Summary
Hier presenteren we een protocol voor antilichaam arrays om te identificeren van de wijzigingen in de signaalroutes in verschillende cellulaire modellen. Deze veranderingen, veroorzaakt door drugs/hypoxie/ultra-violet licht/straling, of overexpressie/Downregulatie/uitsparingen, zijn belangrijk voor verschillende modellen van de ziekte en kunnen aangeven of een therapie effect sorteren zullen of mechanismen van drugs kan identificeren weerstand.
Abstract
Kankerpatiënten met een afwijkende regeling van de proteïne fosforylatie netwerken worden vaak behandeld met de tyrosine-kinase-remmers. Berekening van responsrates bijna 85% zijn gemeenschappelijk. Helaas, patiënten vaak geworden vuurvaste op de behandeling door een wijziging van hun signaaltransductie trajecten. Een implementatie van de expressie profilering met microarrays kan het identificeren van de wijzigingen die over het algemeen mRNA-niveau, en proteomics herkent de algemene veranderingen in eiwitniveaus of herkent de eiwitten die betrokken zijn, maar de activiteit van de signaaltransductie trajecten kunnen alleen worden vastgesteld door het ondervragen van posttranslationele modificaties van de eiwitten. Dientengevolge, is de mogelijkheid om te identificeren of een medicamenteuze behandeling succesvol is of weerstand ontstaan, of de mogelijkheid te karakteriseren van eventuele wijzigingen in de signaalroutes, een belangrijke klinische uitdaging. Wij bieden hier een gedetailleerde uitleg van antilichaam arrays als een hulpmiddel dat systeembrede wijzigingen in verschillende posttranslationele modificaties (b.v., fosforylatie identificeren kan). Een van de voordelen van het gebruik van antilichaam arrays omvat hun toegankelijkheid (een matrix hoeft niet een expert in proteomics of dure apparatuur) en snelheid. De beschikbaarheid van arrays gericht op een combinatie van posttranslationele modificaties is de primaire beperking. Bovendien, wellicht onbevooroordeelde benaderingen (Fosfoproteomics) meer geschikt voor de nieuwe ontdekking, overwegende dat antilichaam-arrays ideaal voor de meest gekarakteriseerd doelstellingen zijn.
Introduction
Klinische deimplementatie van de gerichte tyrosine kinase remmers (TKI) veranderd de behandeling van kanker door artsen voorzien van effectieve instrumenten te richten op de specifieke proteïnen die schijf neoplastische transformatie. Deze stoffen remmen of blokkeren de fosforylering van eiwitten doelwit van tyrosine kinases1,2. TKIs werden ontwikkeld, gedeeltelijk omdat genetische wijzigingen in verschillende sleutel signalering genen zijn voldoende om station kanker initiatie en progressie [bijvoorbeeld, epidermale groeifactor receptor (EGFR), oncogen tyrosine-proteïne kinase Src (SRC), BCR-ABL en menselijke epidermale groeifactor receptor 2 (HER2)]3,4. De impact van TKIs op de celcyclus5 en de moleculaire signalering trajecten6 vertegenwoordigt een transformatie van de irrelevante naar de moleculair begeleide kankerbehandeling. Het belangrijkste voordeel van TKIs ten opzichte van chemotherapie is de verhoogde respons en het lager risico van toxiciteit voor gezonde cellen7. Dientengevolge, is er toegenomen aandacht voor het onderzoek en de ontwikkeling van roman TKIs.
