Análise de sequência do Gene da imunoglobulina na leucemia linfocítica crônica: Do paciente Material para interpretação de sequência

Resumo

Neste documento, apresentamos um protocolo que detalhes os aspectos técnicos e requisitos essenciais para garantir a análise de sequências de genes IG robusto em pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL), baseado na experiência acumulada da iniciativa de investigação europeia CLL (ERIC).

Resumo

Durante a maturação de células B, o complexo processo de recombinação de V (D) J de gene de imunoglobulinas (IG) juntamente com somática (SHM) dá origem a uma única sequência de ADN dentro de cada célula B. Desde neoplasias malignas de células B resultam da expansão clonal de uma única célula, os genes IG representam uma única assinatura molecular comum a todas as células malignas dentro de um paciente individual; assim, os rearranjos do gene de IG podem ser usados como marcadores clonais. Além de servir como um importante identificador clonal, a sequência do gene IG pode atuar como um timeline' molecular' uma vez que está associado com estádios de desenvolvimento específicos e, portanto, reflete a história da célula B envolvida na transformação neoplásica. Além disso, para certas malignidades, em especial leucemia linfocítica crônica (CLL), a sequência do gene IG mantém recursos potencialmente preditivos e prognósticos. Dito isto, extrapolar significativas conclusões da análise de sequência do IG gene seria impossível se ferramentas e métodos robustos não estavam disponíveis para ajudar na sua análise. Neste artigo, valendo-se da vasta experiência da iniciativa europeia de investigação sobre CLL (ERIC), detalhes dos aspectos técnicos e requisitos essenciais necessários para garantir confiável e reprodutível IG gene sequência análise em CLL, um teste que agora é recomendado para todos os pacientes com CLL antes do tratamento. Mais especificamente, as várias fases analíticas são descritas desde a identificação do rearranjo de gene de IG de clonotypic e a determinação da sequência de nucleotídeos a exata interpretação clínica dos dados de sequência do gene do IG.

Introdução

Leucemia linfocítica crônica (CLL), a forma mais comum de leucemia em adultos nos países ocidentais, é caracterizada pela expansão clonal de B células neoplásicas maduras¹. Do ponto de vista clínica, o curso da doença é extremamente variável, com alguns pacientes experimentando uma doença agressiva, que requerem tratamento muito cedo após o diagnóstico e muitas vezes remitente ou sendo refratários à terapia. Isto está em contraste com uma proporção substancial de pacientes (~ 30%), que apresentam uma doença indolente, nunca necessitam de tratamento e têm uma expectativa de vida semelhante à de indivíduos saudáveis de correspondência idade². Esta heterogeneidade clínica é refletida na diversidade das anormalidades moleculares encontradas em pacientes CLL, que em última análise, dirigir a patogênese e progressão desta doença³.

Estabelecer que um diagnóstico preciso do CLL é geralmente simples, no entanto, a referida heterogeneidade clínica pode entravar a gestão eficaz dos pacientes CLL e ressalta a necessidade de marcadores prognósticos e preditivos que poderá contribuir para tratamento de tomada de decisões². Numerosos estudos têm tentado refinar o prognóstico do CLL, culminando em uma abundância de novos marcadores clínicos e biológicos, sendo proposta⁴. O status mutacional do gene clonotypic imunoglobulina pesadas variável (IGHV) é um dos marcadores prognósticos mais robustos na CLL, em grande parte devido ao fato de que (i) permanece estável ao longo do tempo e como a doença progride, e (ii) é independente dos outros parâmetros clínicos e biológicos⁵. Que não obstante, marcadores de muito poucos, se houver, incluindo status mutacional IGHV, são atualmente aplicados na rotina clínica no momento do diagnóstico.

Relatórios iniciais sobre a utilidade clínica de sequenciamento genético de IG em 1999, quando 2 estudos independentes relataram que pacientes com n ou uma carga mínima somática (SHM) (CLL unmutated, U-CLL) datam de CLL têm um prognóstico pior do que pacientes portadores de um maior fardo SHM (CLL mutado, M-CLL)^6,7. Mais especificamente, o grupo U-CLL consistiu em casos abrigando os genes IGHV de clonotypic com poucos ou nenhum SHM e, portanto, uma alta porcentagem identidade ao gene IGHV mais próximo da linha germinal (≥98%), Considerando que M-CLL consistiu em casos com uma maior carga mutacional (identidade por cento para o mais próximo germline gene IGHV < % de 98). Desde os primeiros estudos, foi continuamente demonstrado que casos de U-CLL exibem um tratamento mais curto de tempo-para-primeiro (TTFT) e sobrevida global (OS) em relação ao M-CLL.

Em retrospectiva, esses estudos seminais destacou o papel central do receptor de células B (BcR) IG em Patobiológico LLC, abrindo assim o caminho para pesquisa extensiva em interações CLL-microenvironmental que, por sua vez, levaram a uma apreciação mais abrangente de a heterogeneidade biológica desta doença^8,9. Estudos mais recentes têm proporcionado apoio adicional para a importância das análises imunogenéticos na CLL, revelando que casos individuais podem cluster em subconjuntos devido à partilha de (quase) sequências de genes BcR IG idênticas, um fenômeno denominado estereotipia BcR IG^{10 ,11,12,13}. Acumular evidência suporta a noção que pacientes atribuídos ao mesmo subconjunto estereotipados harbor semelhante clinicobiological propriedades que separam-se claramente de outros pacientes CLL dentro da mesma categoria SHM mas com diferentes sequências de genes de IG; na verdade tem sido relatado que a categorização dos pacientes CLL baseado em estereotipia BcR IG mais refina a segregação em massa dos pacientes CLL em U-CLL ou M-CLL grupos^{14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20}.

Do ponto de vista clínica, é notável que o status SHM do gene clonotypic IGHV parece correlacionar-se com uma resposta específica para quimioimunoterapia. Em particulares, pacientes CLL-M tratados com uma combinação de fludarabina/ciclofosfamida/rituximab (FCR), o tratamento padrão ouro para pacientes CLL medicamente aptos sem defeitos do gene TP53 , exibiu livre de progressão significativamente mais sobrevivência (PFS) e sistema operacional em comparação com pacientes U-CLL, que receberam o mesmo tratamento^21,22,23. Portanto, identificação do status SHM tornou-se importante em especial para auxiliar na gestão terapêutica do CLL pacientes, ou seja, um marcador preditivo, ao invés de avaliar o curso clínico da doença ou seja, um marcador prognóstico. Na verdade, de acordo com a recente atualização das orientações do Workshop Internacional sobre CLL NCI-patrocinado, o status SHM dos genes IGHV rearranjados deve ser determinado em todos os casos CLL antes do início do tratamento em ambas prática geral e clínica ensaios de²⁴. Além disso, devido a recente aprovação de agentes de tratamento de novela e o número crescente de drogas nos julgamentos, o status SHM da molécula de IG pode desempenhar um papel ainda maior na gestão terapêutica dos pacientes com CLL no futuro próximo⁵.

