Summary
Här presenterar vi ett protokoll för antikropp matriser för att identifiera förändringar i signalvägar i olika cellular-modeller. Dessa förändringar kan orsakas av läkemedel/hypoxi/ultra-violet ljus/strålning, eller överuttryck/nedreglering/knockouts, är viktiga för olika sjukdomsmodeller och kan indikera om en terapi blir effektivt eller kan identifiera mekanismer av droger motstånd.
Abstract
Patienter med en avvikande reglering av protein fosforylering näten behandlas ofta med tyrosinkinashämmare. Svarsfrekvenser närmar sig 85% är vanliga. Tyvärr blir patienter ofta refraktär till behandling genom att ändra deras cellsmedierade reaktioner. En implementering av uttrycket profilering med microarrays kan identifiera förändringarna som övergripande mRNA-nivå, och proteomik kan identifiera de övergripande förändringarna i proteinnivåer eller kan identifiera proteinerna som är inblandade, men aktiviteten av Signaltransduktion vägar kan endast fastställas genom förhör post-translationella modifieringar av proteiner. Som ett resultat, är förmåga att identifiera huruvida en läkemedelsbehandling är lyckad eller om motstånd uppstod, eller förmåga att karakterisera eventuella ändringar i signalvägar, en klinisk utmaning. Här ger vi en utförlig förklaring av antikropp matriser som ett verktyg som kan identifiera systemomfattande ändringar i olika post-translationella modifieringar (t.ex., fosforylering). En av fördelarna med att använda antikropp arrayer innehåller deras tillgänglighet (en matris inte kräver antingen en expert inom proteomik eller dyr utrustning) och hastighet. Tillgången på matriser inriktning en kombination av post-translationella modifieringar är den primära begränsningen. Dessutom kanske opartiska metoder (phosphoproteomics) mer lämplig för roman upptäckten, medan antikropp matriser är idealiska för de mest kännetecknas mål.
Introduction
Det kliniska genomförandet av de riktade tyrosinkinashämmare (TKI) har förvandlat cancerbehandling genom att tillhandahålla läkare med effektiva verktyg för att rikta specifika proteinerna att driva neoplastisk transformation. Dessa föreningar hämma eller blockera fosforyleringen av proteiner riktade av tyrosin kinaser1,2. TKI utvecklades delvis eftersom genetiska förändringar i olika nyckel signalering gener är tillräckliga för att driva cancer initiering och progression [e.g., epidermal tillväxtfaktor (EGFR), proto-onkogener tyrosin-proteinkinas Src (SRC), BCR-ABL och human epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (HER2)]3,4. Inverkan av TKI på cell cykeln5 och molekylär signalering vägar6 representerar en omvandling från de oriktade till molekylärt guidade cancerbehandlingen. Den viktigaste fördelen med TKI jämfört med kemoterapi är de ökad svarsfrekvenserna och den lägre risken för toxicitet till friska celler7. Som ett resultat, det har varit att öka uppmärksamhet på forskning och utveckling av nya TKI.
Tillgång till genomisk sekvensering resultaten började med Human Genome Project8,9,10 och fortsätter idag med olika nästa generation (NextGen) cancer sekvensering ansträngningar [e.g., The Cancer Genome Atlas (TCGA)11,12]. Detta har inspirerat många experimentella metoder som ger samtidig information om tusentals gener och/eller ge opartisk ögonblicksbilder av gener eller proteiner som moduleras av biologiska störningar13. Eftersom regleringen av cellulära funktionen sker på flera nivåer, från transkriptionen av gener den posttranslationella modifieringen av proteiner och deras verksamhet, kommer en fullständig förståelse av de händelser som styr cellulära funktionen Slutligen kräver en integration av data från olika biologiska utläsningar. Möjlighet att övervaka budbärar-RNA (mRNA) nivåerna av tusentals gener med en enskild cell gene upplösning har ökat förmågan att göra slutledningar om geners funktion och interaktioner i helgenom-skala. Dock tolkningen av gene expression arrays kommer alltid att vara inneboende ofullständig utan integration av andra nivåer av förordning: nämligen protein uttryck nivåer protein modifiering staterna och proteinet posttranslationella ändringar (fosforylering, ubiquitin, metylering, etc.). Här, beskriver vi verktyget antikropp-matriser som medel att förhöra post-translationella modifieringar av viktiga signalering komponenter som en funktion av olika villkor i en enda experiment14,15, 16.
