Summary
. הנה, נדגים את הביצועים של מודל פגיעה בחוט השדרה מינימלי עכבר למבוגרים זה חוסך הנישה התעלה המרכזית דיור אנדוגני תאי גזע עצביים (NSCs). אנו מראים כיצד ניתן להשתמש וזמינותו neurosphere לכמת הפעלה והעברה של NSCs סופית ופרימיטיבי בעקבות פגיעה.
Abstract
תאי גזע עצביים (NSCs) בחוט השדרה יונקים בוגרים הם אוכלוסיה יחסית mitotically השבתה הדרגתית של תאים periventricular, כי יכול להיות למד במבחנה באמצעות וזמינותו neurosphere. זה וזמינותו המושבה יוצרי הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד את התגובה של NSCs גורמים אקסוגניים בצלחת; עם זאת, זה יכול לשמש גם כדי לחקור את השפעת ויוו מניפולציות עם ההבנה נכונה היתרונות והמגבלות של וזמינותו. מניפולציה אחת של הריבית קלינית היא ההשפעה של פגיעה על ההפעלה לבטחון לאומי אנדוגני. המודלים הנוכחיים של פגיעה בחוט השדרה לספק אתגר ללמוד זאת כמו חומרת דגמים נפוצים החבורה, דחיסה, חיתוך לגרום להרס של הגומחה לבטחון לאומי באתר של הפגיעה בו שוכנים תאי גזע. כאן נתאר מודל מינימלי פגיעה הגורמת נזק מקומי על פני דורסולטרלי שטחית של רמת בית החזה התחתון (T7/8) של חוט השדרה העכבר למבוגרים. מודל פציעה זה חוסך את התעלה המרכזית ברמה של פציעה, מאפשרת ניתוח של NSCs השוכנים ברמה של הנגע בנקודות זמן שונות בעקבות פגיעה. . הנה, אנחנו מראים איך וזמינותו neurosphere יכול להיות מנוצל כדי ללמוד את ההפעלה של שתי האוכלוסיות ברורה, lineally הקשורות, של NSCs השוכנים באזור periventricular בחוט השדרה - פרימיטיבי ומוחלטת NSCs (pNSCs ו- dNSCs, בהתאמה). נדגים כיצד לבודד, תרבות אלה NSCs מאזור periventricular ברמה של פציעה ואתר פציעה חומר לבן. ניתוח לאחר ניתוח בחוט השדרה שלנו מראים מספר רב יותר של pNSC, neurospheres dNSC, נגזר מאזור periventricular של מיתרי פצוע לעומת שולט, מדבר עם ההפעלה שלהם באמצעות פגיעה. יתר על כן, בעקבות פציעה, נגזר dNSC neurospheres ניתן לבודד מאתר פגיעה — להפגין את היכולת של NSCs להעביר מ משרה periventricular לאתרים של פציעה.
Introduction
מערכת העצבים המרכזית מכילה את subpopulation של תאי גזע עצמי המתחדש, multipotent, כי יש את היכולת להצמיח כל תא עצבי בוגרת אחרת סוגים1,2,3,4. אלה בתאי גזע עצביים (NSCs) שוכנים בתוך נישות מיוחדות במוח ובחוט השדרה, יכול להיות מופעל בעקבות פגיעה כדי להתרבות, להעביר וכדי להבדיל לתוך התאים העצביים בוגרים. NSCs, הצאצאים שלהם הוכחו להעברת אתר פגיעה פגיעה בקליפת המוח מודלים5,6. במוח, NSCs הוכחו להגר מן החדרים הצדדיים האתר של פגיעה בו הם להתמיין האסטרוציטים שתורמים היווצרות צלקת גליה7. בחוט השדרה, עם זאת, מחקרים מעטים נעשו כדי לשאול אם ניתן לשלוט NSCs אנדוגני באותו אלה כדי לקדם את ההחלמה בעקבות פגיעה בחוט השדרה. אכן, אין כיום ויכוח הפעלת הבריכה תאי גזע בחוט השדרה דורשת נזק פיזי ישיר של הגומחה periventricular רירית התעלה המרכזית8 או אם הנזק השדרה כבל parenchyma (עוזב את הגבעול גומחת תאי שלם) מספיקה להפעיל את NSCs אנדוגני9.