Este relatório detalha todos os aspectos da análise de sequência do gene IG, começando com a escolha do material apropriado e culminando com a interpretação clínica dos resultados do sequenciamento. Avaliação em profundidade dessas etapas é importante na rotina diagnóstica para a produção de resultados confiáveis e para garantir a exata estratificação de paciente no âmbito de ensaios clínicos. Os protocolos são fornecidos para ajudar na harmonização da análise de sequência do gene IG, garantindo assim que os resultados sejam comparáveis entre diferentes laboratórios.

Protocolo

O protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de ética do San Raffaele Instituto Científico, Milão, Itália.

1. material seleção

1. Escolha de material começar
   Nota: Na maioria dos casos de LLC a contagem de células do tumor é elevada no momento do diagnóstico (> 80-90%). Assim, célula de triagem ou enriquecimento das células leucêmicas geralmente não é necessário.
   1. Se usar sangue periférico (PB), o material mais comum da escolha para análise de sequência do gene IG, use um volume de sangue entre 10 a 20 mL.
   2. Como alternativa, em casos com uma baixa carga de célula CLL, usa a célula classificação de amostras de PB ou material de outros tecidos, como a medula óssea (BM) ou linfonodos (LN).
2. Tempo de amostragem
   1. Tempo de amostragem não é crucial, dado que o status do IG SHM é estável horas extras; dito isso, evitar amostragem em determinados períodos, como imediatamente após ou durante a terapia, uma vez que o baixo número de células LLC pode complicar a análise e levar a resultados não-confiáveis.
3. Armazenamento e coleta de material
   Nota: Coleta e armazenamento de material começar depende fortemente a escolha do material.
   1. Para amostras de PB ou BM, usar tubos de coleção (citrato-tris-pyridossalphosphate) EDTA ou CPT para impedir a inibição do processo de amplificação da PCR; Como alternativa, use tubos de heparina.
   2. Para amostras de LN, coleção opções são ou suspensões celulares, biópsias do tecido congelado fresco ou, em raros casos fixada em formol parafina (FFPE) tecidos.

2. densidade gradiente separação

Nota: Se o PB ou BM é a matéria-prima de escolha, que é o cenário mais frequente, isolamento de células mononucleares usando separação gradiente de densidade é recomendado.

1. Adicionar 200 µ l de EDTA (EDTA 0,5 M / pH 8.0) para um tubo de coleta estéril 50 mL. Adicione 20 mL de PB e 15 mL de RPMI. Mix por pipetagem (2 - 3 vezes é suficiente).
2. Adicione 15 mL de meio de gradiente de densidade para um novo tubo de coleta de 50 mL.
   Nota: no caso do volume de PB é inferior a 20 mL, os volumes de RPMI (etapa anterior) e gradiente de densidade devem ser modificados em conformidade.
3. Lentamente a camada na solução da etapa 2.1 para que ele não interrompa o gradiente. Centrifugar a 800 x g por 20 minutos com o freio da centrífuga fora.
4. Recolher o anel de células mononucleares que se formou entre a camada de plasma/plaquetas superior e a camada média densidade gradiente usando uma pipeta Pasteur estéril e, em seguida, transfira para um tubo de coleta estéril 15 mL.
5. Adicione RPMI até um volume final de 12 mL e misture. Centrifugar a 750 x g durante 8 minutos. Desprezar o sobrenadante.
6. Ressuspender as células usando 10 mL de RPMI e repita a etapa 2.5.
7. Dissolva o centrifugado em 1 mL de PBS (DPBS, sem cálcio, sem magnésio). Realizar uma contagem de células usando uma placa de Neubauer, misturando-se 20 µ l de amostra e 80 µ l de 01:10 solução do Türk.
8. Se processamento a jusante da amostra não está programado para o mesmo dia, centrifugar a amostra a 750 x g durante 8 minutos. Desprezar o sobrenadante e armazenar o centrifugado em-80^o C.

3. ácido nucleico extração

1. Decida sobre um substrato para a análise do status SHM dos genes do IG. O DNA genômico (gDNA) é a escolha mais popular, como não há nenhuma necessidade para uma etapa de transcrição reversa; Como alternativa, o uso de RNA/complementar DNA (cDNA) assegura que, pelo menos no nível transcricional, o rearranjo de IG de clonotypic produtivo, funcional é o alvo "favorecido".
2. Usar um dos inúmeros kits comercialmente disponíveis adequados para extração de RNA total ou gDNA e a síntese do cDNA (ver Tabela de materiais).
3. Avalie a integridade do DNA ou RNA usando sistemas de quantificação do ácido nucleico sensível. Se usando FFPE material para análise, avaliar a qualidade e quantidade do cDNA/gDNA extraído por amplificação por PCR de um gene conhecido das tarefas domésticas, por exemplo, retinoico ácido receptor alfa (RARa), beta-actina, etc.