Toegang tot de resultaten van het genoom sequentiebepaling begonnen met het Human Genome Project8,9,10 en blijft vandaag met verschillende volgende-generatie (NextGen) kanker sequencing inspanningen [bijvoorbeeldde kanker genoom Atlas (TCGA)11,12]. Dit heeft inspireerde vele experimentele methodologieën die gelijktijdige informatie verschaffen over duizenden genen en/of verstrekken van onbevooroordeelde momentopnamen van genen of eiwitten door biologische verstoringen13gemoduleerd. Aangezien de verordening van de cellulaire functie op meerdere niveaus, van de transcriptie van genen de posttranslationele wijziging van eiwitten en hun activiteit gebeurt, zal een volledig inzicht in de gebeurtenissen controleren de cellulaire functie uiteindelijk moeten een integratie van gegevens uit verschillende biologische uitlezingen. De mogelijkheid om te controleren de boodschapper-RNA (mRNA) niveaus van duizenden genen met een eencellige gen-resolutie is de mogelijkheid om gevolgtrekkingen over de genfunctie en interacties op de schaal van een geheel-genoom toegenomen. De interpretatie van gen expressie arrays zullen echter altijd inherent niet compleet zonder de integratie van andere niveaus van verordening: namelijk de eiwitniveaus voor expressie, de eiwit wijziging Staten en het eiwit posttranslationele wijzigingen (fosforylering, ubiquitylation, methylering, enz.). Hier beschrijven we het nut van antilichaam arrays als middel om te ondervragen posttranslationele modificaties van belangrijke onderdelen van de signalering als een functie van de verschillende omstandigheden in een enkele experiment14,15,, 16.
Phospho-antilichaam arrays kunnen worden gebruikt om te onderscheiden en analyseren van wijzigingen in het signaaltransductie trajecten16. Dit kunnen voortvloeien uit een genetische modificatie of behandelingen van cellijnen met kinase-remmers, chemotherapeutica, stress veroorzaakt door glucose ontbering, hypoxie of serum honger. Opmerking, resistentie tegen geneesmiddelen of een specifiek gen up- of Downregulatie kan ook leiden tot wijzigingen in de signaaltransductie trajecten17.
Resistentie tegen geneesmiddelen, bijvoorbeeld, kan ontstaan van mutaties voor de drug target om te voorkomen dat de gevoeligheid. In longkanker, bekend EGFR mutaties maken de kanker insusceptible aan bepaalde TKIs, maar meer vatbaar zijn voor anderen. Alternatief signalering trajecten kan worden geactiveerd bij mutatie17. Als een bredere toepassing voor de identificatie van het signaaltransductie trajecten die betrokken zijn bij weerstand en hypoxie, enz, phospho-antilichaam matrices meer inzicht verschaffen, en bijgevolg begrip van, de mechanismen die betrokken zijn.
Technologieën die een evaluatie van eiwit wijzigingen vertegenwoordigen een belangrijk onderdeel van de systeembiologie, omdat ze vaak een regelgevende functie dienen, zoals het moduleren van de activiteit van een enzym of de fysieke interactie tussen proteïnen. Het belang van posttranslationele modificaties wordt geïllustreerd door de rol van de proteïne fosforylatie in bijna alle extracellulaire geactiveerd signaaltransductie trajecten18. Traditioneel, kan de identificatie van kinases of de status van de fosforylering van eiwitten ook worden bepaald door westelijke vlekkenanalyse, vooral als de onderzoeker geïnteresseerd in alleen 1 – 5 doelen is. Western blots zijn echter zeer selectief en kunnen een vertekend beeld geven richting voorkennis en belangrijke doelstellingen als gevolg daarvan zou kunnen missen. Antilichaam-array(s) bieden een middellange-doorvoer uitlezing van meerdere doelen door verschillende opname-antilichamen [pan-specifieke gefosforyleerd tyrosine(s), anti-ubiquitin, enz.] op een stevige matrijs (bijvoorbeeld, glas of nitrocellulose) insluiten. Secundaire antilichamen bevatten informatie over specifieke eiwitten in een sandwich-ELISA opmaak (Figuur 1). Deze test wordt krachtiger en relevante als meer doelen van belang zijn of de voorkennis beperkt15 is. De phospho-arrays zijn breder inzetbaar als ze kunnen fosforylatie, alsmede algemene hoeveelheden eiwit van een breder scala van doelstellingen in één experiment vergelijken en een beduidend betere kwantificering over massaspectrometrie bieden. Deze techniek is niet van toepassing voor de identificatie van nieuwe of voorheen onbekende fosforylatie sites.