היו בשימוש מספר מודלים פציעה (SCI) בחוט השדרה ללמוד הפתופיזיולוגיה של פציעה אקוטי וכרוני. מודלים אלה שימשו גם לבדוק טיפולים פוטנציאליים לטיפול SCI דרך neuroprotection, immunomodulation, המתפתח תא השתלת/החלפה אסטרטגיות10,11,13. המודלים הנוכחיים כוללים פציעות דחיסה ו/או החבורה, אשר לגרום גירעונות פונקציונלי בקנה מידה גדול כמו גם נגעים נרחבים cavitations כבל ה-14,15. צלקות גליה הנובעת יכולה להקיף מספר מקטעים בעמוד השדרה יחד עם הרוב המכריע של ההיקף/הרוחב של השדרה ה-16. לכן, בעוד אלו הדגמים הם הרלוונטית קלינית, הם יכולים להרשות לעצמם אתגרים משמעותיים כדי ללמוד את התגובה של NSCs אנדוגני בעקבות פגיעה. ישנם דגמים כימי של פציעה זה ניתן להתאים לגרום צורות קלות של פציעה יכול לתת לי את התעלה המרכזית17. עם זאת, סוגים אלה של פציעה להתמקד demyelination המשויך SCI, הן לא דוגמניות הרלוונטית קלינית נזק גופני ו/או מכני הקשורים לביוטכנולוגיה טראומטי
כדי לטפל המגבלות של המודלים הנוכחיים של פציעה, אנחנו הסתגלו מחט מסלול מינימלי SCI מודל, שפותחה במקור בשנת החולדה9, עבור היישום במודל עכברים בוגרים. המודל שלנו פגיעה מותאם ניתן ליצור פגיעה עקבית של אזור דורסולטרלי של חוט השדרה העכבר, לוותר על התעלה המרכזית-level(s) של פגיעה. היתרון של מודל זה הוא כי הוא מאפשר המחקר של המועצה לבטחון לאומי קינטיקה בעקבות פציעות והעברה רדיאלי הפוטנציאליים שלהם לאתר של פציעה. השימוש של מודל עכבר מאפשרת גם שימוש העכברים הטרנסגניים המאפשרים מעקב אחר שושלת היוחסין של NSCs אנדוגני, הצאצאים שלהם בעקבות פגיעה. וצריך להעריך את המאפיינים של NSCs עוד יותר באמצעות הטופס ששונתה של במבחנה neurosphere וזמינותו שהוצגה במאמר פרוטוקול זה.
הבדיקה neurosphere היא במבחנה המושבה יוצרי assay המתיר את ניתוקה של NSCs בנוכחות mitogens. -ציפוי המשובטים צפיפויות, NSCs בודדים להתרבות כדי להצמיח לתרשים כדורית מושבות תאים מורכבות של subpopulation קטן של NSCs, הרוב המכריע של אבות18,19. בפרוטוקול שלנו, נדגים את ניתוקה של שני NSCs נפרדים, הקשורים lineally מאזור periventricular של חוט השדרה — בתנאים בסיסית, בעקבות המודל שלנו-SCI מינימלי. מהווים הסופית עצבית גזע nestin אקספרס תאים (dNSCs) ואת החלבון חומצי fibrillary גליה (GFAP), גדלים בנוכחות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), גורם הצמיחה פיברובלסט (FGF) והפרין (הנקרא יחד EFH)20. DNSCs אלה הם נדירים בחוט השדרה תמימה, והוליד מעט מאוד neurospheres במבחנה. עם זאת, אנו מראים כי dNSCs מופעלים בעקבות SCI מינימלי, מרחיבה את המספרים של neurospheres מבודד את אזור periventricular21. תאי גזע עצביים פרימיטיבי (pNSCs) הם הזרם של dNSCs בשושלת תאי גזע עצביים. pNSCs ונדירה, אקספרס רמות נמוכות של דה מרקר pluripotency Oct4, והם לוקמיה מעכבות פקטור (LiF) מגיב22. pNSCs לא עושים בצורת neurospheres כאשר מבודד מן חוט השדרה העכבר למבוגרים בשל נוכחותם של המיאלין הבסיסי חלבון (MBP) בתרבויות הראשי; עם זאת, pNSC neurospheres ניתן לבודד של MBP עכברים לקוי, מספרם הפציעה הבאה המורחב — בדומה dNSCs21. לבסוף, נראה כי נגזר dNSC neurospheres ניתן לבודד מהאתר של פגיעה ב מוקדם פעמים בעקבות לביוטכנולוגיה מינימלי ממצאים אלה מדגימים שלנו דגם פציעה, מבחני יכול להעריך את מאפייני ההפעלה של periventricular NSCs כגון היכולת שלהם להתרבות ולהעביר בתגובה לפציעה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אושרה על ידי הוועדה אכפת לי חיה ב אוניברסיטת טורונטו, תואם "מדריך כדי טיפול, שימוש של ניסיוני החיות" (2nd Edition, המועצה הקנדית על חיה על עצמך, 2017).
1. ניתוח פגיעה בחוט השדרה מינימלי
הערה: לפני הניתוח לוודא כי כל מכשירי ניתוח והחומרים סטריליים על ידי שיטות המתאימות (איור 1 א').
- לבנות קשת תמיכה בית החזה על ידי סיכום 4 – 5 ריבועים של גזה, להדביק אותם ביחד באמצע כדי להשיג את גליל קבוע של גזה.
- הנח את העכבר בבית הבליעה אינדוקציה וליזום הרדמה עם 5% איזופלוריין. אשר היעדר רפלקס קמצוץ הבוהן לפני שתמשיך, כמו גם לאורך כל ההליך. ככל שהניתוח יכול לקחת יותר מ 30 דקות כדי להשלים, למטב לחשיפה איזופלוריין מינימלי (5 דקות ב-5%) ואת הזמן הנותר ב 2-3%.