Phospho-antikropp matriser kan användas för att urskilja och analysera förändringar i signaltransduktion vägar16. Dessa kan uppstå från en genetisk modifiering eller behandlingar av cellinjer med kinashämmare, kemoterapeutika, stress orsakad av glukos deprivation, hypoxi eller serum svält. Obs, resistens eller en specifik gen kan upp- eller nedreglering också orsaka förändringar i signaltransduktion vägar17.
Läkemedelsresistens, kan exempelvis uppstå mutationer av drogen målet att undvika känslighet. I lungcancer, kända EGFR-mutationer återge cancer mottaglig till vissa TKI, men mer mottagliga för andra. Alternativ signalering vägar kan aktiveras vid mutation17. Phospho-antikropp matriser ger mer insikt om som ett bredare program för identifiering av de cellsmedierade reaktioner deltar i motstånd och hypoxi, etc., och följaktligen förståelse av, mekanismerna involverade.
Teknik som möjliggör en bedömning av protein ändringar utgör en viktig komponent i systembiologi eftersom de tjänar ofta en reglerande funktion, såsom modulera aktiviteten hos ett enzym eller fysiska interaktioner mellan proteiner. Vikten av post-translationella modifieringar illustreras av rollen av protein fosforylering i nästan alla extracellulära-utlöst signaltransduktion vägar18. Traditionellt, kan identifiering av kinaser eller phosphorylation status av proteiner också bestämmas genom Western blot analys, särskilt om forskaren är intresserad av endast 1 – 5 mål. Dock Western blotting är mycket selektiva och kan vara partisk mot förkunskaper och kan missa viktiga mål som ett resultat. Antikropp array(s) ger en medium-genomströmning avläsning av flera mål genom att bädda in olika capture-antikroppar [pan-specifika fosforylerade tyrosine(s), anti-ubiquitin, etc.] på en solid matris(t exglas eller nitrocellulosa). Sekundära antikroppar ger information om specifika proteiner i en sandwich-baserade ELISA-format (figur 1). Denna analys blir mer kraftfull och relevant som mer mål är av intresse eller tidigare kunskap är begränsad15. De phospho-arrayer är mer allmänt anställningsbara som de kan jämföra fosforylering samt allmänna mängder protein av ett bredare utbud av mål i ett experiment och ger en betydligt bättre kvantifiering över masspektrometri. Denna teknik är inte tillämplig för identifiering av nya eller tidigare okända fosforylering platser.
Storskaliga mass spectrometry-baserad proteomik kunde användas för att identifiera specifika fosforylering områden av proteiner19. Även om denna teknik kan räkna upp tusentals posttranslationella händelser, kräver det dyra instrumentering, dedikerad experimentella rörledningar och en computational sakkunskap som är utom räckhåll för de flesta forskare.
Antikropp matriser ger en samtidig avläsning på olika protein utläsningar16. Dessa kan vara förändringar i protein ubiquitin (ubiquitin matris) eller fosforylering. Den viktigaste fördelen med denna array-teknik är att det ger viktig feedback på biologiska tillståndet för olika biologiska spridningsvägar är associerad med viktig cell parametrar (protein 53 kDa, p53, receptortyrosinkinaser och sockernivån) samtidigt. Dessutom är det möjligt att kombinera olika matristyper för att öka penetrationen av ett test (t.ex., apoptos och ubiquitin och fosforylering). Denna förmåga att kombinera flera matriser för att bedöma olika posttranslationella förändringar i flera prover samtidigt på en tid och cost effective sätt som inte kräver specifik instrumentering eller expertis är av en betydande fördel i fall antikropp-matriser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein utvinning
- Tallrik 5 x 106 celler på en 10 mm vävnadsodling plattan (eller kolv) i vävnadsodling huva. Räkna cellerna vid tidpunkten för plätering med en automatisk cell counter eller hemocytometer. Alternativt kan du uppskatta celltalet.