Grootschalige massa spectrometrie gebaseerde proteomics kan worden aangewend om te identificeren specifieke fosforylering van eiwitten19. Hoewel deze techniek duizenden posttranslationele gebeurtenissen opsommen kunt, vereist het dure instrumentatie, speciale experimentele pijpleidingen en een computationele expertise die buiten het bereik van de meeste onderzoekers.
Antilichaam matrices geven een gelijktijdige uitlezing op verschillende eiwit uitlezingen16. Voorbeelden hiervan zijn veranderingen in het eiwit ubiquitylation (ubiquitin matrix) of fosforylering. Het belangrijkste voordeel van deze matrix-technologie is dat het belangrijke feedback over de biologische toestand van diverse biologische trajecten die zijn gekoppeld aan belangrijke cel parameters (eiwit van 53 kDa, p53 receptor tyrosine kinases en intracellulaire trajecten geeft) tegelijkertijd. Daarnaast is het mogelijk te combineren verschillende van de matrix te verhogen van de penetratie van een assay (b.v., apoptosis en ubiquitin en fosforylering). Dit vermogen om het combineren van meerdere arrays om te beoordelen van verschillende posttranslationele wijzigingen in verschillende monsters tegelijk op een tijd en goedkoop cost-effective wijze die geen specifieke instrumentatie of expertise vereist is van een aanzienlijk voordeel in het geval antilichaam-arrays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. eiwit extractie
- Plaat 5 x 106 cellen op een 10 mm weefselkweek plaat (of kolf) in een weefselkweek kap. Cellen tellen op het moment van beplating met een automatische cel teller of hemocytometer. Anderzijds schatten de telling van de cel.
- Spoel de cellen geteeld op de 10 mm plaat (of kolf) grondig 3 x met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH = 7.4). Zorg ervoor dat alle PBS verwijderen voordat u de lysis-buffermengsel toevoegt.
Opmerking: De lysis-buffermengsel is meestal voorzien van de kit. Als dat niet het geval is, gebruik dan een radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA), of elke andere cellysis-buffermengsel met een cocktail van protease en phosphatase inhibitors. - 1 x 107 cellen/mL van cellen in de lysis-buffermengsel lyse door toevoeging van de juiste hoeveelheid buffer naar de cellen en schrapen de cellen met een cel schraper in de lysis-buffermengsel. (bijvoorbeeldvoor HeLa cellen en MiaPaCa-2, gebruik 600 µL per 10 cm plaat).
- Pipetteer de lysate op en neer (ongeveer 10 x) en het overbrengen naar een nieuwe 1,5 mL-buis.
- Incubeer de lysates gedurende 30 minuten bij 4 ° C, bij voorkeur op een rocker/shaker. Druk op de lysate door een injectiespuit met een naald 27 G voor 10 x om een juiste verstoring van de cell membrane(s). Als alternatief, bewerk ultrasone trillingen ten de lysate. Bewaar de lysates bij-20 ° C of gebruik ze onmiddellijk.
- Centrifugeer het lysate bij 14.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten en het supernatant overbrengen in een schone 1,5 mL-buis.
- Kwantificeren van het bedrag van de totale proteïne door bicinchoninic zuur assay (BCA)20 of een equivalent zoals Lowry of Bradford en verder met ten minste 50-400 μg. Gebruik de eiwitten onmiddellijk of aliquot en bevriezen/winkel hen bij-70 ° C (Vermijd meerdere bevriezen-ontdooien cycli).
2. menselijke Phosphokinase matrix
- Breng alle reagentia op kamertemperatuur voordat u begint (gedurende ongeveer 1 uur).