4. amplificação e sequenciamento de rearranjos do Gene IGHV-Digha-IGHJ

1. Seleção de IGH PCR primer
   1. De preferência, realize o PCR multiplex com IGHV subgrupo específico 5' primeiras demão e IGHJ gene específico 3' primeiras demão^25,26. Se os resultados estão abaixo do ideal, prepare separadas misturas PCR utilizando primers de subgrupo específico IGHV único.
   2. Use 5' primeiras demão que recozem a qualquer região líder localizada imediatamente upstream de rearranjo de IG ou dentro da região de codificação (por exemplo, quadro 1, FR1) do gene IGHV.
      1. Iniciadores de líder de utilização que permitem a amplificação de todo o reorganizados sequência de genes IGHV-Digha-IGHJ, que por sua vez, permitirá a estimativa exacta dos níveis SHM. Assim, as primeiras demão do IGHV líder são recomendadas por ERIC em suas diretrizes atualizadas para IG gene sequência análise²⁷.
      2. Em casos onde as primeiras demão líder falharam para amplificar o rearranjo de IG de clonotypic, use primers IGHV FR1. No entanto, as primeiras demão quadro não amplificar o rearranjo de gene de IG clonotypic inteira, que pode levar à determinação imprecisa do nível de SHM. Para este cenário, claramente no relatório clínico que o uso de primers IGHV FR1 pode superestimar a verdadeira identidade de porcentagem para o gene mais próximo do germline.
   3. Para a extremidade 3', use iniciadores consenso alvejando os genes IGHJ, conjuntos multiplex de primeiras demão gene-específico IGHJ ou iniciadores de isotipo específico, dependendo do substrato. Sequências da primeira demão são fornecidas na tabela 1, Considerando que a Figura 1 descreve os vários locais para recozimento da primeira demão.
2. Amplificação por PCR de rearranjos do gene IGHV-Digha-IGHJ
   1. Prepare a mistura de primeira demão usando quantidades equimolar de cada subgrupo primer(s) para garantir a amplificação imparcial.
      1. Por exemplo, quando usando as primeiras demão líder, duas primeiras demão diferentes são usadas para amplificar rearranjos pertencentes ao subgrupo IGHV1. Assim, use uma quantidade destas 2 primeiras demão (IGHV1L e IGHV1bL) que é a que metade em relação ao IGHV4L, que é o único primer para rearranjos do subgrupo IGHV4.
      2. Aplica a abordagem oposta no caso os primers IGHJ1-2 e IGHJ4-5. Como estas primeiras demão alvo dois diferentes subgrupos de gene IGHJ, o dobro da quantidade em comparação com os primers IGHJ3 e IGHJ6.
      3. Use a tabela 1 para determinar as quantidades exatas da primeira demão ao preparar misturas relevantes da primeira demão.
   2. Reagentes de PCR Mix conforme listado na tabela 2. Depois de combinar todos os reagentes da PCR em um tubo PCR, adicionar 0,5 µ l de Taq polimerase e 100 ng de gDNA ou 2 μL de cDNA (cDNA deve ser preparado usando 1 µ g de RNA).
      Nota: Uma enzima Taq com atividade de revisão não é essencial, como a taxa de erro de amplificação é extremamente baixa e, portanto, não afetará o nível de SHM.
   3. Execute o protocolo PCR térmico detalhado na tabela 3.
3. Avaliação clonality
   Nota: Um próximo passo crítico envolve avaliar o padrão de clonality do produto do PCR. Ao avaliar clonality em pacientes CLL, o achado mais comum é uma anticorpo monoclonal, única pico/banda.
   1. Use métodos com alta sensibilidade, tais como análise de fragmento ou doheteroduplex, para avaliação de clonality^28,29.
   2. Análise do fragmento
      1. Executar multiplex PCR usando líder IGHV 5'-rotulados ou FR1 subgrupo específico do PCR primeiras demão; Isto irá produzir os produtos de PCR que podem ser separados por eletroforese capilar, permitindo avaliação clonality de IGH PCR produtos com base na sua complementaridade IGHV determinação região 3 comprimentos (CDR3).
      2. Use primers, reagentes e condições térmicas idênticas daqueles mencionados anteriormente (Ver tabelas 1-3). 5´ personalizado-rotulado primeiras demão fluorescente são rotulados oligos com uma escolha de corantes na extremidade 5'. São exemplos de corantes repórter 6-FAM, HEX, NED ou TET. Assim, são necessárias 2 reações separadas baseada na utilização de 3 diferentes corantes por reação.
   3. Avaliar o tamanho dos produtos PCR em gel de poliacrilamida 6% (6%) (esta porcentagem resulta em ótima resolução), usando 1 x TBE como um buffer de execução. Executar a 80 V por 45 min.
      Nota: É recomendável que os produtos de PCR podem migrar no gel por tempo suficiente para que o anticorpo monoclonais amostras podem ser separadas do fundo policlonal e o marcador de tamanho de DNA pode separar adequadamente. Fatores como o tamanho e a espessura do gel podem afetar a migração então não única configuração (tensão e tempo) pode garantir um resultado ideal que dizia, definindo a tensão em 80 V por 45 minutos é um bom ponto de partida como minimiza o risco da amostra migrar também rapidamente e 'correr' fora do gel.
   4. Procure produtos PCR de aproximadamente 500 pares de bases quando usando as primeiras demão do IGHV líder e 350 pares de base quando utilizar as misturas de cartilha IGHV FR1.
      Nota: Em casos raros, casos de LLC foram encontrados para transportar produtos double, anticorpo monoclonais e em casos ainda mais raros, casos podem apresentar um padrão oligoclonais. Um agente intercalante tais como brometo de etídio (EtBr) ou menos perigosas e mais sensíveis disponíveis comercialmente manchas de DNA pode ser usado para a visualização de DNA em géis de acrilamida usando excitação UV ou luz azul.
4. Purificação do produto do PCR
   Nota: Os produtos de PCR são purificados para remover qualquer fundo polyclonal originários de células B normais dentro da amostra CLL, bem como cartilha dímeros que podem levar ao sequenciamento de qualidade inferior. Use qualquer método que remove os dNTPs não incorporada e primers para PCR limpar, tais como um tratamento enzimático, por exemplo, Sap (fosfatase alcalina do camarão) / Exo (Exonuclease eu), ou com base em coluna de purificação.
   1. Carrega o volume total do produto do PCR em um gel de agarose de baixo ponto de fusão de 3%.
   2. Permitir que os produtos PCR executar no gel, até que eles se separam do fundo.
   3. Excisar as bandas PCR afiadas, proeminentes, purificar e eluir. Se forem detectados dois rearranjos, ambas as bandas devem ser extirpadas e sequenciado em separado.
   4. Para executar limpar Sap/Exo, siga as instruções do fabricante sobre os volumes específicos para usar; no entanto, uma reação típica pode conter 1 µ l Sap, 0. 5 µ l Exo e incubação de 5 x 2 µ l de buffer por reação de PCR 5-10 µ l. Misture delicadamente vortexing cada amostra e incubar a 37 ° C num bloco de PCR durante 30 minutos. Inactivar as enzimas por aquecimento a 85 ° C por 15 minutos.
   5. Carrega uma pequena quantidade dos produtos do PCR em um gel de agarose a 3% para avaliar a pureza do produto.

5. Sanger sequenciamento

Nota: Sequenciamento várias estratégias existem, no entanto, independentemente da abordagem exata, direta de sequenciamento de ambas as vertentes é obrigatório para garantir um resultado confiável.