- להעביר את העכבר קונוס האף מחובר למכונת הרדמה במינון תחזוקה של 2-3% איזופלוריין. השתמש קוצץ שיער כדי להסיר dorsum של החיה מן אמצע הגב עד הצוואר/האוזניים לחשוף אזור מלבני רחב של העור לניתוח פרווה.
- להעביר את העכבר נגינה stereotaxic על-ידי הצבת אפה קונוס האף המצורפת ייצוב הגולגולת עם האוזן ברים. לשמור איזופלוריין ב-5% במהלך ההשמה של הסורגים האוזן והתחתון חזרה ל- 2-3% ברגע העכבר מאובטחת במכשיר stereotaxic.
- להזריק תרופות להרגעה לפני הניתוח intraperitoneally — Meloxicam (2.0 mg/kg). בנדיבות להחיל סיכוך עין על גבי העיניים פתוח העכבר כדי למנוע לייבוש הקרנית כאשר תחת הרדמה.
- במקום קשת תמיכה בית החזה מתחת בבטן העכבר בעודכם מנסים לסדר את גוף העכבר ואת עמוד השדרה על ידי משיכת בקלילות על בסיס הזנב. השתמש מעבדה תיוג הקלטת כדי לאבטח את הזנב ואת כל האיברים המורחבת בעמדה כמו כוכב. ברגע מאובטח, לדחוף את קשת תמיכה בית החזה rostrally, מהבטן העכבר לכיוון בית החזה העליון — כדי לתמוך בעמוד השדרה החזי (איור 1B).
- להכין שדה כירורגי סטרילי וחיטוי באזור העור שנחתכו פרווה מוכן בשלב 1.3 עם 70% אתנול, ואחריו povidone יוד. חזור על פעמיים. החל תלוי כירורגי סטרילי כדי לשמור על שדה רחב סטרילי.
- באמצעות סכין #10 אזמל, לבצע חתך אנכי המקביל לציר האורך של בעל החיים מנקודת אמצע של שתי השכמות עקמת בעמוד השדרה החזי. . משכי את העור כדי לחשוף רקמה רכה, את קווי המתאר של עמוד השדרה (איור 1C).
- לזהות את הגבול התחתון של משטח השמן suprascapular (זה demarcates את רמת בחוליות של T4/5). עם הלהב #10 באותו, בזהירות, אבל עם כוח, לחתוך לאורך שני צידי העצם בחוליות T5-T8/9 כדי לנתק את הגידים שרירי הגב מן העמודה.
- הכנס השיניים של רטרקטורים האתרים החתך משני צדי עמוד השדרה. להתאים את החשיפה על ידי הרחבת רטרקטורים להעלות מספיק את עמוד השדרה מבלי יותר מדי עומס על הרבדים שקועה שריר (איור 1D).
- תחת מיקרוסקופ כירורגי, בזהירות לנקות את השריר שיורית, רקמות רכות אחרות המכסים השדרה כדי לחשוף את העצם בחוליות (איור 1E). לזהות את החוליה זה יוסרו על ידי לופתות את תהליכים קוצניים של החוליות עם מלקחיים במיתולגיות והזזתה למעלה ולמטה.
הערה: זה אמור לאפשר זיהוי של המפרקים בין-חולייתי, לחשוף את הפתחים קטנים (בין-חולייתי foramina) מתחת החוליות עניין. - להכניס ראש אחד של המספריים קהות מעוקל משני צידי נקב בין-חולייתי חשוף, סימטרית כדי הנדן בחוליות כדי להוציא החוצה, וחותכים את המפרקים בין-חולייתי חיבור דו צדדיים.
- הרם את הנדן כלפי מעלה, לחתוך את הקובץ המצורף העליון של הנדן לבודד ולהסיר את העצם.
הערה: זו תחשוף את קרום השדרה שלם המכיל את חוט השדרה (איור 1F). אולי יש עודף דימום אשר יכול להיות נשלט על ידי הצבת חתוכים 1 ס"מ על 1 ס"מ גזה על האזורים הנגועים ו/או לשטוף עם PBS סטרילי. - עם הווריד של קו האמצע הגבי משמש נקודת ציון, להוסיף מוט כפוף 45° של קצה המחט 30 G (עם מחט המשופעת כלפי מעלה) לתוך השטח דורסולטרלי של חוט השדרה (כ 1 מ מ עמוקה)-כ-0.5 מ מ לרוחב כדי משני צידי הקו האמצעי.
- להזיז את המחט ~ 2 מ מ מ סימטרית rostral (מקביל האמצע) כך לכל אורכה של השיקוע של המחט מוכנס לתוך החוט. הסר את המחט על-ידי חזרה על דרך הנתיב של הפוסט (איור 1 ג'י).
הערה: צריך להיות אין דימום, אך ניתן לראות נפיחות של הרקמה בעמוד השדרה בשלב זה. - כדי לסגור את הפצע, להסיר את המדחק, תפר את שרירי הגב משני צדי הפגיעה יחד האמצע באמצעות בתפר שנספג 6-0. השתמש 4-0 בתפר משי סטרילי לסגור לאחר מכן העור שמעליה.