Opmerking: Alle reagentia en kunststof slijtage zijn inbegrepen in de kit. - Alle de reagentia fresh (matrix buffers) voor te bereiden voordat u de procedure volgens de instructies van de fabrikant (afhankelijk van de keuze van doelen/arrays, de instructies kunnen verschillen).
- Reconstrueren de detectie antilichaam cocktails in 100 μl van gedeïoniseerd water of volg de instructies van de fabrikant moeten ze verschillen voor de 1,5 mL proefbuis geboden.
- 1 x wassen buffer bereid door verdunning van 40 mL 25 x was buffer in 960 mL gedeïoniseerd water en meng ze door het omkeren.
Opmerking: Kristallen ontbinden bij kamertemperatuur. De buffer kan geel worden na verloop van tijd, maar zal nog steeds werken. - Pipetteer 1 mL van matrix buffer 1 in ieder putje van een 8-well multi lade (of 2 mL in een 4-well multi lade).
- Met flat-tip pincet, verwijder de matrix membranen tussen de beschermende platen en plaats hen in de putjes. Zorg ervoor dat de nummers op het membraan zijn naar boven zijn gericht.
Opmerking: Bij onderdompeling, de kleurstof op het membraan zal verdwijnen. - Bedek de tray met een deksel en Incubeer het op een rockende platform shaker gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Dit is de membraan blokkerende stap. - Tijdens de incubatietijd, bereiden de eiwitsteekproeven. 50 – 100 μg totaal eiwit toevoegen. Verdun de lysate, hebben een maximumvolume van 334 μL, met lysis-buffermengsel tot een eindvolume van 1 mL.
Opmerking: 50 – 100 μg totaal eiwit meestal volstaat. - Gecombineerd matrix buffer 1 zorgvuldig en Incubeer de membranen met 1 mL van de monsters 's nachts bij 2-8 ° C op een rockende platform shaker.
Opmerking: Geen touch/kras de membranen. - De volgende dag was de array door het zorgvuldig verwijderen van elke array en plaatsen het in individuele plastic bakjes (ongeveer 8 x 11 cm2) met 20 mL voor 1 x wassen buffer. Het wassen van de membranen 3 x 10 min op een rockende platform in 1 x wassen buffer bij kamertemperatuur.
- Pipetteer 20 μL van het gereconstitueerde antilichaam cocktail van stap 2.3 tot en met 1 mL 1 x matrix buffer 2. 1 mL van deze oplossing toevoegen aan elke 8-goed om te worden gebruikt.
- Verwijder voorzichtig de membranen vanuit de lade wassen. DEP de onderste rand op de papieren handdoeken te verwijderen alle overtollige was buffer en breng hen terug in de lade met de antilichaam-cocktails. Dekking van de lade, met het deksel en het gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een rockende platform uit te broeden. Grondig spoelen van de gebruikte schaaltjes met dH2O en droog ze voor later gebruik.
- Verwijder elke array voorzichtig en plaats ze terug in de schone afzonderlijke plastic verpakkingen (ongeveer 8 x 11 cm2) met 20 mL voor 1 x wassen buffer. Was ze 3 x 10 min met de buffer wassen op een rockende platform bij kamertemperatuur.
- Daar-HRP (voorzien van de kit) of streptavidine-belichting fluorescerende kleurstof (voor een meer kwantitatieve detectie) 1:1,000 in 1 x matrix buffer 2 in een reageerbuis 15 mL verdund.
- De membranen terug in de gerechten van de 8-well met de HP-oplossing en broeden ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rockende platform (als met behulp van fluorescentie, wikkel het Dienblad in aluminiumfolie om te voorkomen dat de eventuele blootstelling aan licht).
- Verwijder de overtollige buffer door het plaatsen van het membraan tussen de 2 stukken van 5 mm 3 M papier. Incubeer de gedroogde membranen met een HRP detectie oplossing (mix de twee chemiluminescentie oplossingen 1:1) voor 3 min en plaats het membraan in een doorzichtige plastic vel beschermer voor beeldbewerking met een X-ray film/chemiluminescentie imager.