1. Protocolos de sequenciamento geral
   1. Se amplificação foi executada usando as primeiras demão única, proceda em sequência usando o apropriado IGHV - e IGHJ - ou constantes iniciadores específicos da região. Esta abordagem também pode ser adotada se multiplexado fluorescente etiquetados primers foram utilizados e o produto do PCR foi avaliado através da análise do fragmento (primeiras demão de sequenciamento não devem ser rotuladas).
   2. Se multiplexado primers foram usados e clonality foi avaliada em um gel, use um primer a jusante no primeiro escalão de sequenciamento , por exemplo, um consenso da primeira demão IGHJ com a sequência 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 '. Alternativamente, uma cartilha CH pode ser usada se o cDNA foi usado como substrato. Em seguida, use o subgrupo específico IGHV líder ou FR1 primers para a segunda etapa de sequenciamento.
2. Protocolo de sequenciamento de exemplo
   Nota: Existem vários protocolos de sequenciamento e um protocolo de exemplo é detalhado abaixo.
   1. Diluir 33 ng do produto do PCR em um volume total de 11,5 µ l utilizando, por exemplo, água esterilizada. Desnature o produto PCR por aquecimento a 95 ° C por 5 minutos. Coloca imediatamente no gelo durante 10 minutos para evitar a formação de estruturas secundárias.
   2. Adicione 8 µ l de mistura de mestre para cada tubo junto com 0,5 µ l (correspondente a 5 pmol) da primeira demão.
   3. Como um controle, prepare um tubo contendo 8 µ l de mistura de mestre, modelo de controle 0,5 µ l pUC18, 2 µ l (-) 47 sequenciamento da primeira demão e água estéril de 9,5 µ l. O volume total final em cada tubo deve ser de 20 µ l.
   4. Use condições de ciclagem térmicas para a reação de sequenciamento, conforme detalhado na tabela 4.
   5. Preparar a solução de paragem misturando 2 µ l de acetato de sódio 3M (pH 5.2), 2 µ l EDTA 100 Mm (pH 8.0) e 1 µ l de glicogênio (concentração 20 mg/mL), em seguida, adicione 5 µ l de cada amostra. Transferi o produto para um novo tubo de microcentrifugadora.
   6. Adicione 60 µ l de etanol 100% (-20 ° C) e misture suavemente. Centrifugar a 14.000 rpm durante 15 minutos (4 ° C). Desprezar o sobrenadante.
   7. Adicione 100 µ l de etanol 70% (-20 ° C) e misture suavemente. Centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos (4 ° C). Desprezar o sobrenadante. Repeti uma vez.
   8. Seca a pelota durante 90 minutos à temperatura ambiente. Adicione 40 µ l de sódio Dodecil sulfato de solução (SDS) para cada amostra.
   9. Transferir a amostra para uma placa de sequenciamento, cobrir com tampas de tira ou fita selos, carregar a máquina e executar Sanger sequenciamento. A placa de sequenciamento é geralmente um 96 poços, v-bottom, placa PCR cheio-saia compatível com o sequencer. As placas podem ser barcoded dependendo se o sequenciamento é para ser realizado internamente, em uma empresa comercial ou em uma centro acadêmico sequenciamento/plataforma.
3. Após o sequenciamento, 'costure' as 2 leituras geradas a partir as etapas individuais de sequenciamento para formar uma completa IGHV gene rearranjo ou seja, a sequência de consenso.

6. sequência de análise

Nota: Os seguintes seções focam a saída obtida do IMGT/V-QUEST ferramenta³⁰ quando analisando reorganizados sequências de IG e IMGT/JunctionAnalysis³¹, ambos dos quais são particularmente relevantes para a investigação e relatórios clínicos estudos. IMGT/V-QUEST é uma ferramenta de alinhamento que compara o usuário enviado sequências de IG com o diretório de referência IMGT define³⁰. A saída da ferramenta inclui várias seções dentro do qual o usuário pode definir certos parâmetros.

1. Especifica a espécie, por exemplo, Homo sapiens (humano) e tipo de receptor ou locus (por exemplo, CMI, IGK ou IGL).
2. Colar sequências a analisar, no formato FASTA e incluindo cabeçalhos, para a área de texto (em lotes de até 50 sequências por execução). Como alternativa, uma opção para digitar o caminho para um arquivo local que contém as sequências FASTA é fornecida.
3. Escolha dentre as seguintes opções de exibição de 3 para os resultados:
   1. Detalhada ver: escolha esta opção para obter os resultados para cada sequência individualmente.
   2. Visão de síntese: escolha esta opção para compilar um quadro-resumo ordenado por nome de gene e alelo IGHV ou por ordem de entrada de sequência. Esta opção fornece também um alinhamento de sequências que, em qualquer lote enviado, são atribuídos aos mesmos genes IGHV e alelo.
   3. Arquivo do Excel: escolha esta opção para fornecer todos os arquivos de saída, como planilhas, incorporadas em um único arquivo. Todas as opções de visualização tem uma grande seleção de parâmetros básicos e avançados para escolher, no entanto apenas os fatores mais relevantes para análise de sequências de CLL IG são discutidos abaixo na seção de 'Resultados de representante'.

7. detenção/AssignSubsets ferramenta

1. Para investigar a estereotipia BcR IG dentro CLL (detalhes adicionais fornecidos abaixo na seção 'Representante resulta'), envie sequências de FASTA IGHV-Digha-IGHJ para a ferramenta de detenção/AssignSubsets³². A ferramenta relata que a atribuição para grande CLL estereotipados subconjuntos. A ferramenta de subconjunto-atribuição junto com instruções detalhadas estão disponíveis no site detenção/AssignSubset³² e também no site do ERIC sob a guia de serviços.

Resultados

Exemplos fornecidos abaixo ilustram os resultados obtidos através da seguinte análise sequenciamento do gene IG os passos detalhados acima. Embora a extração de DNA ou RNA são procedimentos de rotina para a maioria dos laboratórios clínicos/investigação, um primeiro passo crítico envolve verificar a qualidade/quantidade de gDNA e/ou RNA usando um espectrofotômetro ou outras tecnologias apropriadas de alta sensibilidade. O próximo passo crucial envolve a amplificação por PCR do rearranjo de genes IGHV-Digha-IGHJ clonotypic. Como mencionado acima, apenas o uso de primers de líder IGHV permite que a amplificação de todo o comprimento da sequência rearranjada de gene IGHV, permitindo assim a verdadeira carga SHM a determinar; Portanto, as primeiras demão do IGHV líder são a escolha de cartilha recomendada (Figura 2). Em raros casos, onde as primeiras demão do IGHV líder não podem amplificar o rearranjo de IG de clonotypic, IGHV FR1 iniciadores podem ser utilizados. Como evidenciado na Figura 3, vários produtos PCR/bandas podem ser observadas, especialmente quando gDNA é matéria-prima; essas bandas devem ser extirpadas e sequenciado em separado. Se tanto IGHV FR1 primers e líder IGHV não produzir resultados, a análise deve ser repetida usando uma nova amostra do paciente (quando possível). O último ponto de verificação antes da sequenciação é determinar o clonality da amostra usando análise de fragmento (Figura 4).