- Skölj de celler som odlas på 10 mm plåt (eller kolv) grundligt 3 x med 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH = 7.4). Se till att ta bort alla PBS innan du lägger lyseringsbuffert.
Obs: Lyseringsbuffert tillhandahålls vanligtvis med kit. Om så inte är fallet, sedan använda en radioimmunoprecipitation analysbuffert (RIPA) eller någon annan cell lyseringsbuffert som innehåller en cocktail av proteashämmare och fosfatas-hämmare. - Lysera 1 x 107 celler/mL av celler i lyseringsbuffert genom att rätt mängd buffert till cellerna och skrapa cellerna med en cell skrapa in lyseringsbuffert. (t.ex., för HeLa cells och MiaPaCa-2, Använd 600 µL per 10 cm platta).
- Pipettera den lysate upp och ner (cirka 10 x) och överföra den till en ny 1,5 mL tub.
- Inkubera i lysates under 30 minuter vid 4 ° C, helst på en rocker/shaker. Tryck på den lysate genom en spruta med en 27 G nål för 10 x att säkerställa en korrekt störning av cell membrane(s). Alternativt kan Sonikera den lysate. Lagra lysates vid-20 ° C eller använda dem omedelbart.
- Centrifugera det lysate vid 14 000 x g vid 4 ° C i 15 min och överför supernatanten till en ren 1,5 mL tub.
- Kvantifiera mängden totalt protein av bicinchoninic syra assay (BCA)20 eller motsvarande såsom Lowry eller Bradford och fortsätta med minst 50 – 400 μg. Använda proteiner omedelbart eller alikvot och frysa/förvara dem vid-70 ° C (Undvik flera frysning-tining cykler).
2. human kreatinfosfokinas Array
- Placera alla reagenser i rumstemperatur innan du börjar (för ca 1 h).
Obs: Alla reagenser och plast slitage ingår i kitet. - Förbereda alla reagenser färska (matris buffertar) innan du startar proceduren följa tillverkarens instruktioner (beroende på val av mål/matriser, instruktionerna kan variera något).
- Rekonstruera de Upptäck antikropp drinkarna i 100 μl avjoniserat vatten eller följ tillverkarens instruktioner bör de skiljer sig för de 1,5 mL provrör som tillhandahålls.
- Bered 1 x Tvättbuffert genom att späda ut 40 mL 25 x Tvättbuffert i 960 mL avjoniserat vatten och blanda dem genom att vända.
Obs: Kristaller löses upp vid rumstemperatur. Bufferten kan gulna med tiden men fortfarande fungerar. - Pipettera 1 mL av array buffert 1 i varje brunn av en 8-väl flera fack (eller 2 mL i ett 4-väl flera fack).
- Med platt spets pincett, bort array membran mellan de skyddande ark och placera dem i brunnar. Kontrollera siffrorna på membranet vänd uppåt.
Obs: Vid nedsänkning försvinner färgen på membranet. - Täcka facket med lock och inkubera det på en gungande plattform shaker i 60 min i rumstemperatur.
Obs: Detta är membran blockerande steget. - Under inkubationstiden, bereda protein proverna. Lägga till 50-100 μg av totalprotein. Späd den lysate, med en maximal volym på 334 μL, med lyseringsbuffert till en slutlig volym av 1 mL.
Obs: 50-100 μg totala protein räcker oftast. - Aspirera array buffert 1 noggrant och inkubera membran med 1 mL av proverna övernattning på 2 – 8 ° C på en gungande plattform shaker.
