Tintura de FM ciclismo a sinapse: comparando a despolarização de potássio alto, elétrica e Channelrhodopsin estimulação

Resumo

Vesícula sináptica (SV) ciclismo é o mecanismo de núcleo de comunicação intercelular em sinapses neuronais. Liberação e absorção de corante de FM são o principal meio de análise quantitativa do SV endo e exocitose. Aqui, nós comparamos todos os métodos de estimulação para conduzir FM1-43 ciclismo da sinapse de modelo de junção neuromuscular (JNM) de Drosophila .

Resumo

FM de corantes são usados para estudar o ciclo da vesícula sináptica (SV). Estas sondas anfifílicos têm uma cabeça hidrofílica e cauda hidrofóbica, tornando-os solúveis em água, com a capacidade reversível, entrar e sair bilayers do lipid da membrana. Estes corantes styryl são relativamente não-fluorescente em meio aquoso, mas causa a inserção no folheto externo da membrana plasmática um > 40 X aumento da fluorescência. Nas sinapses neuronais, FM corantes são internalizados durante a endocitose SV, traficada dentro e entre pools de SV e liberada com exocitose SV, fornecendo uma ferramenta poderosa para visualizar pré-sináptica estágios da neurotransmissão. Um modelo genético primário de glutamatérgico sinapse desenvolvimento e função é a Drosophila junção neuromuscular (JNM), onde FM tingir de imagem tem sido amplamente utilizada para quantificar a dinâmica do SV em uma ampla gama de condições mutantes. O terminal sináptico Nicotínico é facilmente acessível, com uma bela matriz de boutons sinápticas grandes ideais para aplicativos de imagem. Aqui, podemos comparar e contrastar as três maneiras de estimular a drosófila MNJ dirigir atividade dependente FM1-43 tintura absorção/liberação: aplicativo 1) banho de alta [K⁺] para despolarizar tecidos neuromusculares, 2) nervo motor do eletrodo de sucção estimulação para despolarizar o nervo pré-sináptica terminal e 3) alvo transgénico expressão de variantes de channelrhodopsin para controle de luz-estimulada, espacial de despolarização. Cada um desses métodos tem vantagens e desvantagens para o estudo dos efeitos de mutação genética sobre o ciclo SV na drosófila MNJ. Discutiremos essas vantagens e desvantagens para ajudar a seleção da abordagem de estimulação, juntamente com as metodologias específicas para cada estratégia. Além de imagens fluorescentes, corantes de FM podem ser photoconverted aos sinais de elétron-densa visualizado usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para estudar mecanismos de ciclo SV a nível ultraestrutural. Nós fornecemos as comparações de confocal e microscopia eletrônica de imagens de diferentes métodos de estimulação de Drosophila JNM, para ajudar a guiar a seleção dos futuras paradigmas experimentais.

Introdução

O maravilhosamente caracterizado Drosophila larval junção neuromuscular (JNM) glutamatérgico sinapse modelo tem sido usado para estudar a formação de sinapses e função com um vasto espectro de perturbações genéticas¹. O terminal do neurônio motor é composto por várias ramificações do axônio, cada um com muitos boutons sinápticas alargadas. Essas varicosidades espaçosa (até 5 µm de diâmetro) contêm todas a neurotransmissão, incluindo máquinas glutamatérgico uniforme de vesículas sinápticas (SVs; ~ 40 nm de diâmetro) na reserva citosólica e prontamente liberável piscinas². Essas vesículas ancorar na membrana pré-s....

Protocolo

1. larval cola dissecação

1. Misture bem 10 partes de elastómero de silicone base com 1 parte de elastômero de silicone, agente do kit de elastômero (Tabela de materiais) de cura.
2. Revestir as lamelas de vidro de 22 x 22 mm com o elastômero e cura em um prato quente em 75 ˚ c durante várias horas (até já não pegajoso ao toque).
3. Coloque uma lamela de vidro revestido de elastômero único na câmara de dissecação de vidro plexi sob medida (Figura 1, inferior) em preparação para a dissecação larval.
4. Prepare as pipetas de cola de vidro de borosilicato capilar usando um extrator de microeletrod....