Sequências obtidas devem ser analisadas utilizando a ferramenta IMGT/V-QUEST³⁰. Parâmetros selecionados pelo usuário incluem espécies, tipo de receptor ou locus, busca de inserção e a opção de exclusão, etc. e são listados juntamente com o número de sequências analisadas. Cada sequência FASTA é exibida e o V-domínio analisado por IMGT/V-QUEST é realçado em verde. Além disso, se a sequência de entrada foi na orientação oposta (antisentido), o programa automaticamente fornece a sequência inversa complementar e afirma isto acima a sequência FASTA.

O resultado Sumário é fornecido diretamente abaixo a sequência FASTA, no topo da 'visão detalhada' página de resultados e contém informações importantes para o clínico relatórios de análise de sequências de genes de IG em CLL. Cada linha da tabela é explicada abaixo.

Resumo resultado. A primeira linha da tabela de resultados afirma a funcionalidade da sequência de entrada: uma sequência de IG reorganizado pode ser produtiva ou improdutiva (Figura 5A e 5B). Um rearranjo de gene de IG é improdutivo se parar códons estão presentes dentro do V-D-J-regional (VH) ou dentro do V-J-regional (VL) e/ou se o rearranjo é fora-de-quadro devido a inserções/exclusões. Uma terceira saída é fornecido quando a funcionalidade não pode ser determinada, ou seja, se a junção IGHV-Digha-IGHJ não pôde ser identificada; nesta instância, lia-se o resumo do resultado como 'Sem rearranjo encontrado' ou 'Sem junção encontrado'. É importante notar que apenas produtivo e, assim, rearranjos funcionais devem ser analisados ainda mais. Se a sola amplificado rearranjo do IG não é funcional (improdutivas ou 'nenhuma reorganização encontrado'), o processo de amplificação do PCR deve ser repetido. Se o resultado permanece negativo deve ser obtida uma nova amostra do paciente.

V-GENE e alelo. A linha 'V-GENE e alelo' indica o gene IGHV germline mais próximo e o alelo com sua pontuação do alinhamento e a identidade por cento. Se vários genes e alelos dar a mesma pontuação alta, todos serão listados. A identidade por cento entre a sequência apresentada e o mais próximo IGHV gene e alelo é de particular importância, uma vez que ele determina o status SHM. Esse valor é calculado a partir o primeiro nucleotídeo da região-V à extremidade 3' da região-V excluindo o CDR3. Se FR1 IGHV primers são usados, a sequência correspondente da primeira demão deve ser sempre removida para garantir tão fiel um resultado possível. Note-se que uma percentagem baixa de identidade (< 85%) pode resultar de uma inserção ou exclusão (discutido mais abaixo) e, se este for o caso uma nota de 'Aviso' aparecerá na linha 'Resumo do resultado' para alertar o usuário.

J-GENE e alelo. Conforme descrito para o V-gene e alelo acima, a linha 'J-GENE e alelo' indica o gene IGHJ mais próximo da linha germinal e um alelo com sua pontuação do alinhamento e a identidade por cento. No entanto, como o gene IGHJ é bastante curto, e sua extremidade 5' pode ter sido cortada devido a atividade do exonuclease, escolhas alternativas também são pesquisadas pela ferramenta, com base no maior número de nucleotídeos idênticos consecutivos.

D-GENE e alelo por IMGT/JunctionAnalysis. O tinha-o GENE e o alelo por IMGT/JunctionAnalysis' indica o mais próximo da linha germinal Digha gene e alelo com o quadro de leitura D-região identificado pela ferramenta na sequência de usuário. IMGT/JunctionAnalysis³¹ fornece uma análise detalhada e precisa da junção e foi integrada a interface da ferramenta IMGT/V-QUEST. Esta ferramenta gerencia todos os aspectos da dificuldade ligada à Digha gene e alelo identificação ou seja, (i) o comprimento curto da região-D; (ii) a utilização de 2 ou mesmo 3 ler frames; III aparamento do exonuclease em ambas as extremidades do gene; e, (iv) a presença de mutações.

FR-IMGT comprimentos, comprimentos de CDR-IMGT e junção AA. Esta linha fornece o comprimento do IGHV FRs e CDRs mostrado dentro de parênteses e separados por pontos e a junção de aminoácidos (AA). A sequência de AA da junção ilustra (i) um rearranjo em ou fora-de-quadro (posições fora-de-quadro são indicadas pelo símbolo '#'), (ii) a presença ou ausência de códons de parada (um códon de parada é mostrado por um asterisco ' *') e (iii) a presença ou ausência do âncoras do VH CDR3-IMGT: C (2º-CYS 104) e W (J-TRP. 118).

Hypermutations somáticas predominantemente consistem em alterações de nucleotídeo único, no entanto, pequenas inserções e deleções na região-V podem ser observadas, embora em uma grande frequência inferior³³. Quando usando os parâmetros de padrão IMGT/V-QUEST, inserções e exclusões não são automaticamente detectados; no entanto, fortes indícios de que uma sequência pode efectuar tais alterações, ou seja, uma baixa porcentagem identidade e/ou comprimentos diferentes do IGHV CDR1-IMGT e CDR2-IMGT entre a sequência de usuário enviado mais próximo germline gene e alelo, são detectados pelo ferramenta e uma alerta de aviso é exibida abaixo da tabela de Resumo de resultados (Figura 5).

IMGT fornece uma opção chamada 'Pesquisar por inserções e exclusões' na seção 'Parâmetros avançados' localizada abaixo da seção de 'Resultados de exibição'. Em casos onde aparecem avisos relevantes, é aconselhável utilizar esta funcionalidade. Quando são detectadas inserções e exclusões, detalhes abrangentes da constatação são fornecidos na seção 'Resultado Resumo' incluindo (i) onde a inserção ou exclusão é localizada ou seja, VH FR-IMGT ou CDR-IMGT; (ii) o número de nucleotídeos inseridas/suprimidas; (iii) a sequência (somente para inserções); (iv) se um frameshift ocorreu; (v) o codão V-região da qual a inserção ou exclusão começa; e (vi) a posição do nucleotídeo afetados no enviado sequência (Figura 5). Para inserções, a ferramenta remove o insertion(s) da sequência de usuário enviado e então re-analisa a sequência usando os parâmetros padrão de IMGT/V-QUEST. Se as exclusões forem detectadas, a ferramenta adiciona lacunas, representadas por pontos, para substituir os nucleotídeos excluídos antes de repetir a análise.