Opmerking: Gedroogde membrane(s) kunnen ook worden geplaatst in een fluorescerende imager te detecteren het fluorescent signaal; het minimaliseren van de lichte blootstelling aan het membraan voor imaging. Voor een kwantificering van de X-ray film of imager bestanden, Vermijd overmatige blootstelling. Meeste chemiluminescentie/TL imagers hebben een functie om te voorkomen dat een verzadiging van het signaal.
3. de gegevensanalyse
- ImageJ, een beeld processing programma21, Download en installeer de software.
- ImageJ openen door te dubbelklikken op het 'ImageJ pictogram'. Selecteert de afbeelding die moet worden geanalyseerd door te klikken op 'Bestand' in de menubalk, dan Selecteer 'Open' uit het drop-down menu en blader de computerbestanden voor het imago van belang. Klik op het bestand om het te openen.
- Het omkeren van de afbeelding voor de analyse (zwarte vlekken op de witte achtergrond van witte vlekken op een zwarte achtergrond) door in de menubalk op 'Edit' te klikken en te selecteren 'Omkeren' uit het drop-down menu.
- Selecteer de 'oval pictogram' op de werkbalk (de tweede optie in de werkbalk ImageJ). Teken een cirkel/ovaal door te klikken op de foto (zwarte cross) en de muis te bewegen. Aanpassen van de grootte/vorm van de cirkel/ovaal te omsingelen de puntjes op de stip vlek.
- Klik op 'Analyseren' in de menubalk en selecteer vervolgens "Maatregel" in het drop-down menu automatisch een nieuw venster te openen met de waarden van het geselecteerde gebied (gebied, gemiddelde, minimum en maximum).
- De cirkelvormige zone verplaatsen door te slepen de cirkel van het centrum (zet de punt van het recht van de pijl in het midden) en plaats het rond het volgende gedeelte van de meting (dot). Meten van alle plekken van belang, de positieve controle en de negatieve controle de achtergrond voor de analyse.
Opmerking: De negatieve controle is de PBS, de achtergrond is een onderdeel van het membraan zonder enige plek (enig onderdeel zal doen) en de positieve controle is een controle door de fabrikant opgegeven. - Selecteer de PBS negatieve controle plekjes en aftrekken van de waarde van elke vlek. Het gemiddelde van de intensiteit van elk paar van dubbele spots die elke receptor tyrosine kinase (RTK) vertegenwoordigt. Elke gemiddelde intensiteit kan worden gerelateerd aan het besturingselement voor het berekenen van de verandering van de vouw.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te onderzoeken van het effect van TKI weerstand op signaaltransductie trajecten in cellijnen, werden vier monsters geanalyseerd. Een controlemonster (H3255r1) en 3 TKI-resistente cellijnen (H3255r2-4) (Figuur 2) hadden betrekking op de plek antilichaam-sjabloon (Figuur 3). Alle 4 monsters werden opgesteld op basis van dit protocol. Zes phosphoproteins met differential activiteit werden gekozen voor de demonstratie van de analyse van de antilichaam-arrays (Figuur 4). De warmte-kaart (Figuur 5) biedt een semi-kwantitatieve uitlezing op de veranderingen in de proteïne fosforylatie van belangrijk signaaltransductie eiwitten. De validatie van de resultaten van de matrix kan worden uitgevoerd door de uitvoering van orthogonale benaderingen, zoals het westelijke bevlekken.
