bliver klart (løsning 1).
- Tage 500 µL EBSS og tilføje til den pre anrettede DNase jeg glas hætteglas for at opnå en koncentration af 1 mg/mL (løsning 2). Bland meget forsigtigt ved at vippe hætteglasset frem og tilbage og tilsæt 250 µL af denne blanding til løsning 1.
Bemærk: Alle løsninger lavet (løsning 1 og 2) er nok til behandling af to stykker af væv. Hvis forarbejdning mere stykker af væv, rumme med flere løsning prep.
- Væv forberedelse og dissektion
- Sted en laboratorium tørre gennemblødt i isofluran ind i musen buret og give 2-3 min for dampe til helt bedøver mus. Følgende knockout, fjerne musen fra buret og bekræfte fravær af en tå-knivspids refleks.
- Udføre cervikal dislokation med en stump metal objekt (dvs., metal bur-kort) til at aflive dyret. Spray det aflivede dyr fra sin hals til midten af ryggen generøst med 70% ethanol.
- I bunden af kraniet, skal du bruge saks at afskære hovedet og kassér i en bio taske. Gøre en midterlinjen snit i huden langs hele længden af ryggen til at udsætte den muskel og vertebrale knogle kontur (figur 2A).
- Løft den mediale aspekt af hver scapula (dvs., skulderbladet — identificeret af overliggende fedt pad) og bruge saks til at skære væk blødt væv (mellem scapulae og ryghvirvler). Separat fuldt ud til at afsløre de underliggende rygsøjlen.
- Efter krumning af rygsøjlen, indsætte den samme par saks i den øvre bryst blænde og isolere rygsøjlen ved at skære væk vedlagte ribben, muskel og indre organer (figur 2B).
- Indsætter den caudale vertebrale foramen/åbning saks og klippe de intervertebrale led på hver side af bladplader (dorsale overflade). Tage særlig pleje ikke skader den intakte ledning. Fortsæt denne proces indtil det ønskede niveau og/eller længden af ledningen er udsat.
- Skær forsigtigt spinal nerve(s) strækker sig lateralt fra ledningen før overførsel af rygmarven væv i en petriskål med regelmæssige kunstige cerebrospinalvæsken. Hold prøve på ice (figur 2 c).
- Under en dissektion skære mikroskop, rygmarven væv til at omfatte ~ 2 mm rostralt og caudale til skaden site. Brug to par af tang til at forsigtigt adskille ledningen i 2 halvdele på langs ad dorsal og ventral sprækker (figur 2 c').
- Med microscissors, skåret ud den skadede dorsolateral hvide substans. Placér ind i en 15 mL konisk rør.
- Holding en halvdelen af rygmarven ned med pincet, drille og fjerne hvid sag ved hjælp af et andet par af fine pincet langs rostrocaudal udstrækningen af rygmarven for at isolere den ønskede periventricular region. Gentag for anden halvdelen af rygmarven.
- Placere stykker af periventricular væv i en separat 15 mL konisk rør. Bruge microscissors og forsigtigt hakkekød væv mod væggene i de koniske rør.
Bemærk: Væv Dissociation ændringer er Papain Dissociation System protokol23 og tidligere beskrevne væv forberedelse procedurer24. - Tilsættes 2,5 mL af nye løsning 1 (trin 2.1.3) at vævsprøve og placere på en rocker ved 37 ° C i 30 min.
- Forsigtigt hakkede væv i løsning med en 1.000 µL pipette spids. Centrifugeres den overskyede cellesuspension ved 300 x g i 5 min på RT.
- Forberede løsning 3 med 2,7 mL af Earles afbalanceret saltopløsning, 300 µL af ovomucoid hæmmer løsning (trin 2.1.1) og 150 µL af DNase jeg løsning (trin 2.1.3).
- Supernatanten fra trin (trin 2.2.13) og resuspend i 1,5 mL løsning 3 fra det forrige trin (trin 2.2.14).