Quanto a todos os testes de diagnóstico ou prognóstico realizado em laboratórios clínicos, rigorosos e um elevado nível de reprodutibilidade são de extrema importância. A saída IMGT/V-QUEST fornece muitas das informações necessárias para relatar os resultados da análise de sequências de genes de IG na CLL, ou seja, (i) o IGHV, Digha e IGHJ de genes e alelos utilizados; (ii) a funcionalidade do clonotypic IGHV-Digha-IGHJ gene rearranjo ou seja, se o rearranjo é produtivo ou improdutivo; e o (iii) a identidade por cento do rearranjada IGHV gene e o alelo em comparação com o seu mais próximo da linha germinal IGHV gene e alelo. Para informações completas sobre o relato clínico de genes de IG em CLL, a interpretação da problemática ou tecnicamente desafiadores casos e recomendações para a determinação da precisa e solidez carácter IGHV gene SHM em CLL, o leitor é dirigido a recentemente atualizado ERIC diretrizes e relatórios^27,34.

Finalmente, devido a nosso conhecimento crescente sobre estereotipia BcR IG em CLL, um requisito adicional recomendado para o relato clínico de rearranjos do gene IG em CLL diz respeito à atribuição dos processos para subconjuntos major estereotipado. Agora recomenda-se o estado do relatório clínico se o rearranjo de genes IGHV produtivo analisado pode ser atribuído a um dos principais subconjuntos estereotipados, ou seja subconjuntos 1 #, 2 #, 4 # ou #8^12,27. Atribuição de grandes subconjuntos CLL estereotipado deve ser realizada com o uso da ferramenta (Figura 6) detenção/AssignSubsets³².

5' primeiras demão IGHV FR1	Sequência da primeira demão		Quantidade para 60 μL de mistura de cartilha
IGHV1	CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG		10
IGHV2	CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG		10
IGHV3	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG		10
IGHV4	CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG		10
IGHV5	GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC		10
IGHV6	CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG		10
5' IGHV líder primeiras demão
IGHV1L	AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG		5
IGHV1bL	AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A)		5
IGHV2aL	AC AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (A/C)		5
IGHV2bL	AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC		5
IGHV3aL	AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC		5
IGHV3bL	AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (A/C/T) GC		5
IGHV4L	AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT		10
IGHV5L	AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC		10
IGHV6L	AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC		10
3' primers IGHJ
IGHJ1-2	TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC		20
IGHJ3	TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC		10
IGHJ4-5	TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC		20
IGHJ6	TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC		10

Tabela 1. Sequências da primeira demão e quantidades para a amplificação por PCR do rearranjo de genes IGHV-Digha-IGHJ clonotypic.

Reagente	Volume (μL)
RB x 10 tampão	5
MgCl2 (50 mM)	3
dNTPs (mΜ 10)	2
Mistura de líder/FR1 cartilha IGHV (10 μM)	3
Cartilha IGHJ mix (10 μM)	3
H2O	31.5
Volume total	47,5

Tabela 2. Reagentes para a amplificação por PCR do rearranjo de genes IGHV-Digha-IGHJ clonotypic.

Temperatura	Duração	Número do ciclo	Descrição
94 ° C	5 minutos	1	ativação do polymerase
94 ° C	1 minuto	39	desnaturação
59 ° C	1 minuto		recozimento
72 ° C	1,5 minutos		extensão
72 ° C	10 minutos	1	extensão final
18 ° C	∞	1	preservação

Tabela 3. Condições térmicas de ciclismo para a amplificação por PCR do rearranjo de genes IGHV-Digha-IGHJ clonotypic.

Temperatura	Duração	Número do ciclo	Descrição
94 ° C	5 minutos	1	ativação do polymerase
96 ° C	20 segundos	30	desnaturação
50 ° C	20 segundos		recozimento
60 ° C	4 minutos		extensão
4 ° C	∞	1	preservação

Tabela 4. Condições térmicas de ciclismo para a reação de sequenciamento do gene de IG.