Figuur 1: schematische van semi-kwantitatieve antilichaam arrays. De antilichaam-arrays zijn gebaseerd op het sandwich-immunoassay beginsel, waar een collectie van capture antilichamen is ingebed in het glas of de nitrocellulose steun. De cel lysates worden geïncubeerd met het membraan en de arrays zijn onderworpen aan secundaire antilichamen. Een semi-kwantitatieve uitlezing kan worden verkregen uit chemiluminescentie ondergronden of, voor meer kwantitatieve informatie, TL gebaseerde imaging. Alle signalen afkomstig van de film- of TIF-afbeeldingen kunnen worden verwerkt door densitometrie en een berekening van de vouw-wijzigingen voor elk eiwit. Het hele proces duurt ongeveer een dag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: voorbeeld phospho-antilichaam matrix ontwikkeld met de imager. De fluorescerende vlekken worden gedetecteerd in tweevoud (twee locaties per doel). De monsters en de positieve controle vlekken tonen verschillende intensiteiten. Blijkt hier de vergelijking van de TKI-gevoelige H3255r1 en 3 resistent (H3255r2-4) monster arrays, elk gesplitst in membraan A en B. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: kaart van de matrix plekken. De kaart verbindt de vlekken op de doelstellingen van het antilichaam. De plekken worden aangeduid als A - G verticaal en 1-10 horizontaal. De positieve controle (oranje) is aanwezig op alle membranen en bevinden zich meestal in de hoeken. De negatieve controle van de PBS is gemarkeerd in zwart terwijl de vlekken van het monster worden benadrukt in geel. Voor elke matrix, is een lijst van antilichamen ook identificatie voorzien. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Data analyse voorbeeld. (A) de intensiteit van de plekken van belang, de positieve controle, en de achtergrond waren geïdentificeerd op de kaart en gemeten voor alle monsters. (B) het relatieve intensiteit (de plek met de intensiteit van de achtergrond verwijderd en op een positieve controle-intensiteit genormaliseerd intensiteit) wordt weergegeven in een staafdiagram voor een paar gekozen kandidaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: warmte kaart van differentiële signalering in H3255 gevoelig (r1) en resistente (r2-4) cellijnen. Een relatieve intensiteit van de spot werd gebruikt voor het genereren van een warmte-kaart voor een vergelijking van de wijzigingen in CREB, P53 AKT en STAT5 in alle 4 monsters. Hoge niveaus worden weergegeven in verschillende tinten rood, terwijl eventuele lagere niveaus worden weergegeven in blauw22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Benaderingen die vele biologische uitlezingen combineren zijn inherent meer nauwkeurige representaties van de cellulaire machines in een experiment uitgevoerd. De komst van phospho-antilichaam matrices kan een snelle karakterisering van het patroon van wijzigingen die mogelijk meer informatief dan de status van de wijziging van elk één eiwit. De algemene workflow voor de toepassing van phospho-antilichaam matrices is gebaseerd op een wijziging in de serine en threonine tyrosine. In het volgende voorbeeld gericht op het karakteriseren van de wijzigingen die zijn gekoppeld aan de weerstand tegen therapie bij longkanker. De belangrijkste reden voor deze toepassing is dat proteïne fosforylatie een centrale rol in de signaaltransductie in vele menselijke kankers18 speelt, en deze methode overgedragen naar andere systemen worden zal. Een disregulatie van fosforylering in kanker meestal betreft het de hyperactivering van een tyrosine kinase, en bijgevolg de gefosforyleerd substraten (vaak inclusief de auto-phosphorylated kinase zelf) zijn aanwezig op niveaus hoger dan in de normale fysiologische instellingen en, dienovereenkomstig, een belangrijke fractie van de phosphoproteins in een kankercel kan make-up. Deze hogere niveaus van fosforylering wordt eenvoudiger detectie. Bovendien, proteïne fosforylatie sinds een medische betekenis aberrant tyrosine fosforylering is een kenmerk van veel soorten kanker23. Bovendien, aangezien deze techniek kan worden overgedragen aan het onderzoek van andere biologische systemen die gebruikmaken van fosforylering, kunnen veel van de functies die hier worden beschreven eenvoudig aangepast worden te richten op andere soorten eiwitseries (ubiquitin, apoptosis, etc.).