- Lag denne nye cellesuspension (trin 2.2.15) oven på 5 mL af ovoimucoid hæmmer løsning (trin 2.1.1) i en ny 15 mL konisk rør til at oprette en diskontinuerlig tæthed farveforløb. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min på RT.
- Kassér supernatanten og resuspend i 2 mL af neurobasal media. Der centrifugeres ved 300 x g i 3 min på RT.
- Kassér supernatanten og resuspend i 1 mL af neurobasal media. Filtrer suspensionen ved hjælp af en 20 µm celle si efterfulgt af 4 mL af medier for en samlet maengde paa 5 mL.
- Plating
- Forberede neurosphere vækst kultur medier ved at supplere neurobasal medier med epidermal vækstfaktor (20 ng/mL) / fibroblast vækst faktor (20 ng/mL) / heparin (2 µg/mL) [for endelig NSCs] eller leukemina hæmmende faktor (10 ng/mL) [for primitive NSCs]. Der tilsættes 10 mL af enten medier i et 25 mL vævskultur kolbe.
- Brug en hemocytometer og Trypan blå farvestof til at beregne antallet af celler i suspension fra (trin 2.2.18)25. Når beregnet, indsætte celler i vævskultur flasker forberedt i (trin 2.3.1) til en klonal tæthed af 10 celler/mikroliter og sted vævskultur kolbe med tilføjet celler i inkubator i 24 timer (37 ° C, luftfugtighed 95%, 5% CO2).
Bemærk: Et eksempel på den tælle teknik er som følger: Tag 10 µL cellesuspension og blandes med 10 µL af Trypan blå farvestof. Tilføje 10 µL af denne blanding til en hemocytometer. Under en 10 X lysmikroskop, tælle antallet af levende celler og opsummere alle celler tælles inden for 4 af de 4 x 4 kvadranter. Brug formel: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] at give volumen af cellesuspension til blive belagt i hver 25 mL vævskultur kolbe at sikre klonede tæthed (10 celler/µL). - Efter 24 h, forsigtigt swirl kolben og hæld indholdet i en 15 mL konisk slange. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min på RT.
- Supernatanten og genopslæmmes celler i 1-2 mL frisk neurobasal medier.
- Gentag trin 2.3.2 til at tælle antallet af celler i suspension og plade celler på klonede tæthed i en 24-godt vævskultur plade der indeholder 500 µL af deres respektive mitogen suppleret medier (EFH for endelige NSC vækst) og LIF for primitive NSC vækst.
Bemærk: Brug tilpasset formel (5.000 / [X celler/4) x 2 x 10 x 1.000) til at beregne mængden af cellesuspension til blive belagt i hver godt indeholder 500 µL af medier. - Placer plader der indeholder celler i inkubator (37 ° C, luftfugtighed 95%, 5% CO2) til at vokse i 7 dage.
- Tælle
- Efter 7 dage i kultur, fjerne plader og se under et lysmikroskop. Kvantificere neurospheres ved at tælle sfæriske kolonier, der er > 80 µm i diameter for dNSCs kulturer og > 50 µm diameter for pNSCs kulturer.
Bemærk: Hvis det ønskes, neurospheres kan være yderligere passaged26 eller differentieret. Hvis celler er ikke længere nødvendigt, afhænde ved at tilføje accelereret hydrogenperoxid brønde (ca. 1 mL) i 20 min., således at farven på mediet bliver gul. Derefter kasseres.
- Efter 7 dage i kultur, fjerne plader og se under et lysmikroskop. Kvantificere neurospheres ved at tælle sfæriske kolonier, der er > 80 µm i diameter for dNSCs kulturer og > 50 µm diameter for pNSCs kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter kirurgi, skal musene opleve minimal motor underskud, der kan omfatte hale og mulige hind-lemmer parese i op til 24 timer. Efter dette tidspunkt, bør mus oplever ingen hind-lemmer lammelse og/eller parese og minimale ændringer i gangart.