Figura 1. Representação esquemática de um rearranjo de gene IGHV-Digha-IGHJ com vários primer recozimento locais indicados. 5' IGHV as primeiras demão recozem a sequência líder que está localizado o montante da sequência de codificação IGHV. 5' IGHV quadro (FR) as primeiras demão recozem para o início da região FR1, que está localizado dentro do gene IGHV rearranjado, Considerando que as 3' IGHJ primeiras demão recozem à extremidade do gene IGHJ rearranjada. UTR: região untranslated. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Amplificação por PCR do rearranjo de gene de IGHV-Digha-IGHJ em 7 amostras de pacientes usando 5' IGHV líder primeiras demão. A oitava faixa representa um controlo positivo, Considerando que o controlo negativo para a PCR foi carregado para a nona faixa. O produto esperado da PCR é aproximadamente 500 pares de bases quando usando as primeiras demão do IGHV líder. O asterisco na última coluna do gel indica a escada de DNA bp 100. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Amplificação por PCR do rearranjo de gene de IGHV-Digha-IGHJ em 13 amostras de pacientes, usando as primeiras demão IGHV FR1. A décima quarta faixa contém o controlo positivo enquanto o controlo negativo foi carregado para a décima quinta faixa. Como evidenciado na pista 2, para o qual o DNA foi matérias-primas, várias bandas PCR são observadas, que deve ser extirpado e sequenciado em separado. Amostras em faixas 5, 7 e 13 resultados policlonais (evidenciado pela mancha no gel) e, assim, a etapa PCR deve ser repetida. Se um segundo PCR falhar amplificar o IG rearranjado genes a análise devem ser realizada em uma amostra de Nova (se possível) ou usar um primer diferente definido. O produto esperado da PCR é aproximadamente 350 pares de bases ao usar misturas de cartilha IGHV FR1. O asterisco na última coluna do gel indica a escada de DNA bp 100. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Avaliação de clonality usando análise genescan. Na análise de genescan, produtos PCR monoclonais dão origem a um pico dominante de produtos fluorescentes de tamanho idêntico (painel superior), Considerando que os produtos de PCR polyclonal resultam em uma distribuição normal mais de tamanhos do produto (painel inferior). Os traços vermelhos são picos de uma escada de DNA fluorescente-etiquetadas que é carregado na mesma injeção capilar como a amostra a ser analisada. Os fragmentos de tamanho padrão estão sujeitos à mesma força eletroforética que a amostra e, portanto, estão expostos às mesmas condições da injeção. O espaçamento uniforme dos fragmentos tamanho padrão confirma vocação de tamanho preciso. Os traços azuis representam o anticorpo monoclonal (painel superior) ou policlonais natureza (painel inferior) das amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Exemplos de tabelas de resumo o resultado fornecidos pelo IMGT/V-QUEST. (A) tabela Resumo de resultados para um rearranjo de gene produtiva IGHV-Digha-IGHJ (codon(s) sem parar e uma junção de sequência em-frame). O V-GENE alelo e o J-GENE e alelo identificado na sequência de usuário por IMGT/V-QUEST neste caso são IGHV4 - 34 * 01 e IGHJ6 * 02 (com base na avaliação de Pontuação de alinhamento mais alta). A identidade por cento é 99,65% devido a uma única mutação somática. O D-GENE e alelo identificado por IMGT/JunctionAnalysis é o IGHD3 - 3 * 01 na leitura do quadro 1. Os comprimentos das regiões no 4 quadro (FRs), bem como as 3 regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são indicados entre parênteses. A sequência de aminoácidos (AA) da junção IGHV-D-J também é fornecida. Neste exemplo, a junção composta por 22 AAs. (B) tabela Resumo de resultados para uma sequência de rearranjo de gene de IGHV-Digha-IGHJ que é improdutiva devido a uma junção de fora-de-quadro. Um X para o comprimento CDR3-IMGT indica que para essa sequência o comprimento não pode ser determinado. Os sinais de '#' observados na sequência de junção AA indicam um frameshift. (C) resultado tabela Resumo aviso de identidade V-região baixa (60.94%) e indica que a opção 'inserções e exclusões' na seção 'Parâmetros avançados' deve ser usada. (D) resultado quadro-resumo para o caso do germline baixa porcentagem identidade ilustrado em (C) após a repetição da análise de sequência usando a opção 'Pesquisar por inserções e exclusões'. A porcentagem de identidade correto é exibida entre parênteses e é calculada considerando a inserção como um único evento mutacional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Tabela de subconjunto atribuição de relatório gerada pela ferramenta de detenção/AssignSubsets. As sequências de FASTA IG de 10 pacientes CLL (A1-A10) foram apresentadas para a ferramenta de captura/AssignSubsets. Caso A4 foi atribuído a subconjunto CLL estereotipado #2 (pacientes dentro deste grupo são conhecidos por terem um mau prognóstico, independentemente da carga SHM) com alta confiança. Sete de outras casos/sequências não foram atribuídos a um grande subconjunto estereotipado e, portanto, classificada como não atribuído. Duas das sequências apresentadas (A7 e A8) não podiam ser utilizadas para atribuição de subconjunto e em vez disso foram classificadas como ignorados/insalubre devido a problemas com a sequência, ou seja, devido a uma fora-de-quadro junção ou a presença de códons de parada. Uma explicação abrangente sobre os títulos de tabela e a ferramenta está disponível no site detenção/AssignSubsets³². Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O estudo de genes de IG em CLL tem sido vital não apenas para fornecer uma melhor compreensão em Patobiológico de doença, mas também para melhorar a estratificação de risco do paciente. Portanto, é fundamental que o processo de várias etapa de análise de sequências de genes de IG e posterior interpretação dos dados de sequência são executadas de forma padronizada. A disponibilidade de material paciente adequada e suficiente e o tempo de amostragem não devem impacto sobre a capacidade de realizar análise mutacional do gene IG, desde que o teste pode ser efectuado em PB e qualquer amostra com uma alta contagem de células de tumor CLL. A separação das células mononucleares de sangue usando métodos de separação de gradiente é realizada de rotina em laboratórios de diagnóstico, e como sempre, tenha cuidado ao adicionar a solução de sangue/RPMI ao tubo contendo o gradiente; Esta tarefa deve ser executada de forma lenta, suave, para evitar perturbar o gradiente e prevenir a perda de células.

Após a separação da pilha, os ácidos nucleicos são extraídos. Ambos gDNA e cDNA são adequados para análise SHM do rearranjo de CMI de clonotypic, no entanto, existem vantagens e desvantagens para o uso de qualquer material. O fluxo de trabalho do laboratório procede mais rápido quando usando gDNA desde a transcrição reversa não tem de ser realizada antes da amplificação por PCR. Dito isso, usando gDNA como substrato para o PCR pode resultar na amplificação de rearranjos produtivos e improdutivos, que, por sua vez, pode levar ao trabalho de laboratório prático adicional, ou seja, purificação ou gel de excisão de múltiplos produtos PCR e sequenciação individual de todos os rearranjos. Ao comparar as abordagens gDNA e cDNA, para o último passo uma transcrição reversa deve ser realizado antes de prosseguir com a amplificação por PCR. No entanto, neste caso, para a maioria dos casos, apenas produtivos rearranjos de IG serão amplificados e posteriormente sequenciados. Assim, apenas um único produto PCR será purificado e sequenciado, enquanto a interpretação de resultados é mais simples.

A eficiência de amplificação depende em grande medida da qualidade do gDNA/cDNA, que devem ser avaliado usando um método de quantificação sensível e os primers utilizados. Os primers utilizados são essenciais para todo o procedimento analítico, porque a determinação exata do nível SHM só pode ser alcançada amplificando toda a sequência do gene IGHV rearranjada. Um rearranjo completo só pode ser avaliado se 5' IGHV líder primeiras demão são utilizadas, justificando as recentes recomendações por ERIC para o uso do líder cartilhas²⁷. O uso de primers alternativos, levando para a amplificação de rearranjos de genes IGHV-Digha-IGHJ incompletos, não é apropriado para análise mutacional do gene IGHV e, portanto, recomenda-se contra. A única excepção diz respeito a casos que repetidamente produzem resultados negativos quando são usadas as primeiras demão do IGHV líder e análise de material novo paciente é ou não possível ou também faz não deu resultado. Se usar uma amostra diferente do paciente e/ou material (gDNA/cDNA) e vários iniciadores define ainda falham para produzir um produto PCR, possíveis razões podem ser que a carga de células de tumor é muito baixa ou que linfocitose não é devido a um clone do CLL (caso em que o imunofenótipo deve ser reavaliado). Primers utilizados para a análise devem sempre ser indicados no relatório clínico.