- אנטיביוטית חלות על החלק העליון של העור sutured שטחית כדי למנוע זיהום לאחר הניתוח באמצעות קצה ספוגית כותנה. לנהל כאבים לאחר הניתוח של 0.1 mg/kg של הבופרנורפין subcutaneously יחד עם נוזלים (1 מ"ל של תמיסת הרטמן).
- כבה את מכשיר אידוי איזופלוריין ואת חמצן. הסר את העכבר המכשיר stereotaxic והמקום בתוך כלוב נקי ללא מצע.
- הנח את העכבר בכלוב כ 30 ס מ מן מנורת חימום ההתאוששות מן ההרדמה והתנהגות צג בעקבות ההתעוררות. העכבר צריך להתעורר בתוך 5-10 דקות, יש את הפונקציה הינד-האיבר עם paresis אפשרי ו/או חולשה הזנב עם התעוררותו.
- עקוב אחר אופן ההתנהגות של העכבר מעל בימים הקרובים ולספק טיפול לאחר הניתוח, משככי כאבים (קרי, מחית, lactated פתרון נוזלים תת-עורי, 0.1 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין רינגר 2 x מדי יום subcutaneously, 2 – 3 ימים ומעקב משקל מתאים ) בהתאם לתקנות מתקן בעלי חיים המקומי, על בסיס אישי כמו שחזור עשויות להשתנות.
2. Neurosphere Assay לנתיחה
הערה: בצע את ההליכים תרביות רקמה סטרילי המתאים לכל אורך.
- פתרון אנזימטי הכנה
- להוסיף 32 מ"ל מאוזנת מלח פתרון (EBSS של ארל) אלבומין ovomucoid מעכב בקבוק זכוכית המכיל ובעדינות מערבולת עד התפרקה.
- הוסף 5 מ של EBSS בקבוקון זכוכית פפאין מראש מנות אישיות ומניחים בתוך אמבט מים 37 ° C כדי להמיס. הפתרון יהיה לנקות (פתרון 1).
- קח 500 µL של EBSS ולהוסיף DNase מראש מנות אישיות שאני זכוכית המבחנה בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל (2 פתרון). לערבב בעדינות על ידי הטיית המבחנה הלוך ולהוסיף µL 250 של תערובת זו פתרון 1.
הערה: כל הפתרונות גרם (פתרון 1 ו- 2) מספיקים לצורך עיבוד של שני חלקי הרקמה. אם עיבוד חלקים נוספים של רקמות, להכיל עם הכנה פתרון נוסף.
- ניתוח והכנה של רקמות
- במקום למחוק מעבדה טבולים איזופלוריין לתוך הכלוב העכבר ולאפשר 2-3 דקות על האדים לחלוטין עזים ומתנגד העכבר. נוקאאוט הבאים, להסיר את העכבר מן הכלוב ואשר העדרו של רפלקס הבוהן-קורט.
- לבצע פריקה צוואר הרחם עם חפץ מתכת קהה (כלומר, כרטיס כלוב מתכת) כדי להרדימו. תרסיס החיה לאללה מהצוואר שלו אל אמצע הגב בנדיבות עם 70% אתנול.
- בבסיס הגולגולת, להשתמש במספריים כדי לחתוך את הראש ולמחוק לתוך שקית ביו. עושים חתך קו האמצע של העור לאורך כל הגב כדי לחשוף את השרירים ואת העצם בחוליות מתאר (איור 2 א).
- הרם את האספקט המדיאלי של כל עצם השכם (כלומר., השכמה — המזוהה על-ידי המכסים fat pad), להשתמש במספריים לחתוך משם רקמות רכות (בין חוליות השכם). נפרדת לחלוטין לחשוף את עמוד השדרה המשמש כבסיס.
- בעקבות העקמומיות של עמוד השדרה, להכניס אותו זוג מספריים הצמצם בית החזה העליון, לבודד את עמוד השדרה על ידי חיתוך משם צלעות המחוברים השרירים, האיברים הפנימיים (איור 2B).
- להכניס מספריים סימטרית בחוליות נקב/פתיחת וחותכים את המפרקים בין-חולייתי משני צדי סחוס (המשטח הגבי). לקחת את הטיפול בפרט כדי לא לגרום נזק חוט שלם. המשך בתהליך זה עד הרמה הרצויה ו/או אורך החוט חשוף.
- לחתוך בזהירות את spinal nerve(s) הרחבת רוחבית של החוט לפני העברת הרקמה חוט השדרה לתוך צלחת פטרי עם נוזל מוחי שדרתי מלאכותי קבוע. שמור את הדגימה על קרח (איור 2C).
- תחת מיקרוסקופ חיתוך, לחתוך הרקמה חוט השדרה כדי לכלול ~ 2 מ מ rostral וסימטרית לאתר פציעה. להשתמש שני זוגות של מלקחיים להפריד בעדינות את הכבל 2 חצאים longitudinally לאורך סדקים הגבי ו הגחון (איור 2C").