Obs: Inte touch/scratch membran. - Nästa dag, tvätta matrisen genom att försiktigt ta bort varje matris och placera det i enskilda plastburkar (ca 8 x 11 cm2) med 20 mL 1 x tvättbuffert. Tvätta membranen 3 x 10 min på en gungande plattform 1 x tvätt buffert vid rumstemperatur.
- Tillsätt 20 μL av rekonstituerade antikropp cocktail från steg 2,3 till 1 mL 1 x array buffert 2. Tillsätt 1 mL av denna lösning i varje 8-brunn som ska användas.
- Ta försiktigt bort hinnor från tvätta magasinen. Blot den nedre kanten på hushållspapper för att ta bort någon överflödig tvättbuffert och överföra dem tillbaka i facket som innehåller antikroppar cocktails. Täcka facket med locket och inkubera det för 2 h i rumstemperatur på en gungande plattform. Grundligt skölj används magasinen med dH2O och torka dem för senare användning.
- Försiktigt bort varje matris och placera dem tillbaka till de rena individuella plastburkar (ca 8 x 11 cm2) med 20 mL 1 x tvättbuffert. Tvätta dem 3 x 10 min med tvättbuffert på en gungande plattform vid rumstemperatur.
- Späd streptividin-HRP (tillhandahålls med kit) eller streptividin-fluorescerande färgämne (för en mer kvantitativ detection) 1:1,000 1 x array buffert 2 i en 15 mL provrör.
- Returnera membranen i de 8-väl rätter som innehåller HP lösningen och inkubera dem i 30 min i rumstemperatur på en gungande plattform (om med hjälp av fluorescens, Linda facket i aluminiumfolie att undvika någon ljus exponering).
- Ta bort överflödigt bufferten genom att placera membranet mellan 2 bitar av 5 mm 3 M papper. För imaging med en X-ray film/Kemiluminiscens imager, inkubera torkade membran med en HRP upptäckt lösning (blanda två Kemiluminiscens lösningar 1:1) för 3 min och placera membranet i en genomskinlig plast ark beskyddare.
Obs: Torkade membrane(s) kan också placeras i en fluorescerande imager att upptäcka fluorescerande signalen; minimera ljus exponering för membranet innan imaging. För kvantifiering av X-ray film eller imager filer, undvika överexponering. De flesta Kemiluminiscens/fluorescerande imagers har en funktion för att undvika en mättnad av signalen.
3. dataanalys
- Hämta ImageJ, en bild bearbetningen program21, och installera programvaran.
- Öppna ImageJ genom att dubbelklicka på 'ImageJ icon'. Välj bilden som analyseras genom att klicka på 'Arkiv' i menyraden, Välj 'Öppna' från droppa-ned menyn och bläddra dator filerna för bilden av intresse. Klicka på filen för att öppna den.
- Invertera bilden för analys (svarta fläckar på den vita bakgrunden till vita fläckar på en svart bakgrund) genom att klicka på 'Redigera' i menyraden och välja 'Invertera' från droppa-ned menyn.
- Välj 'oval 'ikonen i verktygsfältet (det andra alternativet i verktygsfältet ImageJ). Rita en cirkel/oval genom att klicka på bilden (svart kors) och flytta musen. Justera storleken/formen av cirkel/ovala att omringa prickar på dot blot.
- Klicka på ”analysera” i menyraden och välj sedan 'Åtgärd' från droppa-ned menyn automatiskt öppnar ett nytt fönster med värdena i det markerade området (område, medelvärde, minimum och maximum).
- Flytta det cirkulära området genom att dra cirkeln från center (sätta poängen med pil höger i mitten) och placera den runt området nästa mätning (dot). Mäta alla platser av intresse, den positiva kontrollen, den negativa kontrollen och bakgrunden för analys.