Como CLL resulta da acumulação de anticorpo monoclonal de células B rolamento o rearranjo de genes IGHV-Digha-IGHJ mesmo, para a grande maioria dos clonality casos avaliação irá revelar um único pico monoclonal, ou seja, um único clone. Em raras ocasiões, dobro rearranjos ou mesmo oligoclonais padrões podem ser observados³⁵. Em tais casos, electroforese do gel não é a técnica preferida para avaliação clonality e métodos mais sensíveis, tais como análise de fragmento devem ser aplicados. Uma vez clonality tenha sido confirmada, a etapa final antes da sequenciação refere-se para a purificação do produto do PCR para garantir que as sequências de alta qualidade são obtidas. Finalmente, a ferramenta IMGT/V-QUEST é o recurso recomendado para análise de sequências de IG pelo ERIC. Como os bancos de dados IMGT são constantemente atualizados e relatam resultados de uma forma bem anotada e consistente, essa ferramenta garante análise padronizada e facilita a análise comparativa entre diferentes instalações de clínicas ou acadêmicas.

Como análise Imunogenética em CLL tem prognóstico e, em particular, implicações preditivas, análise robusta do rearranjo de gene de IGHV-Digha-IGHJ incluindo a atribuição para grande CLL estereotipados subconjuntos, já não é apenas desejável, mas de importância fundamental. Isto é particularmente evidente na era da novela terapêutica e o potencial que o IG gene análise deve guiar o tratamento decisões^{5,21,22,23,36,37 ,38}, como oficialmente indicado pela recente atualização das orientações NCI-patrocinado do Workshop Internacional sobre CLL²⁴. Que disse, rigorosos padrões são garantidos, especialmente conforme determinação do estatuto do clonotypic SHM reorganizados gene IGHV em pacientes CLL não é uma questão trivial e envolve um processo de várias etapa. Importante, determinadas etapas experimentais, mais notavelmente a escolha de primers, produzir resultados superiores quando específicos de opções e/ou abordagens são seguidos, outros aspectos técnicos são receptivos a algum grau de flexibilidade, como a seleção de materiais ou a método de avaliação clonality, devido ao fato de que eles levar a diferenças sutis, se houver, no que respeita aos resultados definitivos.

Na última década, ERIC tem se esforçado para promover a padronização e harmonização dos vários métodos pertinentes para CLL diagnóstico e prognóstico. Isso se reflete no publicado recomendações e diretrizes para análise Imunogenética^27,34, numerosos organizadas oficinas educativas e eventos, o estabelecimento de uma rede de IG, bem como um fórum on-line especializado para discutir e fornecer orientação na interpretação de sequência de gene de IG na CLL. O objectivo geral do ERIC através dessas ações é promover melhor manejo clínico e tratamento do paciente. Apesar de intensos esforços, esta tarefa está longe de ser completa e de fato tornou-se mais complexa devido ao desenvolvimento do romance sequenciamento de alto rendimento visto a criação de perfil imune. No entanto, apesar de desafios persistem, esforços intensivos para a padronização robusto de análise do gene de IG em CLL continuam e atualmente são o foco das actividades em curso no âmbito de ERIC.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de coleta de sangue de plástico BD Vacutainer com K2EDTA: Rolha de tubo	ThermoFisher scientific	02-689-4	armazenamento de material
Tubo de preparação de células mononucleares BD Vacutainer CPT - heparina de sódio	Becton Dickinson	armazenamento de material 362753
Tubos de coleta de sangue de heparina BD Vacutainer FAQ	Daigger Scientific	366480	armazenamento de material
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575038	processamento de células
Tubos de centrífuga 15 mL CS500	Corning	352096	processamento de células
Tubos de centrífuga PP 50 mL CS500	Corning	352070	processamento de células
RPMI Medium 1640 (1X) líquido	Invitrogen	21875-091	processamento de células
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL	STEMCELL Technologies	17-1440-02	de processamento celular
5 mL	Sarstedt	861.253.001
pipetas sorológicas de processamento celular 10 mL	Sarstedt	861.254.001	pipetas sorológicas de processamento celular
25 mL	Sarstedt	861.685.001	processamento celular
salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) (1X)	Invitrogen	14190250	processamento celular
Placa Neubauer	Marienfeld-Superior	640010	processamento celular
Solução Tuerk	Sigma-Aldrich	93770	processamento celular
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K1820-01	Extração de DNA
QIAamp RNA Blood Mini Kit	Qiagen	52304	Extração de RNA
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204	Extração de DNA/RNA
5X tampão de primeira fita	Invitrogen	P/N Y02321	síntese de cDNA
Primers Aleatórios, 20 µ g	Promega	C1181	síntese de cDNA
RNaseOUT& comércio; Inibidor de ribonuclease recombinante	Invitrogen	10777019	síntese de cDNA
DTT	Invitrogen	P/N Y00147	síntese de cDNA
SuperScript II Transcriptase reversa	Invitrogen	18064-014	síntese de cDNA
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	18427013	síntese de cDNA, PCR
PCR Buffer	Invitrogen	O00065	PCR
MgCl2 (cloreto de magnésio) (25 mM)	ThermoFisher scientific	AB0359	PCR
Taq DNA Polymerase, recombinante	Invitrogen	10342-020	PCR
Applied Biosystems 5′ Primers Rotulados	ThermoFisher		scientific-PCR/Avaliação de clonalidade
Kit de DNA de alta sensibilidade Agilent	Technologies	5067-4626	Quantificação de produtos de PCR
Tampão TBE UltraPure,	eletroforese em gel	de 15581044	científica ThermoFisher
Brometo de Etídio UltraPure, gel	de 15585011	científico ThermoFisher	eletroforese
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher scientific	S33102	eletroforese em gel
10X BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	16500100	eletroforese em gel
Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE pronto para uso	Geneon	305-105	gel eletroforese
UltraPure Agarose	ThermoFisher gel de	16500500	eletroforese
Agarose baixa temperatura de gelificação	Sigma-Aldrich	A9414-250G	eletroforese em gel
Novex TBE Géis, 10%, 10 poços	ThermoFisher científico	EC6275BOX	eletroforese em gel
ExoSAP-IT PCR Reagente de limpeza do produto	ThermoFisher scientific	78201.1.mL	PCR limpeza do produto
QIAquick Kit de extração de gel (50)	Qiagen	28704	Limpeza de produtos de PCR
GenomeLab DTCS Quick Start Kit	Beckman Coulter	608120	Sequenciamento de Sanger
Solução de acetato de sódio (3 M), pH 5.2	ThermoFisher científico	R1181	Sequenciamento de Sanger
Glicogênio, grau de biologia molecular	ThermoFisher científico	R0561	Sequenciamento de Sanger
Etanol absoluto	EMD Millipore	1024282500	Sequenciamento de Sanger
Tubo SafeSeal 1,5 mL	Sarstedt	72.706	uso geral
Copo Multiply-Pro 0,2 mL, PP	Sarstedt	72.737.002	uso geral
Equipamento de centrífuga
Equipamento de máquina
Bioanalisador	Equipamento Agilent Technologies