Figur 3 viser repræsentative resultater fra neurosphere assay 5 dage efter minimal rygmarvsskade. Det absolutte antal dNSC-afledte neurospheres (vokset i EFH) er større end antallet af pNSC-afledte neurospheres (vokset i LIF) efter skade (figur 3A og 3B, henholdsvis). Højere magt billeder af en definitiv neurosphere (figur 3 c) og en primitiv neurosphere (figur 3D) afsløre forskelle i udseendet af disse forskellige kolonier med definitive neurospheres bliver større i diameter (≥80 µm) og normalt at have en stor mørk center. Primitive neurospheres er mindre i størrelse (≥50 µm) og cellerne er mere tæt pakket. Repræsentativt antal neurospheres som følge af forskellige dele af den skadede ledningen ses i figur 3E (definitives) og 3F (primitiver). Figur 3E viser, at minimal SCI forårsager en væsentlig stigning i neurospheres vokset fra den centrale kanal på skade sammenlignet med en forholdsvis beskeden stigning på den rostralt ikke skadet ledning.
Interessant, kan endelige neurospheres genereres fra webstedet af læsion, en region, der ikke indeholder neurosphere danner cellerne i laminektomi alene mus. Figur 3F viser en tilsvarende stigning i pNSCs efter skade bortset fra pNSC neurospheres på webstedet læsion. Derfor er kun dNSCs i stand til at overflytte til stedet, skaden over denne gang kursus efter skade.
Figur 1: kirurgisk Procedure. (A) layout af alt påkrævet, nummereret for reference. (B) en billede af mus i en stereotaxisk enhed med en udrettet krop, ryg og arme og ben spredt ud og tapede sammen med thorax støtte svangen placeret nedenunder. (C) en billede af musen med en lodret hud indsnit udsætter det muskulære lag og rygsøjlen konturen. (D) A billede af mus kroppen efter muskuløs indsnit og eksponering og isolation af rygsøjlen med retraktor. Bemærk stram muskel lag med manglende tåreflåd. (E) A billede af isolerede mus rygsøjlen med muskel lag fjernet, viser knoglens overflade af ryghvirvel (3 segmenter). Dette viser også spinosus processen og eventuelt det intervertebrale led og lamina af midterste ryghvirvel kan fjernes. (F) A billedet af synlige rygmarven efter laminectomy. Mærket er svinekroppens midterlinje vene. (G) A billede af mus med bilaterale nål spor skader på begge sider af svinekroppens midterlinje vene. Der er en close-up indsætte af 45° bøjet skaft af 30 G kanyle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: rygmarven dissektion. (A) A billede af den mus med midterlinjen hud indsnit til at afsløre den tilbage muskel og vertebrale knogle kontur (B) en billede af isolerede rygsøjlen, viser rostralt og caudale retning. Det andet billede viser ledningen isolation og tredje viser den isolerede rygmarven i en petriskål. (C) en grafisk repræsentation af fine dissektion af rygmarven, hvor forskellige segmenter (periventricular, skade området) er fjernet og adskilt for dyrkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant resultat af neurosphere analyse efter minimal rygmarvsskade. (A) antallet af dNSC-afledte neurospheres (vokset i EFH) kulturperler fra den skadede rygmarven er større end (B) antallet af pNSC-afledte neurospheres (dyrket i LIF) når belagt med samme tæthed. (C, D) Højere magt billeder af "typiske" neurospheres i (C) dNSC kulturer og (D) pNSC kulturer. (E) Minimal nål tarmkanalen skade resulterer i en betydelig stigning i antallet af dNSC-afledte neurospheres fra den centrale kanal på skade, samt den centrale kanal rostralt for skaden, og skaden site. (F) pNSC-afledte neurospheres ikke kan isoleres fra uskadt ledningen men kan isoleres efter skade fra den centrale kanal (på niveauet af skaden og fra den rostralt centrale kanal). Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løbet af den kirurgiske procedure er der et par kritiske faser, hvor forskeren skal være særligt opmærksomme på for at opnå optimale resultater og minimere variabiliteten mellem dyr. Pleje skal tages med den inhalerede anæstesi (isofluran) under kirurgi som narkose har vist sig at have neuroprotektive effekter med langvarig udsættelse27. Derfor, når man studerer den regenerative kapacitet af rygmarven efter skade, gøre en indsats for at udføre operationen så hurtigt og effektivt som muligt for at forhindre forstyrrende variabler. Opretholde den samme isofluran eksponeringstid pr. mus vil reducere variabiliteten. Åndedrætsfrekvens musens bør overvåges under hele operationen og bør ikke være for langsom (mindre end 1 ånde hver 2-3 s) eller stærkt besværet (dvs., gispende). Vedligeholdelsesdosis af anæstesi kan sænkes fra 2-3% at forhindre dødsfald som følge af langvarig anæstesi med note af mus, der har modtaget den lavere dosering.