- עם microscissors, לגזור בחומר הלבן דורסולטרלי פצועים. מניחים את החלק לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
- חצי חוט השדרה למטה עם מלקחיים, אוחזת להקניט ולהסיר חומר לבן באמצעות עוד זוג מלקחיים בסדר לאורך היקף rostrocaudal של חוט השדרה כדי לבודד את האזור הרצוי periventricular. חזור על החצי השני של חוט השדרה.
- המקום פיסות רקמת periventricular לתוך צינורות חרוט נפרד 15 מ"ל. השתמש microscissors, בעדינות מינצ הרקמה כנגד דפנות הצינורות חרוט.
הערה: רקמת דיסוציאציה שינויים הם פפאין דיסוציאציה מערכת פרוטוקול23 ו רקמת שתואר לעיל הכנת נהלים24. - להוסיף 2.5 מ של פתרון חדש 1 (שלב 2.1.3) דגימת הרקמות ומניחים על כיסא נדנדה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- בעדינות triturate הרקמה בתמיסה עם טיפ פיפטה 1,000 µL. Centrifuge התליה תא מעונן ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
- להכין 3 פתרון עם 2.7 מיליליטר של ארל מאוזנת תמיסת מלח, µL 300 של ovomucoid מעכב פתרון (שלב 2.1.1) ו- µL 150 של DNase אני פתרון (שלב 2.1.3).
- למחוק את תגובת שיקוע מ שלב (שלב 2.2.13), resuspend ב 1.5 מ של פתרון 3 מהשלב הקודם (שלב 2.2.14).
- שכבת ההשעייה תא חדש (שלב 2.2.15) מעל 5 מ של ovoimucoid פתרון מעכב (שלב 2.1.1) 15מל חרוט צינור כדי ליצור מעבר הדרגתי צפיפות מקוטע. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב 2 מ"ל של המדיה neurobasal. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 3 דקות ב- RT.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב 1 מ"ל של המדיה neurobasal. לסנן את המתלים. באמצעות מסננת תא 20 מיקרומטר ואחריו 4 מ"ל של מדיה עבור הנפח הכולל של 5 מ.
- יופיצ
- להכין תרבות המדיה לצמיחה neurosphere על-ידי שכשהם neurobasal מדיה עם גורם הגדילה באפידרמיס (20 ng/mL) / הצמיחה פיברובלסט גורם (20 ng/mL) / הפרין (2 µg/mL) [עבור NSCs סופית] או leukemina מעכבות פקטור (10 ng/mL) [עבור NSCs פרימיטיבי]. להוסיף 10 מ של מדיה או לתוך בקבוקון תרביות רקמה 25 מ.
- להשתמש hemocytometer וצבע Trypan blue כדי לחשב את מספר התאים ההשעיה (שלב 2.2.18)25. ברגע מחושב, להוסיף תאים מבחנות תרביות רקמה המבושלות (שלב 2.3.1) כדי צפיפות המשובטים של 10 תאים/µL ומקום תרביות רקמה את הבקבוק עם תאים נוספת לתוך החממה במשך 24 שעות ביממה (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% CO2).
הערה: דוגמה לשיטת הספירה הוא כדלקמן: לוקח 10 µL של התא ההשעיה, לערבב עם µL 10 של צבע Trypan blue. להוסיף 10 µL של תערובת זו hemocytometer. תחת 10 X בסיוע מיקרוסקופ אור, לספור את המספרים של תאים חיים, לסכם את כל התאים ספרתי בתוך 4 הרביעים 4 x 4. להשתמש בנוסחה: 100,000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1,000] כדי לתת נפח תא ההשעיה כדי להיות מצופה את הבקבוק תרביות רקמה 25 מ ל כל אחד כדי להבטיח המשובטים צפיפות (10 תאים µL). - לאחר 24 שעות, בעדינות מערבולת את הבקבוקון ויוצקים תוכן לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
- למחוק את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים 1 – 2 מ"ל של מדיה neurobasal טריים.
- חזור על שלב 2.3.2 כדי לספור את מספר התאים בתאים ההשעיה וצלחת -צפיפות המשובטים בצלחת תרביות רקמה 24-ובכן המכיל 500 µL כל המדיה המתאימים mitogen בתוספת שלהם (EFH לצמיחה לבטחון לאומי סופית) ו- LIF לצמיחה לבטחון לאומי פרימיטיבי.
הערה: השתמש בנוסחה מותאם (5,000 [X / תאים/4) x 2 x 10 x 1,000) לחישוב הנפח של התליה תא כדי להיות מצופה בכל טוב המכיל 500 µL של התקשורת. - מניחים צלחות המכיל תאים בחממה (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% CO2) לגדול במשך 7 ימים.
- סופר
- לאחר 7 ימים בתרבות, להסיר את הלוחות ולהציג תחת מיקרוסקופ אור. לכמת neurospheres על ידי ספירת מושבות כדוריות הנמצאות > 80 מיקרומטר בקוטר של תרבויות dNSCs ו > קוטר 50 מיקרומטר pNSCs תרבויות.