Obs: Den negativa kontrollen är PBS, bakgrunden är en del av membranet utan någon fläck (någon del kommer att göra) och den positiva kontrollen är en kontroll som tillhandahålls av tillverkaren. - Välj PBS negativ kontroll fläckar och subtrahera värdet från varje plats. Genomsnittliga intensiteten för varje par av dubbla platserna som representerar varje receptor tyrosinkinas (RTK). Varje genomsnittliga intensitet kan relateras till kontrollen för att beräkna fold förändringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att undersöka effekten av TKI motstånd på cellsmedierade reaktioner i cellinjer, analyserades fyra prover. Ett kontrollprov (H3255r1) och 3 TKI-resistenta cellinjer (H3255r2-4) (figur 2) var relaterade till mallen plats antikropp (figur 3). Alla 4 prover var beredda använder detta protokoll. Sex phosphoproteins med differentiell aktivitet valdes för demonstration av analysen av de antikroppar arrayer (figur 4). Stresskartan (figur 5) ger en semikvantitativ avläsning på förändringarna i protein fosforyleringen av viktig signaltransduktion proteiner. Validering av array resultaten kan slutföras genom att implementera ortogonala tillvägagångssätt, såsom Western blotting.
Figur 1: Schematisk semikvantitativt antikropp matriser. De antikropp matriserna är baserade på principen sandwich immunoassay, där en samling av capture antikroppar är inbäddad i antingen glaset eller nitrocellulosa stöd. De cell lysates inkuberas med membranet och arrayer utsätts för sekundära antikroppar. En semikvantitativ avläsning kan erhållas från Kemiluminiscens substrat eller, mer kvantitativa information lysrör-baserad avbildning. Några signaler som härrör från film eller TIF bilder får behandlas av densitometry och en beräkning av de vik-förändringarna för varje protein. Hela processen tar ungefär dag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel phospho-antikropp array utvecklas med kameran. Fluorescerande fläckarna upptäcks i duplikat (två ställen per mål). De prover och positiv kontroll ställen visar varierande intensitet. Här är jämförelsen av de TKI-känsliga H3255r1 och 3 resistenta (H3255r2-4) prov matriser visas varje splittrades membran A och B. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: karta över array fläckarna. Karta länkar fläckarna antikropp mål. Fläckarna är horisontellt märkta A - G vertikalt och 1-10. Den positiva kontrollen (orange) på alla membran och brukar finnas i hörnen. Den negativa PBS-kontrollen är markerade i svart medan prov fläckarna markeras i gult. För varje matris finns också en lista av antikroppar för identifiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: exempel på Data analys. (A), intensiteten av platser av intresse, positivt kontrollen, och bakgrunden var identifierade på kartan och mätt för alla prover. (B) relativt intensitet (spot intensiteten med intensitet bakgrund bort och normaliserade till en positiv kontroll intensitet) visas i ett stapeldiagram för några valda kandidater. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: värmekarta över differential signaling i H3255 känsliga (r1) och resistenta (r2-4) cellinjer. En relativ plats intensitet användes för att generera en värmekarta för en jämförelse av förändringar i CREB, P53, AKT och STAT5 i alla 4 prover. Några höga nivåer visas i olika nyanser av rött medan någon lägre nivåer visas i blå22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strategier som kombinerar många biologiska utläsningar är till sin natur mer exakt representationer av det cellulära maskineriet i ett experiment som utförs. Tillkomsten av phospho-antikropp matriser gör en snabb karakterisering av mönstret för ändringar som kan vara mer informativa än ändring status för någon enda protein. Det allmänna arbetsflödet för tillämpningen av phospho-antikropp matriser är baserad på en ändring i serine, treonin eller tyrosin. Detta exempel fokuserat på karakterisera de förändringar i samband med motståndet mot terapi i lungcancer. Huvudsakliga motivet för denna ansökan är att protein fosforylering spelar en central roll i signaltransduktion i många mänskliga cancerformer18, och denna metod kommer att överlåtas till andra system. En dysreglering av fosforylering i cancer innebär vanligtvis en överaktivering av ett tyrosinkinas, och följaktligen de fosforyleras substrat (ofta inklusive den auto-fosforyleras kinase själv) befinner sig på högre nivåer än i normal fysiologiska inställningar och därför kan göra upp en betydande del av phosphoproteins i en cancercell. Dessa högre nivåer av fosforylering underlättar identifiering. Dessutom har protein fosforylering en medicinsk betydelse eftersom avvikande tyrosin fosforylering är ett kännetecken för många typer av cancer23. Dessutom, eftersom denna teknik är överförbar till utredningen av andra biologiska system som använder fosforylering, kan många av de funktioner som beskrivs här enkelt justeras att fokusera på andra typer av protein arrays (ubiquitin, apoptos, etc.).