Under operationen, Vær ekstra forsigtig, når du udfører muskuløs snit på hver side af rygsøjlen. Sikre, at nedskæringerne er dyb, og bladet er vinklet medialt, således at kanten af vingen hviler mod knoklet ryghvirvler under muskuløs indsnit. Hvis klingen er vinklet udad, er der mulighed for voldsom blødning fra vaskulære nedskæringer. Forskeren bør også være ekstra opmærksomme, når udfører laminektomi for at undgå dybe vinkling af saksen, som vil skade rygmarven, forårsager uønskede vævsskader og funktionelle mangler. Den passende kontrol for disse eksperimenter er en "laminektomi kun" gruppe (ingen skade), hvorved en sammenligning af aktivering af NSCs tilskrives nål spor skade i stedet for, som kan tilskrives laminektomi kun. Vi har vist, at laminektomi alene kan resultere i en lille, omend ubetydelige stigning i NSC aktivering som afsløret ved en stigning i neurosphere tal fra regionen periventricular på niveau med læsion21. Laminektomi alene forårsager ikke stigninger i antallet af neurosphere fra regionen periventricular rostralt eller caudale til laminektomi og ingen neurospheres findes i kulturer af hvid substans isoleret på niveau med laminectomy. Desuden, når du udfører laminektomi, tage sig for at fjerne den dorsale lamina i ét stykke at tillade bred eksponering af ledningen. Dette vil (1) give tilstrækkelig adgang til at udføre den minimale nål spor skade af dorsolateral rygmarven, og (2) forhindre segmenter af knogler fra at blive sejlet agterud og sekundære skader efter lukning og post-opsving bevægelse af musen. Hvis hele lamina ikke tages som et stykke, eller segmenter af skarpe ben stikker ud på begge sider af laminektomi overholdes, bruge instrumenter (såsom tandede pincet og buet saks) til at fjerne disse fragmenter inden suturering.
Forskeren bør være yderst forsigtige, når de anvender suturer til muskuløs lag under den kirurgiske lukning. En sutur (dobbelt-knuder) bør placeres caudale til laminektomi/skade, således at sutur ligger på toppen af intakt vertebrale knoglen. Dette er at forebygge sekundære skader som følge af den muskulære sutur at være i kontakt med de udsatte ledning når musen bevæger sig efter opsving. Desuden, den muskulære sutur caudale til laminektomi/skade fungerer som et vartegn for hvor SCI blev udført under isolere rygmarven til analyse. Bør udvises forsigtighed ved dissekere ud området sårede rygmarven til at undgå at kompromittere struktur af det skadede område, således at det kan stadig genkendelig under fine dissektion dissekere mikroskopet. Med hensyn til neurosphere analysen er det vigtigt at udføre mekanisk ændring af celle pellets forsigtigt at undgå produktion af luftbobler, der kan øge celledød. pNSC-afledte neurospheres er endnu mere følsomme over for snavs tunge, vækstbetingelser — overdreven ændring og langvarig eksponering i enzymatisk løsninger – i forhold til dNSC kulturer. pNSC afledt kugler er mere kompakte og mindre end dNSCs. Givet sjældenhed af pNSCs, anbefaler vi isolere mindst 240.000 celler pr. prøve.