הערה: אם רצונך בכך, neurospheres יכול להיות עוד יותר passaged26 או הבדיל. אם התאים אינם נחוצים, תשליך על-ידי הוספת מואצת מימן על-חמצני הבארות (כ – 1 מ"ל) במשך 20 דקות כך הצבע של המדיום לצהוב. . ואז להשליך...
- לאחר 7 ימים בתרבות, להסיר את הלוחות ולהציג תחת מיקרוסקופ אור. לכמת neurospheres על ידי ספירת מושבות כדוריות הנמצאות > 80 מיקרומטר בקוטר של תרבויות dNSCs ו > קוטר 50 מיקרומטר pNSCs תרבויות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הניתוח, העכברים צריך לחוות גירעונות מוטורית מינימלית אשר עשויים לכלול הזנב ואת paresis הינד-איבר אפשרי עבור עד 24 שעות. לאחר תקופה זו, העכברים צריך לחוות אין שיתוק גפיים-הינד ו/או paresis ושינויים מינימליים דהירה.
איור 3 מראה תוצאות נציג וזמינותו neurosphere בעקבות הפגיעה בחוט השדרה מינימלית של 5 ימים. מספרים מוחלטים של נגזר dNSC neurospheres (גדלו ב EFH) הוא גדול יותר מספרי pNSC, נגזר neurospheres (גדל LIF) לאחר פציעה (איור 3A ו- 3B, בהתאמה). תמונות גבוה יותר כוח של neurosphere סופית (איור 3C) neurosphere פרימיטיבי (איור 3D) לגלות הבדלים במראה של מושבות נפרדות אלו עם neurospheres סופית להיות גדול בקוטר (≥80 מיקרומטר) ובדרך כלל יש מרכז כהה גדול. Neurospheres פרימיטיבי קטן יותר בגודלו (≥50 מיקרומטר), התאים הן יותר בצפיפות. נציג מספר neurospheres הנובעים מתגובות בין חלקים שונים של חוט הפצועים נראים באיור 3E (דברים מוחלטים) ו- 3F (פרימיטיביים). איור 3E מראה כי SCI מינימלי גורמת עלייה משמעותית neurospheres גדלו של התעלה המרכזית ברמה של פציעה לעומת עלייה יחסית צנועים-חוט rostral-נפגע.
מעניין, neurospheres סופית ניתן להפיק מאתר של הנגע, אזור אשר אינו מכיל תאים ויוצרים neurosphere בעכברים לבד laminectomy. איור 3F מדגים גידול דומה pNSCs לאחר פציעה למעט pNSC neurospheres באתר הנגע. לפיכך, רק dNSCs מסוגלים להעביר לאתר של פציעה במהלך זמן זה קורס לאחר פציעה.
איור 1: הליך כירורגי. (א) הפריסה של כל מה נדרש, ממוספר לצורך התייחסות. (B) של התמונות של העכבר במכשיר stereotaxic עם גוף straightened, עמוד השדרה, הגפיים התפרסו והדביקו יחד עם קשת תמיכה בית החזה הניח מתחת. (ג) א תמונה של העכבר באמצעות חתך אנכי העור לחשוף את שכבת השרירים ואת את קווי המתאר של עמוד השדרה. (ד) A תמונה של הגוף העכבר לאחר חתכים שרירים, חשיפה ובידוד של עמוד השדרה רטרקטורים. הערה שכבות שריר מתוח עם חוסר קורע. (E) של תמונה של עמוד השדרה העכבר מבודד עם שכבות שריר הוסר, מציג על פני גרמי של החוליה (3 קטעים). זה גם מראה את תהליך קוצניים, ואולי המפרק בין-חולייתי ואת הנדן של חוליית הביניים יוסרו. (F) של תמונה של laminectomy שלאחר חוט השדרה נראה לעין. שכותרתו היא הווריד הגבי קו האמצע. (G) של תמונה של העכבר עם מחט הדו-צדדיים פציעות המסלול משני צדי קו האמצע הגבי וריד. אין הוספה של צילום המקרוב של 45° מוט כפוף של המחט 30 גרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: חיתוך בחוט השדרה. (א) א תמונה של העכבר ערופת הראש עם החתך בעור קו האמצע כדי לחשוף את השריר האחורי ואת התמונה (B) A מתאר העצם בחוליות בעמודה השדרה מבודד, מציג rostral וכיוון סימטרית. התמונה השניה מראה את הבידוד כבל, השלישי מציג את חוט השדרה מבודד בצלחת פטרי. (ג) A ייצוג גרפי של הקרע בסדר של חוט השדרה, בהם הוסר, פרודים culturing מקטעים שונים (periventricular, פגיעה באזור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נציג נובעת neurosphere assay בעקבות פגיעה בחוט השדרה מינימלית. (א) המספרים של dNSC, נגזר neurospheres (גדל EFH) תרבותי של חוט השדרה נפגע הוא גדול יותר (B) מספר neurospheres, נגזר pNSC (LIF גדל) כאשר מצופה ב צפיפות שווה. (C, D) תמונות מלון גבוה יותר כוח של neurospheres "טיפוסי" (C) dNSC בתרבויות ובתרבויות pNSC (D). פגיעה בדרכי המחט מינימלי (E) תוצאות עליות משמעותיות במספר neurospheres dNSC, נגזר מן התעלה המרכזית ברמה של פציעה, כמו גם התעלה המרכזית rostral לפגיעה, מתוך אתר הפציעה. (F) נגזר pNSC neurospheres לא יכול להיות מבודד מן החוט שציווית אבל ניתן לבודד בעקבות פציעה מן התעלה המרכזית (ברמת הפגיעה ומן התעלה המרכזית rostral). קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך ההליך הכירורגי, ישנם כמה צעדים קריטי שבו החוקר צריך תשומת לב מיוחדת על מנת להשיג תוצאות אופטימליות, למזער את השתנות בין בעלי חיים. חייבים להקפיד עם ההרדמה בשאיפה (איזופלוריין) במהלך הניתוח כפי ההרדמה הוכח יש אפקטים neuroprotective עם חשיפה ממושכת27. בהתאם לכך, לומדים יכולת ההתחדשות של חוט השדרה בעקבות פגיעה, לעשות מאמץ כדי לבצע את הניתוח במהירות וביעילות האפשרית כדי למנוע המשתנים מבלבלים. שמירה על איזופלוריין באותו זמן חשיפה לכל העכבר יקטין את השתנות. קצב הנשימה של העכבר צריך להיות במעקב לאורך כל הניתוח, לא צריך להיות איטי מדי (נשימה פחות מ- 1 בכל s 2-3) או בכבדות המאומצת (קרי, מתנשף). המינון תחזוקה של הרדמה ניתן להוריד מ 2-3% כדי למנוע מוות בשל ההרדמה ממושך עם הפתק של עכברים שקיבלו את מינון נמוך יותר.
במהלך הניתוח, להיזהר במיוחד בעת ביצוע חתכים שרירים משני צדי עמוד השדרה. ודא כי החתכים עמוקים, הלהב הוא בזווית medially כך קצה הלהב מונח כנגד חוליות גרמיות במהלך החתך שרירים. אם הלהב המשופע מסובבת כלפי חוץ, יש האפשרות של דימום יתר של כלי הדם חתכים. החוקר צריך גם לשלם תשומת לב נוספת בעת ביצוע את laminectomy כדי להימנע בחכה עמוק של המספריים אשר יגרום נזק חוט השדרה, גורם נזק לרקמות לא רצויים ואת גירעונות פונקציונלי. הפקד המתאים עבור ניסויים אלה היא קבוצת "laminectomy בלבד" (אין פציעה), אשר יאפשר השוואה של הפעלת NSCs לייחס מחט מסלול הפגיעה לעומת זאת אשר יכול לנבוע רק laminectomy. הראו לנו שאת laminectomy לבד יכול לגרום עלייה קטנה, גם אם חסר חשיבות הפעלת לבטחון לאומי כפי עלייה במספרים neurosphere מאזור periventricular ברמה של הנגע21. Laminectomy לבד אינו גורם מגביר במספרים neurosphere מאזור periventricular rostral או סימטרית כדי laminectomy, neurospheres לא נמצאו בתרבויות של חומר לבן מבודד ברמה של laminectomy. בנוסף, בעת ביצוע של laminectomy, לטפל כדי להסיר את הנדן הגבי בחתיכה אחת כדי לאפשר חשיפה רחב של החוט. זה (1) לאפשר גישה מספיקות לביצוע הפגיעה המסלול המחט מינימלי של חוט השדרה דורסולטרלי, (2) למנוע מקטעים של עצם מלהישאר וגורמים נזק משני בעקבות הסגר ושחזור פוסט-תנועה של העכבר. אם הנדן כולו אינו תפוס כמו חתיכה אחת, או חלקי עצם חדה בולט משני צדי laminectomy הם נצפו, להשתמש מכשירים (כגון מלקחיים במיתולגיות מספריים מעוגלים) כדי להסיר קטעים אלה לפני תפירה.
החוקר צריך להיות זהיר מאוד בעת החלת התפרים על שכבת השרירים במהלך הסגר כירורגי. תפר אחד (ומסוקסות כפול) יוצבו סימטרית לרמה של laminectomy/פציעה כך התפר ונמצא מעל העצם בחוליות ללא פגע. זה כדי למנוע נזק משני העלולות לנבוע התפר שרירים להיות בקשר עם חוט חשוף כאשר העכבר עובר לאחר השחזור. יתר על כן, התפר שרירים סימטרית לפגיעה/laminectomy משמש נקודת ציון עבור שבו בוצעה פתאומיים כאשר לבודד את חוט השדרה לצורך ניתוח. כדאי לשים לב כאשר לנתח את אזור חוט השדרה נפגע להימנע להתפשר על המבנה של האזור הפגוע, כך זה יכול להישאר לזיהוי במהלך ניתוח בסדר תחת המיקרוסקופ ויבתר. לגבי neurosphere וזמינותו, חשוב לבצע את trituration מכני של כדורי תא בעדינות כדי למנוע את הייצור של בועות אוויר שיכולים להגביר מוות של תאים. neurospheres pNSC-derived רגישים יותר פסולת כבד, תנאי הגידול — trituration מוגזם וחשיפה ממושכת בפתרונות אנזימטי — ביחס dNSC תרבויות. pNSC נגזר הספירות הם קומפקטיים יותר קטן יותר dNSCs. בהתחשב בנגישות של pNSCs, מומלץ לבודד תאים לפחות 240,000 לדגימה.