Phospho-antilichaam arrays worden veel gebruikt voor de identificatie van elk signaal trajecten betrokken, hetzij als een experimentele methode verificatie van een bepaald traject. Verschillende bedrijven maken kits voor zowel de fosforylatie status en voor het algehele niveau van eiwitten. Terwijl de real-time polymerase kettingreactie (PCR) analyse of microarrays veel meer kwantitatieve zijn, zij alleen mRNA niveaus rekening houden, en een vertaling evenals posttranslationele modificaties niet worden aangepakt. Afgezien van fosforylering, kunnen andere posttranslationele modificaties zoals glycosylatie of ubiquitylation ook worden aangepakt door arrays24,25.
Een van de belangrijke factoren te overwegen voordat u start van antilichaam matrices is te beginnen met gezond en actief scheidslijn cellen. Hypoxie, oxidatieve stress en ontsteking kunnen leiden tot veranderingen in het signaaltransductie trajecten26 die kunnen vertekenen de resultaten en renderen van een verkeerde interpretatie als onjuist wordt behandeld. Deze stress kan worden toegeschreven aan de formulering van media of plating te weinig of te veel cellen en bloot de cellen slecht gereguleerde omgevingen, of om de behandeling van het besturingselement ten opzichte van elk exemplaar iets anders. We hebben ook gemerkt grote verschillen in het aantal passage of de tijd in de cultuur na ontdooien. De sleutel tot het vermijden van deze kunstmatig ingevoerde variabelen is om alles tussen de monsters zo consistent mogelijk te houden. Wijzig niet de FBS percentage of het volume van de media, etc., tijdens het experiment.
De data-analyse moet ook worden overwogen vóór het begin van een array-experiment. Een chemiluminescentie matrix analyse ligt op semi-kwantitatieve en het dynamisch bereik is ongeveer één orde van grootte, terwijl een fluorescerende aanpak het dynamische bereik tot ongeveer twee ordes van grootte verhoogt. De schaal waarop matrices zijn uitgevoerd, is afhankelijk van de specifieke biologische vragen. Het is mogelijk om te analyseren van één specifieke resistente cellijn van belang voor alle wijzigingen in de posttranslationele modificaties t.o.v. de oorspronkelijke cellijn of te concentreren op een bepaald traject voor een breed scala van resistente cellijnen. De schaalbaarheid van deze aanpak moet worden beschouwd in de vroege stadia van de planning. Bovendien moeten de resultaten van een antilichaam matrix altijd worden bevestigd door een secundaire methode voor verse monsters en/of het dezelfde lysates. Een westelijke vlekkenanalyse kan worden gebruikt om te controleren of de wijzigingen in specifieke doelstellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de genereuze financiële steun van de Lawrence J. Ellison Instituut voor Transformatieve geneeskunde van USC (een geschenk aan David Agus). Wij waarderen de steun van herfst Beemer en Lisa Flashner die leiden tot de generatie en de publicatie van dit manuscript. Wij danken Laura Ng voor haar administratieve ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
- Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
- Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).
- Di Fiore, P. P., et al. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells. Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).
- Maguire, H. C., Greene, M. I.
- Busse, D., et al. Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity. Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).
- Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).
- Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. [Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).
- Dulbecco, R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).
- Barinaga, M. DoE provides funds for human genome sequencing. Nature. 331 (6152), 103 (1988).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- McCain, J. The cancer genome atlas: new weapon in old war? Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).
- Weinstein, J. N., et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Carlson, B. Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials. Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).
- Huang, R. P. Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).
- Rani, S., O'Driscoll, L. Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays. Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).
- Kani, K., et al. JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).
- Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr Signal transduction and the control of gene expression. Science. 295 (5556), 813-818 (2002).
- Rikova, K., et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).
- Chen, V. W., et al. Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system. Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Ward, J. H. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).
- Zhou, T., et al. Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).
- McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. Hypoxia, oxidative stress and inflammation. Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).