Den minimale SCI model er ideel til at studere cellulær begivenhederne efter skade (f.eks. aktivering af endogene NSCs) men det tillader ikke, at undersøgelsen af funktionelle handicap. Som tidligere bemærket mus der tilbagesøge nål spor skaden oplever ingen bemærkelsesværdige adfærdsmæssige underskud, der eksisterer og som sådan, at musene ikke kan vurderes for effektiviteten af terapeutiske tiltag, der skal forbedre funktionelle resultater. Et vigtigt aspekt af regenerativ medicin er, at en behandling kun ikke bør fremme væv reparation, (som kan evalueres ved hjælp af denne model, i kombination med neurosphere assay, afstamning sporingen og Immunhistokemi/immunofluorescens) men bør også vise relevante funktionelle forbedringer ved hjælp af adfærdsmæssige paradigmer, hvor det er relevant. En række adfærdsmæssige opgaver bruges til at teste funktionelle resultater i thorax modeller af skade som foden skyld test og Basso, Beattie, Breshnan (BBB) åbent felt bevægeapparatet skala28, er ikke følsomme nok til at påvise målbare underskud i vores minimale SCI model. For at overvinde denne mangel, man kan gøre brug af mere følsomme digital scoring systemer (f.eks.CatWalk), som måler flere parametre af grove og fine hind-lemmer locomotion parametre herunder gangart analyser, som kan afsløre den minimale underskud som følge af minimal skade model29.
Denne metode kan også tilpasses for at studere endogene NSC aktivering som en potentiel terapi i modeller af cervikale rygmarvsskade. Cervikal SCI er den mest klinisk relevante model og vi foreslår, at tilpasse denne skade model til højere vertebrale segmenter ville give indsigt i hvorvidt der er regionale variationer i svaret af NSCs og deres afkom (kinetik, migration, differentiering) og om læsion vil resultere i mere dybtgående og målbare funktionelle mangler. De aktuelt anvendte murine cervikal skade modeller (f.eks. transection, klip kompression og/eller kontusion) kræver intensiv postoperative pleje herunder behovet for at manuelt express blærer og konstant overvåge vejrtrækning med musen. Tilpasse modellens minimal skade til livmoderhalskræft rygmarven kan reducere dødelighed, sygelighed og postoperativ pleje forbundet med andre cervikal SCI modeller samt tillader en at undersøge effektiviteten af narkotika/små molekyler og/eller rehabilitering resultater på neurale opsving. Vores skade model kan også tilpasses oprette en minimal skade i forskellige dele af ledningen (dvs., dorsale eller laterale kolonner) og/eller større skader med dybere penetration og/eller brug af større størrelse nåle (mindre sporvidde). Dette giver mulighed for forskeren at kontrol/manipulere den type og størrelse af læsion og dermed vurdere cellulære og funktionelle/adfærdsmæssige opsving i overensstemmelse hermed.
Minimal skade model i mus tillader brug af transgene dyremodeller. Musemodeller aktiverer mærkning af endogene stamceller og/eller stamfaderen før skaden. Dette kan give forsker til at spore skæbnen af disse forud mærket celler efter skade og evaluere neurale forløber celleproliferation, migrering og differentiering efter skade — potentielt bidrage til neurale reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde er finansieret af Krembil Foundation (driftstilskud CMM). WX var modtageren af Kandidatpris Carlton Marguerite Smith. NL modtaget en Ontario Graduate stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H.
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