המודל SCI מינימלי אידיאלית ללימוד האירועים הסלולר בעקבות פגיעה (כגון הפעלה של NSCs אנדוגני) אך זה אינו מאפשר חקר ליקויי פונקציונלי. כאמור, עכברים להתאושש מהפציעה המסלול המחט לחוות אין חסרונות התנהגותיים בולטים אשר נמשכות, וככזה, לא ניתן להעריך העכברים על האפקטיביות של התערבויות טיפוליות שנועדו לשפר את תוצאות תפקודי. היבט חשוב אחד של רפואה רגנרטיבית היא כי טיפול צריך לא רק לקדם את תיקון רקמות (מה שניתן להעריך באמצעות מודל זה, בשילוב עם neurosphere assay, מעקב אחר שושלת היוחסין אימונוהיסטוכימיה/immunofluorescence) אבל צריך גם להוכיח הרלוונטיים שיפור תפקודי באמצעות פרדיגמות התנהגותית ישים. מספר משימות התנהגותית משמש לבדיקת תוצאות תפקודי במודלים בית החזה של פציעה כמו במבחן פסילה ו באסו, ביטי, Breshnan (BBB) שדה פתוח גינקולוגיות מידה28, אינם רגישים מספיק לזהות חסרונות מדיד שלנו מינימלי מודל SCI. כדי להתגבר על חיסרון זה, אפשר להכין השימוש יותר רגיש הבקיע מערכות דיגיטליות (למשל, המסלול) אשר מודד פרמטרים מרובים של גפיים הינד-האיבר וגסה פרמטרים ובהם ניתוח הילוך, אשר עשוי לזהות את מינימלי הגירעונות שנגרם כתוצאה מהפציעה מינימלי מודל29.
שיטה זו יכולה להתאים גם ללמוד הפעלה לבטחון לאומי אנדוגני כטיפול פוטנציאליים במודלים של פגיעה בחוט השדרה הצווארי. SCI צוואר הרחם הוא הדגם הרלוונטי ביותר מבחינה רפואית, אנו מציעים כי התאמת מודל זה פגיעה על מקטעי בחוליות גבוה יותר תספק תובנות אם ישנן וריאציות אזוריות בתגובה של NSCs, הצאצאים שלהם (קינטיקה, הגירה, בידול), בין אם כתוצאה הנגע גירעונות פונקציונליים מדידים ומעמיק יותר. הדגמים משמש כיום מאתר פגיעה בצוואר הרחם (כגון חיתוך, דחיסה קליפ ו/או החבורה) דורשים אינטנסיבית לטיפול לאחר הניתוח כולל את הצורך לבטא באופן ידני שלפוחיות ולפקח באופן קבוע את הנשימות של העכבר. התאמת המודל פגיעה מינימלית בעמוד השדרה הצווארי עשוי להפחית את התמותה, תחלואה וטיפול לאחר הניתוח הקשורים עם דגמים אחרים-SCI צוואר הרחם וכן אישור אחד לבחון את יעילותן של תרופות/קטן מולקולות ו/או שיקום תוצאות על שחזור עצבית. המודל שלנו פגיעה גם ניתן להתאים כדי ליצור פגיעה מינימלית בחלקים שונים של חוט (קרי, הגבי או רוחבי עמודות) ו/או פציעות גדול עם חדירה עמוקה יותר של ו/או השימוש של מחטים בגודל גדול יותר (מד קטן יותר). דבר זה מאפשר החוקר שליטה/מניפולציות סוג וגודל של הנגע ולהעריך ובכך הסלולר ושחזור תפקודית/התנהגותית בהתאם.
המודל פגיעה מינימלית בעכברים מאפשרת את השימוש במודלים מהונדס. הדגמים העכבר מאפשרים תיוג של תאי גזע אנדוגני ו/או אבות לפני הפגיעה. זה יכול לאפשר החוקר לעקוב אחר גורלם של אלו תאים עם תוויות מראש בעקבות פגיעה ולהעריך התפשטות תאים עצביים קודמן ההעברה, בידול בעקבות פגיעה – תורם פוטנציאלי כדי לתקן את עצבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי קרן Krembil (הפעלה גרנט CMM). WX היה זוכת הפרס סטודנט קרלטון מרגריט סמית. NL קיבל מלגת בוגר אונטריו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H.
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