Resultados

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para a tintura de FM de atividade dependente da imagem latente do protocolo. O experimento começa sempre com a mesma dissecação cola larval, independentemente do método de estimulação usado posteriormente. Figura 1a é um diagrama esquemático de uma larva dissecado, mostrando o cordão nervoso ventral (VNC), irradiando nervos e repetidas hemisegmental muscular padrão. O VNC é removido e a prepa.......

Discussão

Estímulo despolarizante salino de alta [K⁺] é de longe a mais simples das três opções para tintura de FM de atividade-dependente ciclismo, mas provavelmente o menos fisiológicas²⁹. Este método simples depolarizes cada célula acessível em todo animal e assim não permite estudos direcionados. Pode ser possível aplicar localmente alta [K⁺] soro fisiológico com uma micropipeta, mas isto ainda vai despolarizar células pré/pós-sináptica e provável glia sinapse-associado

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Elastômero de Silicone SylGard 184	Fisher Scientific	NC9644388	Para colocar a tampa de vidro para dissecações
Vidro de Cobertura do Microscópio 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	Para colocar SylGard para dissecações
Placa Quente de Alumínio Tipo 2200	Thermolyne	HPA2235M	Para curar a
câmara de dissecção de vidro SylGard Plexi	N/A	N/A	Feito à mão
Capilares de vidro borosilicato	WPI	1B100F-4	Para fazer micropipetas de sucção e cola
Extrator de micropipetas à base de laser	Instrumento Sutter	P-2000	Para fazer micropipetas de sucção e cola
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	Para pipeta de boca e sucção
Ponta de pipeta P2	USA Scientific	1111-3700	Para pipeta de boca
Tampa de tubo Eppendorf de 0,6 mL	Fisher Scientific	05-408-120	Usado para colocar cola para dissecação
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Cola usada para dissecções
Cloreto de potássio	Fisher Scientific	P-217	Forsalino
Cloreto de sódio	Millipore Sigma	S5886	para solução salina
Cloreto de magnésio	Fisher Scientific	M35-500	para solução salina
Cloreto de cálcio di-hidratado	Millipore Sigma	C7902	para solução salina
Sacarose	Fisher Scientific	S5-3	para solução salina
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Para solução salina
HRP: Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	Para rotular membranas neuronais
Pincel	Winsor & Newton	94376864793	Para manipular as larvas
Pinças Dumont Dumostar #5	WPI	500233	Usado durante a dissecação
7 cm McPherson-Vannas Microtesoura (lâminas 3 mm)	WPI	14177	Usado durante a dissecção
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Corante de estiril fluorescente
Temporizador Digital	VWR	62344-641	Para temporizar a carga/descarga de corante FM
LSM 510 META microscópio confocal de varredura a laser	Zeiss		Para imagens dos marcadores fluorescentes
Zen 2009 SP2 versão 6.0	Zeiss		Software para imagens em laser confocal
HeNe 633nm	Lasos		Para excitar HRP:647 durante a imagem de imagens
Laser de argônio 488nm	Lasos		Para excitar o corante FM durante a imagem de imagens
Micro-Forge	WPI	MF200	Para disparar micropipetas de vidro polonês
20mL Seringa Ponta Deslizante	BD	301625	Para sugar o axônio para estimulação elétrica.
Micro Manipulador (base magnética)	Narishige	MMN-9	Para controlar o eletrodo de sucção para estimulação elétrica
Estimulador	Grama	S48	Para controlar o LED e a estimulação elétrica
Microscópio Zeiss Axioskop	Zeiss		Usado durante a estimulação elétrica.
40X Achroplan Objetiva de Imersão em Água	Zeiss		Usado durante estimulação elétrica e imagem confocal
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Co-fator essencial para ChR2
Zeiss Stemi Microscópio com porta de câmera	Zeiss	2000-C	Usado durante a estimulação de channelrhodopsin
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Usado para ativação de ChR
Driver de LED T-Cube	ThorLabs	LEDD1B	Para controlar a
fonte de alimentação LED LED	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Para alimentar o
medidor de energia e potência óptica	ThorLabs	PM100D	Para medir a intensidade do LED

LED