Phospho-antikropp matriser används ofta för identifiering av eventuella signalvägar som är inblandade, antingen som en undersökande metod eller verifiering av en viss väg. Olika företag gör kit för båda phosphorylation status och för de totala nivåerna av proteiner. Realtid polymeras-kedjereaktion (PCR) analysen eller microarrays är mycket mer kvantitativa, de beakta endast mRNA nivåer medan en översättning samt post-translationella modifieringar kan inte hanteras. Frånsett fosforylering, kan andra post-translationella modifieringar som glycosylation eller ubiquitin också tas upp av matriser24,25.
En av de viktiga faktorerna att överväga innan du börjar antikropp matriser är att börja med friska och aktivt delande celler. Hypoxi, oxidativ stress och inflammation kan ge förändringar i den signaltransduktion vägar26 som kan förvränga resultaten och göra en feltolkning om behandlas felaktigt. Denna stress kan hänföras till utformningen av media eller plätering för lite eller för många celler, eller att utsätta celler att dåligt reglerade miljöer eller att behandla den kontrollen kontra provexemplaren något annorlunda. Vi har också noterat stora skillnader i antalet passage eller tiden i kultur efter upptining. Nyckeln till att undvika dessa artificiellt införda variabler är att hålla allt mellan proverna lika konsekvent som möjligt. Ändra inte FBS procentandelen eller mediavolymen, etc., under experimentet.
Dataanalys bör också övervägas innan du startar ett array-experiment. En kemiluminiscent array analys är endast semikvantitativt, och dess dynamiska omfång är ungefär en storleksordning, medan en fluorescerande strategi ökar det dynamiska omfånget till cirka två tiopotenser. Skalan som matriser utförs beror på specifika biologiska frågan/frågorna. Det är möjligt att analysera en specifik resistenta cellinje av intresse för alla ändringar i de post-translationella modifieringar jämfört med den ursprungliga cellen fodrar eller fokusera på en viss väg för en mängd olika resistenta cellinjer. Skalbarhet av detta tillvägagångssätt bör övervägas vid tidiga planeringsstadiet. Resultaten av en antikropp matris ska dessutom alltid bekräftas med en sekundär metod på färska prover eller den samma lysates. En western blot-analys kan användas för att verifiera ändringarna till specifika mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för generöst ekonomiskt stöd av Lawrence J. Ellison Institute of omvälvande Medicine av USC (en gåva till David Agus). Vi uppskattar stöd av hösten Beemer och Lisa Flashner som leder till generation och offentliggörandet av detta manuskript. Vi tackar Laura Ng för hennes administrativt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
- Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
- Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).
- Di Fiore, P. P., et al. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells. Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).
- Maguire, H. C., Greene, M. I.
- Busse, D., et al. Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity. Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).
- Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).
- Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. [Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).
- Dulbecco, R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).
- Barinaga, M. DoE provides funds for human genome sequencing. Nature. 331 (6152), 103 (1988).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- McCain, J. The cancer genome atlas: new weapon in old war? Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).
- Weinstein, J. N., et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Carlson, B. Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials. Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).
- Huang, R. P. Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).
- Rani, S., O'Driscoll, L. Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays. Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).
- Kani, K., et al. JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).
- Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr Signal transduction and the control of gene expression. Science. 295 (5556), 813-818 (2002).
- Rikova, K., et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).
- Chen, V. W., et al. Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system. Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Ward, J. H. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).
- Zhou, T., et al. Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).
- McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. Hypoxia, oxidative stress and inflammation. Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).
